用于乳头状瘤病毒的多核苷酸疫苗的制作方法

专利名称：用于乳头状瘤病毒的多核苷酸疫苗的制作方法
相关的其它申请这是1994年6月30日提交的，现正在决定中的U.S.S.N.08/268.424的部分继续。发明领域本发明涉及新的药物产品的生产和使用一种核酸，当它被直接导入活的脊椎动物组织中时，可诱导一种特异性识别乳头状瘤病毒的免疫反应。发明背景乳头状瘤病毒(PV)感染可在包括人，绵羊，狗，猫，兔，猴，蛇和牛的各种动物中发生。乳头状瘤病毒感染上皮细胞，一般地在感染部位诱发良性的上皮或纤维上皮瘤。乳头状瘤病毒是种属特异性的感染原，例如，人乳头状瘤病毒一般不感染人以外的动物。
依据它们感染的宿主，可将乳头状瘤病毒划分为不同的组。根据DNA序列的同种性可进一步将人乳头状瘤病毒(HPV)划分为超过60种类型(综述，参见乳头状瘤病毒和人类癌症，H.Pfister(ed.)，CRC Press，Inc.，1990)。乳头状瘤病毒感染可诱导类型特异性的免疫原性反应，其中针对一种类型的乳头状瘤病毒的感染的中和免疫不会赋于对另一种类型的乳头状瘤病毒的免疫。
人不同类型的HPV引起不同的疾病。HPV类型1，2，3，4，7，10和26-29在正常和免疫损伤个体中都引起良性疣。HPV类型5，8，9，12，14，15，17，19-25，36和46-50在免疫损伤个体中引起扁平(flat)疣损害。HPV类型6，11，34，39，41-44和51-55引起非恶性的生殖道湿疣。HPV类型16和18引起生殖道上皮发育不良并且与大多数的原位和侵袭性的子宫颈癌，阴道癌，外阴和肛管癌相关。
动物系统中的免疫学研究证明针对乳头状瘤病毒抗原的中和抗体的产生可抑制同源病毒的感染。由于不能在体外培养乳头状瘤病毒而使有效的人乳头状瘤病毒疫苗的进展缓慢。尤其是由于缺少合适的用于直接研究HPV的动物宿主而使有效的HPV疫苗进展缓慢。
抗体对乳头状瘤病毒的中和是类型特异性的并且依赖于病毒表面组成性的表位。
乳头状瘤病毒是小的(50-60nm)，非包被的，二十面体DNA病毒，它编码早期和晚期基因。病毒基因组的开放读码框(ORF)被称为E1到E7和L1到L2，其中“E”指早期而“L”指晚期。L1和L2编码病毒壳体蛋白。E1～E3和E5～E7与病毒复制和转化功能相关。
L1蛋白是主要的含壳蛋白，分子量为55-60K。L2蛋白是次要的含壳蛋白，它预期的分子量约是55K而聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量是75～100K。电子显微镜和免疫学数据提示大多数L2蛋白位于L1蛋白的内部。L2蛋白在不同的乳头状瘤病毒中是高度保守的，特别是C末端的10个碱性氨基酸。在不同的乳头状瘤病毒中L1ORF是高度保守的。
L1和L2基因己被用于产生可有效用于预防以及治疗乳头状瘤病毒感染的重组蛋白质。Zhou等将HPV类型16的L1和L2基因克隆入痘苗病毒载体并用重组载体感染CV-1哺乳动物细胞以产生病毒样(Virus-like)颗粒(VLP)。这些研究表明HPV类型16L1和L2蛋白在上皮细胞中的表达对VLP的装配是必需的也是充分的。L1蛋白单独表达或L2蛋白单独表达或者用含L1和L2基因的单个重组痘苗病毒载体两次感染细胞都不能产生颗粒。
细菌来源的重组牛乳头状瘤病毒L1和L2已有生产。针对重组细菌蛋白的中和血清与天然病毒有低水平的交叉反应，主要是因为天然和细菌来源的蛋白在构型上不同。
已用表达HPV16L1或HPV16L2ORF的重组杆状病毒感染昆虫SF9细胞并且产生了重组的L1和L2蛋白。Western印迹分析表明杆状病毒来源的L1和L2蛋白与抗HPV16的抗体反应。也已证明可用重组啤酒糖酵母菌株生产HPV16L1和HPV16L2蛋白。
因为细胞毒T淋巴细胞(CTL)在小鼠和人中都能识别来源自保守的内部病毒蛋白的表位并且被认为对针对病毒的反应是重要的，因此努力开发对不同病毒株可提供异种保护的CTL疫苗。
已知当其T细胞受体识别了与MHCI类分子相关的病毒多肽时，CD8+CTL即可杀死病毒感染的细胞。这些多肽源自内源合成的病毒性蛋白质，而不管这些蛋白质在病毒内的定位或功能如何。因此，CTL通过识别保守的病毒性蛋白质的表位来提供毒株间的交叉保护作用。当MHCI类分子相关而被CTL识别的多肽源自那些位于或穿过细胞质或内质网的蛋白质。因此，一般说来，进入内体(endosomal)处理过程的外源蛋白(如MHCII类分子呈递的抗原的事情)，不能有效引起CD8+CTL反应。
产生CTL反应的努力包括用复制载体在细胞内产生蛋白质抗原或者曾致力于将肽导入胞质溶胶中。这两种方法都有局限性而减少了其作为疫苗的实用性。逆转录病毒载体对能做为融合蛋白表达但同时又要保持重组病毒复制能力的多肽的大小和结构有限制，并且载体如痘苗在接下来的免疫反应中的效率可能会受到针对载体本身的免疫反应的损害。另外，病毒性载体和修饰的致病原有其固有的危险性而限制了其在人中的应用。而且，对呈递的肽表位的选择依赖于个体MHC抗原的结构，因此，肽疫苗由于其在杂交繁殖的群体中的MHC单元型的多样性而只有有限的效率。
已经证明，在肌肉内接种多核苷酸构建体，即编码蛋白质的DNA质粒，可在原位的肌肉细胞中产生蛋白质。通过使用编码病毒蛋白质的cDNA质粒，可提供抗后继攻击的同种保护作用的抗体反应即可发生。使用多核苷酸疫苗(PNV)产生抗体可导致抗体反应持续时间的增加并可提供具有适当的翻译后修饰及天然蛋白质构象(相对重组蛋白质)的一种抗原。在PNV免疫后在体内产生的病毒蛋白质可以采取其天然构象形式，因而引起病毒中和抗体的产生。用这种方式产生CTL反应的优点是不使用活的潜在的致病原载体或减毒病毒即可提供对交叉株的保护作用。
Benvenisty等报道通过腹膜内，静脉内或肌内导入小鼠中的CaCl2沉淀的DNA可被表达。最近，有人报道在小鼠中肌内(i.m.)注射DNA表达载体，结果是肌肉细胞吸收DNA并表达DNA所编码的蛋白质(J.A.Wolff等，1990；G.Ascadi等，1991)。已证明所注射的质粒被保持在染色体外并且是不复制的。随后在大鼠，鱼和灵长目的骨骼肌和大鼠的心肌中肌内注射之后的持续表达即有报道。用核酸作为免疫原的技术在WO90/11092(1990年10月4日)中有报道，其中裸露的多核苷酸被用于免疫脊椎动物。
该方法并不限于肌内注射。例如，将用编码牛生长激素(BGH)的DNA包被的金微粒导入小鼠的皮肤，结果在小鼠中产生抗BGH抗体。一种喷射注射器(jet)已被用于转染活动物的皮肤，肌肉，脂肪和乳房组织。Donnelly，Ulmer和Liu等对各种核酸的导入方法做了综述(Imnunologist，220，1994)。
本发明研究多种将核酸导入活组织中以诱导蛋白质表达的方法。本发明提供了将病毒蛋白质导入抗原处理途径以产生病毒特异性CTL和抗体的方法。因此，本发明满足了对能引起抗病毒性致病原乳头状瘤病毒的所预期的预防性免疫反应的特异性治疗剂的需要。因此，本发明提供了编码人乳头状瘤病毒的病毒蛋白质的DNA构建体，它可编码诱导特异性的CTL和抗体。
针对后继的病毒攻击的DNA疫苗接种的保护效率已用编码一个或多个上述病毒蛋白质的非复制的质粒DNA的免疫接种进行了证实。该方法有其优点是因为不需要感染原，不需要病毒颗粒的装配，并可进行决定簇的筛选。而且，因为在各种类型的乳头状瘤病毒中一些基因产物的序列是保守的，针对与获得克隆基因的毒株同种或异种的不同类型的乳头状瘤病毒之随后攻击的保护是可行的。发明概述编码乳头状瘤病毒基因产物的能在被直接导入动物组织中时表达的DNA构建体，是能提供抗乳头状瘤病毒感染的免疫保护作用的新的预防性和治疗性药物。附图简述

图1，表示在注射有CRPVL1DNA或L1和L2DNA混合物(y轴)的兔中诱导的病毒中和抗体的反应，以及诱导上述兔产生的相应的ELISA效价。
图2，注射L1DNA的兔的抗体反应，用给定的任意的选择剂量1mgL1DNA单次免疫接种的兔抗L1VLP的ELISA效价被示出。注射对照DNA的兔没有产生可检测的抗L1VLP抗体。
图3，L1VLP对用L1DNA免疫接种得到的抗血清的吸收作用。A，正常血清，和用如(15)中天然或变性VLP吸收的免疫血清的病毒中和活性被测试。在攻击后7周所测的3个攻击位点的湿疣的平均面积，被示出。B，来自注射L1DNA的兔的免疫血清被天然(圆圈)或变性(方块)的表达于重组酵母(啤酒糖酵母)菌株的L1VLP连续吸收三次。在每次连续吸收之后，用ELISA测定等份血清抗杆状病毒来源的L1VLP的抗体活性。用被吸收物质的ELISA效价对未吸收血清的最初ELISA效价的百分比做图。
图4，测定抗CRPVE2(A)和CRPVE7(b)抗体的ELISA反应。净反应速率(免疫接种4次后的速率减去同样稀释度的免疫接种前的速率)，对每个兔个体来说以mOD/分钟的形式被示出。发明详述编码乳头状瘤病毒的基因产物的能在被直接导入动物组织时表达的DNA构建体，是能提供抗乳头状瘤病毒感染之免疫保护作用的新的预防性和治疗性药物。
本发明提供了当其被直接导入例如美洲产白尾棕色兔和人等脊椎动物时即可诱导编码的肽在动物组织内表达的多核苷酸。当该肽是在动物中除感染期之外不存在的肽时，例如与乳头状瘤病毒(PV)相关的蛋白质时，动物的免疫系统即被激活以产生保护反应。因为这些外源性蛋白质由宿主动物细胞产生，它们即被主要组织相容性复合物(MHC)处理和呈递。该识别与被相关生物体真实感染时出现的识别相类似，本文所示结果是对可防止强毒性病毒感染的免疫反应的诱导。
如本文所用，多核苷酸指一种含必需的调控元件的核酸，以便在被导入活的脊椎动物细胞后它可指导细胞机器产生由包含该多核苷酸的基因所编码翻译产物。本领域的技术人员可从本说明书得知本发明的多种实施方案。例如，可使用不同的转录启动子，终止子，携带者(Carrier)载体或特殊的基因序列。
本发明提供了这样的核酸，当其被导入动物组织中后它即可在体内诱导乳头状瘤病毒基因产物的表达。因此，例如，将本发明的DNA构建体注射入兔肌肉中可诱导所编码基因产物的表达并产生病毒中和抗体。在用美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒后续的攻击中，所用的剂量使所有的对照兔产生了损害，但注射了多核苷酸疫苗的兔却只有很少的损害。因此，本发明公开了一种对防止人乳头状瘤病毒感染有用的疫苗。
编码乳头状瘤病毒蛋白质的DNA构建体可在动物中引起保护性的免疫反应。如下文将要详细介绍的，动物的免疫反应包括病毒中和抗体和兔中抗同种类型的乳头状瘤病毒之病毒攻击的保护作用。
在一种实施方案中，疫苗产品将由独立的编码例如，乳头状瘤病毒L1，L2，E2，E4蛋白的DNA质粒单独或联合起来组成。
预期的相对其他疫苗的优点包括但不限于由CTL反应所致的保护广度增大，抗体的广度增加，并且保护的持续时间增加。
在本发明的一种实施方案中，来自临床分离物的HPV类型6a，6b，11，16或18蛋白质序列的L1或L2或L1+L2被克隆进入表达载体中。该载体包含一个供DNA聚合酶转录用的启动子，并在HPV编码序列末端含有一个转录终止子。启动子的例子包括但不限于CMV。转录终止子的例子包括但不限于BGH。另外，为了在制备药物中有所帮助，一种在大肠杆菌中表达的抗生素抗性标记也优选包含在该表达载体中。新霉素抗性基因或其他任意的药理上可接受的抗生素抗性标记也可被使用。另外，为了有助于在原核生物的发酵中产生高水平的药物，该载体最好能含有一个复制起点并且是高拷贝好的。各种商业供应的原核克隆载体即提供了这些优点。期望能去除非必需的DNA序列。
因此，本发明提供了编码作为免疫原的PV蛋白的表达载体。本发明提供了一种不需自我复制试剂即可诱导交叉类型的保护性免疫的方法。另外，用DNA免疫接种有其他的优点。首先，这种免疫接种方法可用于肿瘤以及感染原，因为CD8+CTL反应对上两者的病理生理学过程的免疫干扰都是重要的。因此，引起一种抗转化过程必须的蛋白质的免疫反应可能是一种有效的癌症预防或免疫治疗的方法。其次，在注射编码一种病毒蛋白质的DNA之后产生针对所表达的蛋白质的抗体提示该技术提供了一种简便和有效的制备诱导抗体的疫苗的方法。
DNA构建体相对于传统的蛋白质纯化在生产和纯化方面的简化方便了组合疫苗的产生。因此，可以制备，混合和共同施用复合构建体，例如编码一种或多种类型HPV的L1和L2蛋白的构建体。最后，因为在注射DNA之后蛋白质的表达可以维持一段时间，B和T细胞的记忆持续可得到增强，从而产生长期的体液和细胞介导的免疫。
所建议的HPV疫苗的局限性强调需要开发更有效的防止感染和减轻疾病的方法。一种抗保守蛋白质的经改良的CTL反应的产生可提供明显的长期的交叉反应免疫力。
我们已通过检测直接抗CRPV抗原的宿主免疫反应证明了兔中PNV构建体的蛋白质表达。这些动物实验结果表明直接的DNA注射可以提供一种保护人抗HPV感染及疾病的方法。
比较了一定范围的剂量的免疫原性以便优化所用的浓度。预测10，50，100，和200μg的DNA剂量对人是有效的。
人的有效性在接受HPVDNA疫苗的自愿者中被显示。疫苗的组成，剂量和施用制度是以前述的研究为基础的。临床有效性以感染率，疾病评分，和病症持续时间表示。将这些临床研究结果与实验室对宿主免疫反应和病毒检测的评价相对比以确定与保护作用相关的替代标记。
制备和纯化DNA构建体的分子生物学使制备本发明的DNA药物成为可能。尽管标准的分子生物学的技术足以生产本发明的产品，本文所公开的特异的构建体却提供了可提供交叉毒株保护作用的新的治疗剂。
导入疫苗接受体中的可表达的DNA的量将依赖于在DNA构建体中所使用的转录和翻译启动子的强度，以及所表达的基因产物的免疫原性。一般说来，一个免疫学或预防学有效的量大约1μg～1mg；并且优选约10μg～300μg被直接施用于肌肉组织。皮下注射，真皮内导入，皮肌印迹，以及其他形式的施用方式如腹膜内，静脉内或吸入给药也可接受。还可建议提供加强(booster)免疫接种。
该多核苷酸可以是裸露的，即，不与任何蛋白，佐剂或其他可影响接受体免疫系统的药剂相伴。在这种情况下，期望多核苷酸是一种生理上可接受的溶液形式，例如，但不限于无菌的盐水或无菌的缓冲盐水。可选择地，多核苷酸可以与脂质体，例如卵磷质脂质体或其他本领域已知的脂质体相伴，形成DNA-脂质体混合物，或者DNA可以与本领域已知的佐剂如一种蛋白质或其他载体相伴以加强免疫反应。最好能使用有助于细胞对DNA吸收的试剂，例如，但不限于钙离子，病毒蛋白质和其他的转染易化试剂。这些试剂一般称为转染易化试剂和药理上可接受的载体。
用基因比用基因产物免疫接种有几个优点。一个优点是可以相对简单地将天然的或基本天然的抗原呈递给免疫系统。多核苷酸免疫接种的另一个优点是免疫原进入MHCI类途径并引起细胞毒T细胞反应的潜力。因为多核苷酸免疫接种可引起体液和细胞介导的反应，另一个优点即是它提供一种相对简单的筛选大量的有疫苗潜力的病毒基因和病毒类型的方法。注射多核苷酸的免疫接种还允许通过混合单独的成份而组装多成份的疫苗。
如本文所用，术语基因指一般编码一个分立的多肽的核酸片段。术语药物和疫苗可替换使用指可用于诱导免疫反应的组合物。术语构建体和质粒也可替换使用。术语载体指可将基因克隆入其中以根据本发明的方法使用该基因的DNA。
因此，本发明的一个实施方案是一种用PV基因，在一种脊椎动物如哺乳动物，包括人中体内诱导免疫反应的方法，其中包括a)分离至少一种PV基因，b)将基因与调节序列相连以使该基因可操作地与控制序列相连，其中控制序列当被导入活组织中时可指导该基因的转录启始和随后的翻译，c)将该基因导入活组织中，并且d)可任选地，用附加的PV基因加强免疫。
本发明的另一个实施方案可以是一种针对异种类型的PV的保护方法。这可以通过施用免疫学有效量的编码保守的PV表位的核酸而完成。
本发明的另一个实施方案中，多核苷酸疫苗编码另一种PV蛋白，如L1或L2或E1至E7或它们的联合。
本发明的另一个实施方案中，该DNA构建体编码HPV类型6a，6b，11，16或18蛋白，其中DNA构建体能在被导入动物组织中时在体内表达并诱导抗被编码的HPV基因的表达产物的免疫反应。包括种类构建体与编码其他与HPV不相关的多核苷酸的组合也是本发明所研究的。
编码HPV基因的DNA构建体的例子包括V1J-L1，V1J-L2，V1J-E1，V1J-E2，V1J-E3，V1J-E4，V1J-E5，V1J-E6，V1J-E7，V1J-E1i＾E4，V1J-E1＾E4-L1，V1J-E2-C在本发明的特定的实施方案中，DNA构建体编码CRPVL1蛋白，其中DNA构建体可在被导入动物组织时在体内表达并且诱导抗被编码的CRPV基因的表达产物的免疫反应。包括这些构建体与编码与CRPV不相关的其他抗原的多核苷酸的联合也是本发明所研究的。
编码CRPV基因的DNA构建体的例子包括V1J-L1，V1J-L2，V1J-E1，V1J-E2，V1J-E3，V1J-E4，V1J-E5，V1J-E6，V1J-E7，V1J-E1i＾E4，V1J-E1＾E4-L1，V1J-E2-C.
包含该DNA的药理上有用的组合物可根据已知的方法如与药理上可接受的载体混合来配制。这类载体和配制方法的例子可参看雷明顿药理科学(Remington′s Pharmaceutical Science)。为了形成可适于有效施用的药理上可接受的组合物，这些组合物应该包含有效量的HPVDNA。
本发明的治疗或诊断组合物以足以治疗或诊断PV感染的量。被施用给一个个体，有效量可根据各种因素如个体的状况，体重，性别和年龄而变化。其他因素包括给药方式。一般说来，组合物的给药剂量范围是约1微克到1毫克。
药物组合物可以各种途径如皮下，局部的，口服和肌内方式提供给个体。
本发明的疫苗包括HPVDNA，它编码HPV的重组蛋白质，该蛋白质包含在人宿主内诱导中和抗体形成的抗原决定簇。这些疫苗可以足够安全的给药而无临床感染的危险；无毒副作用；能以有效途径给药；是稳定的；可与疫苗载体相容。该疫苗可以如口服、非肠道、皮下或肌内的不同途径给药，施药剂量随个体的状况，性别、体重及年龄；施药的途径；和疫苗的PV类型而变化。该疫苗可以以如胶囊，悬液，酏剂或液体溶液等药剂形式使用。该疫苗可以与一种免疫学上可接受的载体一起配制。
疫苗以预防或治疗上有效的量给药，也就是说，该量足以产生免疫保护反应。该有效量可以随PV的类型而变化。疫苗可以以单次或多次剂量的形式给药。
本发明的方法使用于防止PV感染的单价或多价疫苗的配制成为可能。使用此方法，即可配制单价PV疫苗，也可配制多价PV疫苗。例如，单价的PHV16型疫苗可由编码HPV16L1蛋白或L2蛋白或L1+L2蛋白的DNA配制而成。另外，多价HPV疫苗可由编码来自不同的HPV类型的HPVL1或L2或L1+L2蛋白的DNA混合配制而成。
该DNA可被用于产生抗体。本文所用的术语“抗体”包含多克隆和单克隆抗体，以及其片段，例如可与抗原或半抗原结合的Fv，Fab和F(ab)2片段。
本发明的PVDNA和抗体可被用于血清定型HPV或CRPV感染以及HPV筛选。HPV和CRPVDNA以及抗体使其可以用于配制适于HPV或CRPV检测及血清定型的试剂盒。这样的试剂盒应该包括分隔开的适于互相紧靠承载至少一个容器的承载体(Carrier)。承载体中进一步包含适于检测各种类型HPV的试剂如HPVDNA或抗HPV抗体。承载体还可包含检测这类标记的抗原或酶底物等的手段。
下面提供的实施例将进一步说明本发明，但并不是为了将本发明局限于这些实施例的具体细节上。
实施例1疫苗生产用的载体A)V1表达载体V1构建自pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang等.，病毒学杂志.61，1796(1987)]。通过EcoRI切割载体和自我连接而将AKI和DHFR基因去除。该载体在CMV启动子中不含内含子A，因此它被作为带有缺失的内部SacI位点的PCR片段而被加入[在B.S.Chapman等.，核酸研究19，3979(1991)中编码在1855]。PCR反应的模板是pCMVintA-Lux，它是将来自pCMV6a120[参见B.S.Chapman等，ibid.]的含hCMV-IE1增强于(启动子和内含子A的HindIII和NheI片段连入pBL3的·HindIII和XbaI位点产生pCMVIntBL而制得的。来自RSV-Lux[J.R.de Wet等.，分子细胞生物学，7,725,1987]的.1881个碱基对的荧光素酶基因片段(HindIII-SmaI Klenow补平)被克隆入已用Klenow补平和磷酸酶处理的pCMVIntBL的SalI位点中。
跨越内含子A的引物是5′引物，5′-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3′；(SEQ ID NO1)3′引物，5′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3′；(SEQ ID NO2)用于去除SacI位的引物是有义引物，SEQ ID35-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′；和反义引物，SEQ ID4，5′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3′将PCR片段用SacI和Bgl II酶切割并插入到已用相同酶切割的载体中。
B)V1J表达载体，SEQ.ID5制造V1J的目的是为了从V1载体中去掉启动子和转录终止元件，以便将其放在一个更确定的上下文中，产生一个更紧凑的载体以及改善质粒的纯化产量。
V1J来自载体V1以及可商业供应的质粒pUC19。用限制性酶SspI和EcoRI消化V1以产生两个DNA片段。这些片段中较小的含有可控制异种基因表达的CMVintA启动子和牛生长激素(BGH)转录终止元件，该片段被纯化自琼脂糖电泳凝胶。将该DNA片段的末端用T4DNA聚合酶“切成平端”以便易化其与另一个“平末端”的DNA片段的连接。
选择pUC19用于提供表达载体的“骨架”。已知它有高的质粒产率，序列和功能特征描述详细并有最小化的大小。我们通过用HaeII限制性酶部分消化而将整个lac操纵子从载体中去掉，该lac操纵子对我们的目的是非必须的而且可能对质粒产率以及异种基因表达有害。将剩下的质粒用琼脂糖电泳凝胶纯化，用T4DNA聚合酶使末端平齐，并用牛小肠碱性磷酸酶处理，然后将其与上述的CMVintA/BGH元件连接，得到了在pUC骨架内启动子元件有两种可能的方向的质粒。这些质粒之其中之一在大肠杆菌中很高的NDA产率并被称为V1J。该载体的结构可通过对连接区的序列分析而确证并且接下来被证实与V1相比较有相仿的或更高的异种基因的表达。
C)V1Jneo表达载体SEO.ID6必须去除用于携带V1J细菌的抗生素筛选的ampr基因，因为氨苄青霉素不能用于大规模发酵生产人临床产品。用SspI和Eam1105I限制性酶消化而将V1I中来自pUC骨架的ampr基因去掉。将剩下的质粒用琼脂糖凝胶电泳纯化，用T4DNA聚合酶将末端平齐，并且接着用牛小肠碱性磷酸酶处理。将商业供应的来自转座子903并且包含于pUC4K质粒中的Kanr基因用PstI限制性酶切割，用琼脂糖凝胶电泳纯化后，并用T4DNA聚合酶末端平齐。将该片段与V1J骨架连接并且产生带两个方向的Kanr基因的质粒，它们被称为V1Jneo#′s1和3。每一种质粒都用限制性酶切分析，连接区DNA序列测定进行确证，结果表明都产生同样量的V1J质粒。这些V1Jneo载体与V1J载体的异种基因产物的表达相当。我们任意选择了含有的kanr基因与作为表达构建体的V1J中的ampr基因有相同方向的V1Jneo#3，并在以后称之为V1Jneo。
D)V1Jns表达载体给V1Jneo增加一个SfiI位点以方便整合研究。在载体的BGH序列的KpnI位点加入商业供应13碱基对的SfiI接头(linker)(New England.BioLabs)。用KpnI将V1Jneo线性化，凝胶纯化，用T4DNA聚合酶将之末端平齐并且与末端平齐的SfiI接头连接。通过限制性图谱选择克隆的分离物并用通过接头的测序加UL确证。新的载体称为V1Jns。在V1Jns(带有SfiI)中异种基因的表达与V1Jneo(带有KpnI)中相同基因的表达相当。
实施例2表明美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒蛋白质的DNA构建体的制备所有克隆基因的CRPV DNA的来源是CRPV-pLAII。这是完整的在SalI位点克隆进pBR322中的CRPV基因组(Nasseri，M.，Meyers，C.和Wettstein，F.O.(1989)CRPV发病机理的遗传分析L1开放读码框对细胞转化是非必需的但对乳头状瘤形成是需要的，病毒学170，321-325)。
1.V1Jns-L1用CRPV-pLAII DNA为模板用PCR产生L1编码序列。PCR引物被设计成含BamHI位点以便在凝胶纯化PCR片段后可以切割。
用于产生L1编码区的引物是有义引物5′GGTACAGGATCCACCATGGCAGTGTGGCTGTCTACGCAG3′(SEQ ID NO7)BamHI反义引物5′CCACATGGATCCTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATG3′(SEQ ID NO8)BamHI用凝胶纯化PCR片段，用BamHI切割并与用BglII切割的V1Jns连接。
2.V1Jns-L2通过PCR产生L2编码区。载体CRPV-pLAII的L2基因被用于将CRPV插入pBR322的SalI位点破坏了。因此，用SalI切割CRPV-pLAII并在SalI位点将CRPV DNA连接为环型可产生PCR用的模板。该连接的CRPV DNA被用做PCR的模板。PCR引物被设计成含有BamHI位点以便在PCR片段凝胶纯化之后进行切割。
用于产生L2编码区的引物是有义引物5’GGTACAGGATCCACCATGGTTGCACGGTCACGAAAACGC3′(SEQ ID NO9)BamHI反义引物5’CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT3′(SEQ ID NO10)BamHI3.V1Jns-E2用CRPV-pLAII DNA为模板通过PCR产生E2编码区。PCR引物被设计成包含BglII位点以便在PCR片段凝胶纯化后进行切割。
用于产生E2编码区的引物是有义引物5’GGTACAAGATCTACCATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA3’(SEQ ID NO11)BglII反义引物5’CCACATAGATCTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAACBGLIIAC3’(SEQ ID NO12)4.V1Jns-E4用CRPV-pLAII DNA为模板通过PCR产生E4编码区。PCR引物被设计成含有BglII位点以便在PCR片段凝胶纯化后切割之。
用于产生E4编码区的引物是有义引物5’GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC3’(SEQ ID NO13)BglII反义引物5′CCACATAGATCTTTATAAGCTCGCGAAGCCGTCTATTCC3′(SEQ ID NO14)BglII5.V1Jns-E7在一种情况下以CRPV-pLAII为模板而另一种情况下以纯化的来自Kreider′s CRPV株的DNA为模板，用PCR产生E7编码区。两个模板所用的引物是相同的。PCR引物被设计成含有BglII位点以便在PCR片段凝胶纯化之后切割之。
用于产生E7编码区的引物是有义引物5′GGTACAAGATCTACCATGATAGGCAGAACTCCTAAGCTTAG3′BglII反义引物5′CCACATAGATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC3′6.PGEX-2T-E2如所介绍的V1Jns-E2一样用PCR产生E2编码区。将该片段在BamHI位点克隆入pGEX-2T中，以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)产生在框内的(in-frame)的融合。该构建体被用于在大肠杆菌中产生蛋白质。
7.pGEX-2T-E4如V1Jns-E4中所介绍的用PCR产生E4编码区。将该片段在BamHI位点克隆入pGEX-2T中以便与谷胱甘肽S-转移酶(GST)产生框内的融合。该构建体被用于在大肠杆菌中产生蛋白质。
8.pGEX-2T-E7如V1Jns-E7中所述的用PCR产生E7编码区。将该片段在BamHI位点克隆入pGEX-2T中，以便与谷胱甘肽S-转移酶(GST)产生框内的融合。该构建体被用于在大肠杆菌中产生的蛋白质。
实施例3来自大肠杆菌的质粒的纯化将V1J构建体培养过夜至饱和。收集细胞并且用改良的碱性SDS法裂解细胞(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，分子克隆实验操作指南。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第二版(1989)。改良包括将细胞裂解和DNA提取的体积增大3倍。通过CsCl-EtBr梯度两次分带纯化DNA。用正丁醇抽提去除溴化乙锭。将得到的DNA用苯酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。将DNA重悬于TE中(10mM Tris，1mMEDTA)，pH8用于转染，而溶于0.9％NaCl中用于注射小鼠。用OD260/280的读数来确定每一个DNA制品的浓度和纯度。260/280的比值≥1.8。
实施例4体内CRPV特异性抗体的生产五只一组的兔子被放血并注射1.2ml盐水，该盐水含1mg V1Jns-L1，V1Jns-L2，V1Jns-L1与V1Jns-L2混合(共2mg)，或仅含V1Jns(不含编码蛋白质的对照载体)。接种物平均分布在6个肌肉位点上即两个后腿，两个前腿和后背上(lower-back)。在最初的DNA注射之后3周，将兔子放血并以相同的方式第二次注射相同的DNA。在第二次注射之后四周，再次给兔子放血。
将10倍连续稀释的免疫血清与1∶3稀释的CRPV贮存病毒(Kreider株)混合以测试血清的病毒中和抗体。用补加有1％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco’s改良的Eagle′s培养基(DMEM)制备稀释液。CRPV贮存病毒(购自Dr.J.Kreider，Hershey，PA)由获自野生的美洲产白尾棕色兔的皮肤块制备而来，其中该皮肤块被CRPV感染并且被植入无胸腺小鼠的肾囊下(renal Capsule)。将得到的湿疣组织匀浆并且离心澄清以制备贮存病毒制品。将免疫血清和病毒贮存的混合物在冰上至少保温60分钟，并接着将50μl每一种混合物用到3只新西兰白兔的剃过毛的，并被划破的背上的1cm2的皮肤面积上。七周后观察动物中疣的存在并对背腹的和两侧的椭圆形疣的大小(mm)进行测量。根据不同稀释度疣的频率用Reed-Muench内插法确定终点效价。注射L1 DNA或L1和L2 DNA二者的兔的中和抗体效价被绘在图1的y轴上。
还可用ELISA测定来自注射L1DNA的兔的血清的抗体。用1μg/孔半纯化的重组的酵母来源的CRPVL1蛋白在4℃将聚苯乙烯ELISA板包被过夜。在啤酒醇酵母中制备重组L1并如Kirnbaucer等所介绍的方法(美国国家科学院院报8912180-4，1992)略加修改进行纯化。加入稀释的血清并在室温保温1小时(在定轨(orbital)模床上振荡)。洗板并加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Fc特异的)。振荡下将板温育1小时后洗板并加入底物。用动力学ELISA读数仪(Molecular RevicesCorp.)在450nm读培养板并将获得的数值校正本底，即用同样稀释度的免疫接种后的血清的反应速率减去免疫前的血清的反应速率。通过将得到的修正后的反应速率对稀释度的曲线内插为10mOD/分钟的速率数值而确定效价。注射L1DNA或L1加L2DNA的兔的ELISA效价被绘在图1的x-轴上。图1示12/13的血清的中和活性是阴性的(log效价≥1，即相对未稀释的血清是阳性的)，ELISA抗体(ELISA效价≥100)也是阳性的。其中4个中和抗体是阴性的血清，其ELISA效价都≤350。所有的来自只接管L2DNA或V1J对照载体的兔的血清的ELISA效价小于100。总的看来，这些数据表明在注射L1DNA之后获得了对CRPV特异的并能中和它的抗体。在免疫接种之后至少32周兔中的ELISA效价保持不减少。
实施例5对强毒性CRPV的攻击的兔的保护作用如上所述，每组5只的兔子被肌内注射1mgV1Jns-L1，V1Jns-L2，V1Jns-L1与V1Jns-L2的混合物(共2mg)，或只注射V1Jns(对照载体，不含编码蛋白质)。在初次注射DNA后3周，给兔第二次注射相同的DNA。在第二次注射之后四周，用CRPV攻击兔子。CRPV攻击实行是将50μl两个稀释度的病毒贮存(用DMEM加1％BSA12或1∶12稀释)用于每只兔的剃过毛的，被划破的背上的三个平行的1cm2的位点。如上所述在攻击时从注射L1DNA或L1+L2DNA的动物中取的血清中用ELISA测定出其含有抗L1抗体及病毒中和抗体。在攻击3、6和10周后观察动物中疣的形成。在未接受L1DNA的兔中，用CRPV攻击的54个位点的51个形成了疣，而在接受L1DNA的兔中，用CRPV攻击的60个位点中只有2个形成了疣。在用L1DNA免疫接种的免中观察到的两个疣之中的一个在其出现之后3周之内缩小了(regressed)。表1表示在CRPV攻击后疣在兔上的分布。用L1DNA预防性地免疫接种可以使兔在受强毒力CRPV感染后不形成疣。
实施例6L1DNA诱导的抗体的构象的特异性为了证明保护性中和抗体识别VLP的构象表位而进行了吸收实验。L1VLP(15)对免疫血清的吸收去除了所有的中和抗体和ELISA活性(图3A，B)。当给划破的皮肤施用混有免疫前兔血清的CRPV时在所有的攻击位点上都出现了湿疣，但当用混有免疫血清的CRPV以同样方式施用时，由于中和抗体活性的存在而未见到湿疣。当将CRPV与已用L1VLP吸收的免疫血清混合时，所有位点(3/3)都是湿疣阳性的，而其中免疫血清的中和抗体应该已经被去除了。相反，当免疫血清被变性的非颗粒状L1蛋白(在8M尿素中通过还原和烷基化而变性)吸收时，该血清仍能够中和CRPV(图3A)，并保留其在ELISA中的活性(图3B)。因此由L1DNA免疫接种诱导的病毒中和抗体只能被天然构象形式的L1VLP而不是变性的L1去除。ELISA测试可检测与完整的L1VLP反应的一级构象特异性的抗体，因为吸收对ELISA活性的去除相应于中和抗体的去除(图3B)。
实施例7E4和E7DNA诱导的抗体反应给4只一组的NZW兔每次免疫接种肌内注射1mg的V1J-E2或V1J-E7DNA。在0、4、8和20周进行四次免疫接种并在22周时采血。抗体被用做所编码蛋白质的表达替代标记。用包被有1μg/孔GST-E2或GST-E7融合蛋白的ELISA板(NUNC Maxisorp)进行血清抗体测定，其中融合蛋白纯化自用编码CRPVE2或E7的pGEX表达载体转化并用IPTG诱导的大肠杆菌。如实施例3所述进行ELISA测定。mOD/min形式的净反应速率(4次剂量后减去免疫前)如图4所示。大于10mOD/min的净反应速率被认为是阳性的，具有高的抗体效价的样品可能由于检测系统的过饱和而在最低的稀释度的具有低的净反应速率。因此所编码的E2和E7蛋白由受体免疫系统表达和识别。
权利要求
1.一种包括编码至少一种乳头状瘤病毒基因的全部或部分的核酸的多核苷酸，该多核苷酸在其被导入动物组织体内时可诱导乳头状瘤病毒特异性的免疫反应。
2.权利要求1的多核苷酸，其中编码乳头状瘤病毒蛋白质的基因选自由HPVL1，HPVL2，HPVE1，HPVE2，HPVE3，HPVE4，HPVE5，HPVE6，HPVE7，CRPVL1，CRPVL2，CRPVE1，CRPVE2，CRPVE3，CRPVE4，CRPVE5，CRPVE6，CRPVE7，及其结合使用。
3.一种在脊椎动物中诱导抗乳头状瘤病毒表位的免疫反应的方法，它包括将至少Ing权利要求1的多核苷酸导入动物中。
4.一种包括权利要求1的多核苷酸的抗乳头状瘤病毒的疫苗。
5.一种包括权利要求1的多核苷酸和一种药用可接受载体的药物组合物。
6.一种用人乳头状瘤病毒基因在体内诱导免疫反应的方法，它包括a)分离该基因，b)将该基因与调控序列连接从而使该基因可操作地与控制序列相连，该控制序列当被导入活的组织中时可指导该基因的转录启始及随后对该基因的翻译；和c)将该基因导入活的组织中。
全文摘要
能在被直接导入动物组织时表达的编码乳头状瘤病毒的DNA构建体，它是能提供针对乳头状瘤病素感染的免疫保护作用的预防性药物。
文档编号C12N15/37GK1156966SQ95194672
公开日1997年8月13日 申请日期1995年6月1日 优先权日1994年6月30日
发明者J·J·唐奈利, M·A·刘, D·马丁尼兹, D·L·蒙哥马利 申请人:麦克公司