专利名称：五价重组人乳头瘤病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及人乳头瘤病毒感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及
五价(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33)重组人乳头瘤病毒联合
疫苗及其应用。
背暴按术
子宫颈癌(Cervical Cancer)每年直接造成约超过30万成年女性死亡(国 际卫生组织资料)，成为世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二 号杀手。科学研究证实，导致宫颈陴的罪魁祸首是一种名为人乳头瘤病毒 (Human Papill(MMvirus，简称H+V)的DNA致癌病毒。该病毒主要通过两 性接触传染，专性侵染人体上皮细l胞特别是生殖器官，部分病毒携带者在反 复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成I - III的宫颈内皮细胞 瘤样变(CIN I-III )和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。 部分低危险型(HPV6、 HPV11)病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐 湿疣。
最新研究表明HPV除了直接导致宫颈癌，还与支气管肺癌、直肠癌、口
腔癌和皮肤癌有重大关系。根据国际卫生组织冊O的有关资料，除了导致官 颈癌，HPV感染还可能解释60。/。的皮肤癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人类重大癌症。
HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、 HPV18等 13种高危险型确认能够导致宫颈癌症。HPV6、 HPV11等低危险型是造成男女 生殖部位尖锐湿疣的关键病原体。为获得良好的疗效，能同时预防多种HPV 型感染的多价疫苗成为发展方向。
发明内容
3(一) 要解决的技术问题
本发明的目的之一是提供五价(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33)重组人乳头瘤病毒联合疫苗；本发明的另一目的是提供该重组人乳
头瘤病毒疫苗在制备药物中的应用。
(二) 技术方案
本发明所述的五价重组人乳头瘤病毒联合疫苗，它包括活性成分以及佐 剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其特征在于所述的活性成分包括重组 HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33。
所述辅料中的佐剂包括铝盐、3-0-去酰化单磷酸类脂(3D-MPL)、脂质
A衍生物。
所述辅料中的赋型剂包括生理盐水及其它药物上可接受的赋型剂。
所述辅料中的稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液。
所述HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的Ll蛋白五聚体含量 均为20-50yg/支疫苗。
本发明所述的疫苗还可包括HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的L2蛋白、其它能与HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33蛋白五聚 体结合的蛋白，例如HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的E6/E7蛋 白。
一种生产所述疫苗的方法，它包括如下步骤
(1) 表达、分离、纯化重组HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33
的L1蛋白五聚体；
(2) 将所得L1蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到五价重组人乳头瘤病 毒疫苗。
其中，表达、分离、纯化重组HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的Ll蛋白五聚体的具体方法参见专利PCT/CN2008/000314 、 CN200810055700.5，得到纯度均为95%以上的Ll蛋白五聚体。
4本发明公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33引起的感染和疾病的药物中的应用。
本发明还公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉反应 而由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33以外的其它一种或多种HPV 型引起的感染和疾病的药物中的应用。
前述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直 肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。
优选地，所述的感染和疾病是尖锐湿疣和子宫颈癌。
本发明所述的疫苗可釆用多种方法作用于人体，包括肌肉和皮下注射。
该疫苗在能引发对L1蛋白免疫反应的有效剂量范围内使用。用于增强免疫反
应的复合物的特定剂量依照Ll复合物不同而变化。 一般而言，Ll五聚体的
用量在l-5pg/Kg体重之间。上述剂量范围并不排除更高或更低剂量的可能。
例如，具体的剂量会根据是否伴随有其他药物剂量而定，或取决于个人的药
代动力学、药物积累和代谢速率。 (三)有益效果
本发明所述的疫苗能够预防95 %的尖锐湿疣和75 %的子宫颈癌。该疫苗 的活性成分为HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33L1蛋白的五聚体,该五 聚体与HPV Ll蛋白的VLP (类病毒颗粒，为HPV Ll蛋白的七十二聚体)具 有相同的免疫原性和抗原性，且相对于VLP而言具有结构更稳定、工业成本 大幅降低的优点。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成 本低廉，防治范围更大。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例l五价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6 Ll五聚体的制备
1、 克隆HPV6 Ll衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国 Promega生物试剂公司)上。
2、 修饰HPV6L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替代 突变的载有HPV6 Ll基因插入片段的表达质粒pGEX - 6-l通过热激法导入大肠 杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版 社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达 诱导剂IPTG (购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用Niro Soavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检査细胞破 碎率达到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚体的分离、纯化上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱 纯化蛋白预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的Glutathione S印harose 4 B)色谱柱，取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4 B匀浆 放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的 缓冲液A(组分为50mmol/LTric-HCl， 200画1/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用 20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯 化产物，得到HPV6 Ll的五聚体。
二、 釆用与前述相同的方法制备HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚体。
三、 活性成分与辅料混合将纯化的HPV16 Ll的五聚体与含有100mMNaCl 的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存 在pH值为7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋白五聚体含量为20 lig/支疫苗、HPVll蛋白五聚体含量为20]Lig/支疫苗、HPV16蛋白五聚体含 量为40 n g/支疫苗、HPV18蛋白五聚体含量为40 |i g/支疫苗和HPV33蛋白五 聚体含量为30yg/支疫苗，制剂成为五价重组人乳头瘤病毒疫苗，在4。C保存。实施例2五价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
一、HPV6 Ll五聚体的制备
1、 克隆HPV6 Ll衣壳蛋白基因,克隆到T-Easy vector质粒(购自美国 Promega生物试剂公司)上。
2、 修饰HPV6L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替代 突变的载有HPV6 Ll基因插入片段的表达质粒pGEX-6-l通过热激法导入大肠 杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版 社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达 诱导剂IPTG (购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用Niro Soavi NS2006型高压勾质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查细胞破 碎率达到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚体的分离、纯化上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱 纯化蛋白预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的Glutathione Sepharose 4 B)色谱柱，取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4 B勾浆 放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的 缓冲液A(组分为50腿ol/L Trie-HC1， 200mmol/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均勻并在室温下作用 20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯 化产物，得到HPV6 Ll的五聚体。
二、釆用与前述相同的方法制备HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚体。
三、活性成分与辅料混合将纯化的HPV16 Ll的五聚体与含有100mM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换 (buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，同时加入氢氧化铝150pg，通过 调整通过调整使得重组HPV6蛋白五聚体含量为30jLig/支疫苗、HPV11蛋白五 聚体含量为20nig/支疫苗、HPV16蛋白五聚体含量为40Mg/支疫苗、HPV18 蛋白五聚体含量为20 )a g/支疫苗和HPV33蛋白五聚体含量为40 |u g/支疫苗， 制剂成为五价重组人乳头瘤病毒疫苗，在rc保存。
实施例3五价重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
一、HPV6 Ll五聚体的制备
1、 克隆HPV6 Ll衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国 Promega生物试剂公司)上。
2、 修饰HPV6L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替代 突变的载有HPV6 Ll基因插入片段的表达质粒pGEX-6-l通过热激法导入大肠 杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学出版 社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达 诱导剂IPTG (购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用Niro Soavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查细胞破 碎率达到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚体的分离、纯化上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱 纯化蛋白预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂Umersham公司生产的Glutathione S印harose 4 B)色谱柱，取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4 B勾浆 放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床体积的 缓冲液A(组分为50mmol/LTric-HC1， 200咖ol/L NaCl， l咖ol/L EDTA ， pH 8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用 20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察纯 化产物，得到HPV6 Ll的五聚体。二、 釆用与前述相同的方法制备HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚体。
三、 活性成分与辅料混合将纯化的HPV16 Ll的五聚体与含有100mM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置 换(buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得 Ll五聚体保存在pH值为7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋 白五聚体含量为40jag/支疫苗、HPV11蛋白五聚体含量为40jug/支疫苗、 HPV16蛋白五聚体含量为20)ig/支疫苗、HPV18蛋白五聚体含量为20|ig/ 支疫苗和HPV33蛋白五聚体含量为30jLig/支疫苗，制剂成为五价重组人乳 头瘤病毒疫苗，在4'C保存。
权利要求
1、五价重组人乳头瘤病毒联合疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其特征在于所述的活性成分包括重组HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV33。
2、 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的佐剂包括 铝盐、3D-MPL、脂质A衍生物。
3、 根据权利要求l所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的稳定剂包括基 于磷酸盐的生理缓冲液。
4、 根据权利要求l所述的疫苗，其特征在于所述重组HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18、 HPV33的Ll蛋白五聚体含量均为20 - 50 u g/支疫苗。
5、 一种生产如权利要求1-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步骤(1) 表达、分离、纯化重组HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的L1蛋白五聚体；(2) 将所得L1蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到五价重组人乳头瘤病 毒联合疫苗。
6、 根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33引起的感染和疾病的药物中的应用。
7、 根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉 反应而由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33以外的其它一种或多种 HPV型引起的感染和疾病的药物中的应用。
8、 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病包括 子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔 癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。
9、 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病是尖锐湿 疣和子宫颈癌。
全文摘要
本发明提供了五价重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其中活性成分包括重组HPV的L1蛋白五聚体，所述HPV型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33。该疫苗能够预防95％的尖锐湿疣和75％的子宫颈癌。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，防治范围更大。
文档编号C12N15/70GK101530614SQ20081010163
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者陈小江, 马润林 申请人:北京康乐卫士生物技术有限公司