专利名称：16型重组人乳头瘤病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及人乳头瘤病毒感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及 16型重组人乳头瘤病毒疫苗及其应用。
背景技术：
子宫颈癌(Cervical Cancer)每年直接造成约超过30万成年女性死亡(国 际卫生组织资料)，成为世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二 号杀手。科学研究证实，导致宫颈癌的罪魁祸首是一种名为人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus,简称HPV)的DNA致癌病毒。该病毒主要通过两
性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖器官，部分病毒携带者在反 复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成i-ni的宫颈内皮细胞 瘤样变(CIN I-III)和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。 部分低危险型(HPV6、 HPV11)病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。
最新研究表明HPV除了直接导致宫颈癌，还与支气管肺癌、直肠癌、口 腔癌和皮肤癌有重大关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫 颈癌，HPV感染还可能解释60。/。的皮肤癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人类重大癌症。
HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、 HPV18等 13种高危险型确认能够导致宫颈癌症，HPV6、 HPV11等低危险型是造成男女 生殖部位尖锐湿疣的关键病原体。在众多高危险型中HPV16占全部宫颈癌的 约50%，本发明正是针对由HPV16引起的感染所设计的疫苗。
发明内容
(一)要解决的技术问题
3本发明的目的之一是提供16型重组人乳头瘤病毒疫苗；本发明的另 一 目
的是提供该重组人乳头瘤病毒疫苗制备药物中的应用。 (二)技术方案
本发明所述的16型重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、 可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其中，所述的活性成分包括重组HPV16L1 蛋白五聚体。
所述辅料中的佐剂包括铝盐、3-0-去酰化单磷酸类脂(3D-MPL)、脂质
A衍生物。
所述辅料中的赋型剂包括生理盐水及其它药物上可接受的赋型剂。 所述辅料中的稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液。 所述重组HPV16L1蛋白五聚体的含量为40-50yg/支疫苗。 本发明所述的疫苗还可包括HPV16的L2蛋白、其它能与HPV16 Ll蛋 白五聚体结合的蛋白，例如HPV16的E6/E7蛋白。 一种生产所述疫苗的方法，它包括如下步骤
(1) 表达、分离、纯化重组HPV16L1蛋白五聚体；
(2) 将所得重组HPV16 Ll蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到16型重 组人乳头瘤病毒疫苗。
其中，表达、分离、纯化重组HPV16 Ll蛋白五聚体的具体方法参见专 利PCT/CN2008/000314、 CN200810055700.5，得到纯度为95%以上的Ll蛋 白五聚体。
本发明公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV16引起的感染 和疾病的药物中的应用。
本发明还公开了所述疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉反应 而由HPV16以外的其它一种或多种HPV型引起的感染和疾病的药物中的应 用。
前述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直 肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。优选地，所述的感染和疾病是由HPV16引起的子宫颈癌。
本发明所述的疫苗可釆用多种方法作用于人体，包括肌肉和皮下注射。
该疫苗在能引发对L1蛋白免疫反应的有效剂量范围内使用。用于增强免疫反
应的复合物的特定剂量依照Ll复合物不同而变化。 一般而言，Ll五聚体的
用量在l-5jLig/Kg体重之间。上述剂量范围并不排除更高或更低剂量的可能。
例如，具体的剂量会根据是否伴随有其他药物剂量而定，或取决于个人的药
代动力学、药物积累和代谢速率。 (三)有益效果
本发明所述的16型重组人乳头瘤病毒疫苗能够预防50%宫颈癌，同时 也能预防由HPV16感染引起的其它疾病。该疫苗的活性成分为HPV16 Ll蛋白 的五聚体，该五聚体与HPV16 Ll蛋白的VLP (类病毒颗粒，为HPV16 Ll蛋 白的七十二聚体)具有相同的免疫原性和抗原性，且相对于VLP而言具有结 构更稳定、工业成本大幅降低的优点。所以，本发明所述的疫苗与目前已有 的疫苗(活性成分均为HPV Ll蛋白的VLP)相比，质量稳定、成本低廉，给
发展中国家的患者带来了福音，具有良好的经济效益和深远的社会影响。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例l 16型重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
1、 克隆HPV16 Ll衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国 Promega生物试剂公司)上。
2、 修饰HPV16 Ll衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替 代突变的载有HPV16 Ll基因插入片段的表达质粒pGEX-6-l通过热激法导入 大肠杆菌BL21细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学 出版社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达诱导剂IPTG (购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用 Niro Soavi NS2006型高压匀质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检査 细胞破碎率达到90°/。以上。
3、 HPV16 Ll蛋白的五聚体的分离、纯化上清溶液中的L1蛋白经亲和 色谱纯化蛋白预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的 Glutathione Sepharose 4 B )色谱柱，取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4B勻浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-IO倍的柱床 体积的缓冲液A(组分为50 mmol/L Trie-HC1, 200mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA ，pH 8.0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室 温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电 镜观察纯化产物，得到HPV16 Ll的五聚体。
4、 活性成分与辅料混合制剂将纯化的HPV16Ll的五聚体与含有100mM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换
(buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1 五聚体保存在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，通过调整L1蛋白五聚体的浓度至 50jig/支疫苗，制剂成为16型重组人乳头瘤病毒疫苗，在4'C保存。
实施例2 16型重组人乳头瘤病毒疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
1、 克隆HPV16 Ll衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国 Promega生物试剂公司)上。
2、 修饰HPV16 Ll衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替 代突变的载有HPV16 Ll基因插入片段的表达质粒pGEX-6-l通过热激法导入 大肠杆菌BLn细胞之后，使用LB培养基(配方见《分子克隆》第三版，科学 出版社，2002年8月出版)进行摄氏37度培养，菌种接入后生长12小时开始用 表达诱导剂IPTG (购自美国Promega公司)诱导，9小时后收获细胞，细胞用Niro Soavi NS2006型高压句质机在800bar下重复破碎细胞2次，显微镜检查 细胞破碎率达到90%以上。
3、 HPV16 Ll蛋白的五聚体的分离、纯化上清溶液中的L1蛋白经亲和 色谱纯化蛋白预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的 Glutathione Sepharose 4 B)色谱柱，取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4B匀浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml匀浆)。用5-10倍的柱床 体积的缓冲液A(组分为:50咖ol/L Tric-HCl， 200咖ol/L NaCl， 1画1/L EDTA，pH8. O)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室 温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电 镜观察纯化产物，得到HPV16 Ll的五聚体。
4、活性成分与辅料混合将纯化的HPV16 Ll的五聚体与含有100mM NaCl 的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得L1五聚体保存 在pH值为7.2的磷酸缓冲液中，同时加入氢氧化销150Mg,通过调整L1蛋白 五聚体的浓度至40Mg/支疫苗，制剂成为16型重组人乳头瘤病毒疫苗，在4
x:保存。
实施例3 16型重组人乳头瘤病毒疫苗的动物安全性试验
将实验用成年健康雄性或雌雄比戈犬按照急性毒性、慢性毒性、生殖毒 性、异常毒性的实验目标要求随机分组，每个目标组有比戈犬42只，目标组 内再分为7个小组，每小组6只，其中3个小组作为一个试验剂量处理重复， 另1个小组作为空白实验对照，然后对每只处理比戈犬按照实验目标要求的 剂量分三次肌肉注射实施例1所制得的16型重组人乳头瘤病毒疫苗，注射的 间隔期为14天。空白对照注射不含HPV16 Ll蛋白五聚体的磷酸盐生理缓冲 液。生殖毒性目标组全部使用怀孕两周的雌雄动物，第一次注射后开始观察 和记录妊娠情况；
急性毒性和异常毒性目标组在给定剂量(最高剂量为人体标准允许剂量200810101637.4
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的20倍)第一次注射后立即开始观察和记录动物出现的任何异常情况；在给 定剂量注射三次注射两周后进行解剖，按照急性毒性和异常毒性实验要求釆 集体血液和内各器官组织的样本进行相关指标的检查和化验，对釆集的实验 数据进行统计分析。检验结果发现，重组HPV16疫苗对供试动物未发现任何 可观测到的急性毒性和异常毒性，全部毒性检测指标为阴性。
慢性毒性目标组在给定剂量注射三次后，连续喂养观察动物90天，90 天后按照慢性毒性实验要求采集体内各器官组织的样本进行相关指标的检查 和化验，对釆集的实验数据进行统计分析。检验结果发现，重组HPV16疫苗 对供试动物未发现任何可观测到的慢性毒性，全部毒性检测指标为阴性。
生殖毒性目标组全部使用怀孕2-3周的雌雄动物，在三次注射完成后的 第14天解剖动物，按照生殖毒性实验要求釆集体血液和内各器官组织的样本 进行相关指标的检查和化验，对釆集的实验数据进行统计分析。检验结果发 现，重组HPV16疫苗对供试动物未发现任何可观测到的生殖毒性，全部生殖 毒性检测指标为阴性。
实施例4 16型重组人乳头瘤病毒疫苗的动物有效性试验
ED50实验将供试8-10周龄BALB/c雄性小鼠随机分为6组，每组10只， 留一个使用对照组，其余5个小组的每只小鼠分三次腹腔注射实施例l所制 得的16型重组人乳头瘤病毒疫苗，每次注射剂量为0. 0125微克、0. 05微 克、0.2微克、0.8微克和3.2微克剂量。第三次注射后14天，釆集小鼠血 液，使用Ll蛋白五聚体为抗原，ELISA法检测血液内由HPV16 Ll抗原诱导 的特异抗体的水平。检验结果发现，重组HPV16疫苗能够诱导供试动物产生 强烈的抗体保护反应，计算得到抗体有效中浓度ED50在0. 4 - 2. 0微克。
将供试8-10周龄动物BALB/c雄性小鼠随机分为6组，每组10只，留一个 使用对照组，其余5个小组的每只小鼠分三次腹腔注射实施例1所制得的16型 重组人乳头瘤病毒疫苗，每次注射剂量为计算出的ED50剂量。第三次注射后 14天，釆集小鼠血液，使用L1蛋白五聚体为抗原，ELISA法检测血液内由HPV16Ll抗原诱导的特异抗体的水平。检验结果发现，重组HPV16疫苗能够诱导供试 动物产生强烈的抗体保护反应，抗原的免疫原性及抗体的滴度水平很高，抗 体血清在稀释1000倍后仍然显著高于对照的背景水平。
实施例5 16型重组人乳头瘤病毒疫苗的动物稳定性试验
为检测疫苗的稳定性，实验疫苗分别在摄氏4度、25度和37度保存，在0 天、15天、30天、90天、180天、360天和540天分别检测疫苗的物理化学性 状及生物活性。
在上述每个预定的检测日期，对在不同温度条件下保存的疫苗样品取出 进行纯度、分子量、外观色泽、可见异物、降解程度等一系列生理生化指标 测量(方法均为本领域技术人员熟知的常规操作)，并与O天对照相比较。检 测结果发现，在摄氏4度条件下，疫苗在540天内的各项理化指标保持高度稳 定，无显著改变。
生物活性测定时，将供试试8-10周龄BALB/c雄性小鼠随机分为4组，每 组10只，留一个使用对照组，其余3个小组的每只小鼠分三次腹腔注射实施例 1所制得的16型重组人乳头瘤病毒疫苗，每次注射剂量为计算出的ED50剂量。 第三次注射后14天，釆集小鼠血液，使用L1蛋白五聚体为抗原，ELISA法检测 血液内由HPV16 Ll抗原诱导的特异抗体的水平。检验结果发现，重组HPV16 疫苗在摄氏37度下的免疫原性与0天对照相比可维持19天不变，在摄氏25下的 免疫原性可维持90天不变，在摄氏4度下的免疫原性维持540天不变。进一步 的稳定性实验仍然在进行中。
权利要求
1、16型重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，其特征在于所述的活性成分包括重组HPV16L1蛋白五聚体。
2、 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的佐剂包括 铝盐、3D-MPL、脂质A衍生物。
3、 根据权利要求l所述的疫苗，其特征在于所述辅料中的稳定剂包括基 于磷酸盐的生理缓冲液。
4、 根据权利要求l所述的疫苗，其特征在于所述重组HPV16L1蛋白五 聚体的含量为40 - 50 )i g/支疫苗。
5、 一种生产如权利要求l-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步骤(1) 表达、分离、纯化重组HPV16L1蛋白五聚体；(2) 将所得重组HPV16 Ll蛋白五聚体与辅料混合制剂，得到16型重 组人乳头瘤病毒疫苗。
6、 根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV16引起 的感染和疾病的药物中的应用。
7、 根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由于抗体交叉 反应而由HPV16以外的其它一种或多种HPV型引起的感染和疾病的药物中 的应用。
8、 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病包括 子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔 癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。
9、 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病是由 HPV16引起的子宫颈癌。
全文摘要
本发明提供了16型重组人乳头瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐剂、可药用的赋型剂、稳定剂等辅料，所述的活性成分包括重组HPV16 L1蛋白五聚体。该疫苗能够预防约50％官颈癌，同时也能预防由HPV16感染引起的其它疾病。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，给发展中国家的患者带来了福音，具有良好的经济效益和深远的社会影响。
文档编号C12N15/70GK101530612SQ20081010163
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者陈小江, 马润林 申请人:北京康乐卫士生物技术有限公司