改良疫苗的制作方法

专利名称：改良疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及改良的保护性和治疗性疫苗，还涉及改良的、用于预防性和/或治疗性诱导针对抗原的免疫应答的方法。
背景技术：
DNA疫苗是一种新兴领域，它通过在个体中诱导免疫应答而提供了预防和治疗失调、疾病、病症和感染的手段，其中所诱导的免疫应答针对与这些失调、疾病、病症和感染相关的抗原。本质上，将含有抗原编码序列的质粒DNA(其中该编码序列可操作地连于基因表达所需的调控元件)施用于个体。个体细胞摄入该质粒DNA并表达该编码序列。这样产生的抗原就成为免疫应答所针对的靶目标。针对抗原的免疫应答可提供个体抗任何变应原、病原体、癌症细胞或自身免疫细胞的预防或治疗好处，只要它们含有能被针对该抗原的免疫应答所识别的表位。
DNA疫苗包括裸疫苗和易化疫苗(facilitated vaccine)。此外，它们可以用各种不同技术进行施用，其中包括几种将物质输送给组织的不同装置。出版的文献包括数篇综述文章，它们描述了DNA疫苗技术的各个方面，并且引用了有关用该技术获得的许多结果的报道中的一部分。下列综述文章中的每一篇都在此引用作为参考，在每篇综述文章中所引用的每篇参考文献也在此引用作为参考，它们描述了DNA疫苗技术McDonnel W.M.和F.K.Askari 1996，新英格兰医学杂志(New.Engl.J.Med.)334(1)42-45；Robinson，A.1995，癌症医学协会杂志(Can.Med.Assoc.J.)152(10)1629-1632；Fynan，E.F.等人，1995，国际免疫药物学杂志(Int.J.Immunopharmac.)17(2)79-83；Pardoll，D.M.和A.M.Beckerleg 1995，免疫(Immunity)3165-169；和Spooner等人，1995，基因治疗(Gene Therapy)2173-180。
虽然这些疫苗对于预防性或治疗性免疫个体以抵抗病原体感染或人疾病通常是有效的，但仍然需要有更好的疫苗。需要一种产生增强免疫应答的组合物和方法。
发明概述本发明涉及一种质粒，它包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在真核细胞中表达所必需的调控元件操作性连接，其中编码免疫原性抗原的核苷酸序列包括编码信号肽的核苷酸序列，该信号肽引导该免疫原性靶抗原在细胞内的运输。在某些优选实施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一种病原体抗原、与癌症相关的抗原或与自身免疫疾病相关的细胞相连的抗原。在某些实施方案中，编码引导免疫原性靶抗原在细胞内运输的信号肽的核苷酸序列，会编码这样的信号肽，该信号肽指导免疫原性靶抗原被分泌，或定位于细胞质、细胞膜、内质网或溶酶体。在某些例子中，编码引导免疫原性靶抗原的胞内运输的信号肽的核苷酸序列，是非天然的信号序列。
本发明涉及一种诱导个体针对抗原的免疫应答的方法，它包括步骤给个体施用质粒，该质粒包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中编码免疫原性抗原的核苷酸序列包括编码信号肽的核苷酸序列，该信号肽引导该免疫原性靶抗原在细胞内的运输。在某些优选实施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一种病原体抗原、与癌症相关的抗原或与自身免疫疾病相关的细胞相连的抗原。在某些实施方案中，编码引导免疫原性靶抗原在细胞内运输的信号肽的核苷酸序列，会编码这样的信号肽，该信号肽指导免疫原性靶抗原被分泌，或定位于细胞质、细胞膜、内质网或溶酶体。在某些例子中，编码引导免疫原性靶抗原的胞内运输的信号肽的核苷酸序列，是非天然的信号序列。
本发明涉及一种改良的DNA疫苗，该疫苗包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中，编码免疫原性抗原的核苷酸序列包括编码信号肽的核苷酸序列，该信号肽引导该免疫原性靶抗原在细胞内的运输。在某些优选实施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一种病原体抗原、与癌症相关的抗原或与自身免疫疾病相关的细胞相连的抗原。在某些实施方案中，编码引导免疫原性靶抗原在细胞内运输的信号肽的核苷酸序列，会编码这样的信号肽，该信号肽指导免疫原性靶抗原被分泌，或定位于细胞质、细胞膜、内质网或溶酶体。在某些例子中，编码引导免疫原性靶抗原的胞内运输的信号肽的核苷酸序列，是非天然的信号序列。
本发明涉及一种免疫个体对抗病原体、癌症或自身免疫疾病的的方法，它包括步骤给个体施用DNA疫苗，该DNA疫苗包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中，编码免疫原性抗原的核苷酸序列包括编码信号肽的核苷酸序列，该信号肽引导该免疫原性靶抗原在细胞内的运输。在某些优选实施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一种病原体抗原、与癌症相关的抗原或与自身免疫疾病相关的细胞相连的抗原。在某些实施方案中，编码引导免疫原性靶抗原在细胞内运输的信号肽的核苷酸序列，会编码这样的信号肽，该信号肽指导免疫原性靶抗原被分泌，或定位于细胞质、细胞膜、内质网或溶酶体。在某些例子中，编码引导免疫原性靶抗原的胞内运输的信号肽的核苷酸序列，是非天然的信号序列。
附图简述

图1A、1B和1C显示了对H221结合进行FACS分析的结果。
图2A是遗传免疫载体的图，在该载体中克隆入了VH或Fv区。
图2B是插入片段的构建图，该插入片段编码V区，用于将V区导向(定位)细胞中的不同位置。
图3显示了实验结果，对设计成在细胞中可定位于不同位置的不同构建物，比较了它们诱导细胞毒性T细胞的情况和增殖反应情况。
图4A、4B和4C显示了实验结果，这些实验评估了各种不同的胞内定向DNA疫苗所引发的CTL应答情况。
图5A、5B和5C显示了肿瘤攻击实验结果，其中使用产生抗体的杂交瘤细胞，而该抗体的可变区由DNA疫苗所编码。
图6A和6B显示了本发明的含有特异引导序列的遗传构建物。
图7A和7B显示了用于保留于内质网的几种C末端序列。
图8显示了DNA疫苗的结构。使用的DNA疫苗骨架是pBBkan骨架。它使用了CMV启动子和RSV增强子来进行转录。插入片段示于表4，在前导肽(或者是来自鼠IgG的疏水性前导肽(Ig前导肽)，或者是用于胞质定位的亲水性前导肽(Cyto前导肽))后为VHFv(VL连于VH)区，以及添加的具有内质网保留信号的跨膜和胞质尾部(CD4 TM & E19 Cyto)。
图9显示了实验结果，该实验评估了在单次DNA接种之后脾细胞的增殖反应情况。
图10A、10B和10C显示了实验结果，该实验评估了在单次DNA接种之后细胞毒性T细胞(CTL)应答情况。图10A显示的数据来自于这样的实验，其中疫苗将H221 VH或Fv区导向于内质网以便分泌。图10B显示的数据来自于这样的实验，其中疫苗将H221 VH或Fv区导向于内质网以便保留。图10C显示的数据来自于这样的实验，其中疫苗将H221 VH或Fv区导向于胞质。
图11A和11B显示了在DNA接种和攻击后存活和肿瘤负荷的情况。
图12显示了实验数据，该实验评估了肿瘤攻击存活细胞的增殖反应情况。
发明详述本发明涉及改良的DNA疫苗。下列文献描述了DNA疫苗美国专利No.5,589,466和5,973,972，PCT出版的申请PCT/US90/01515，PCT/US93/02338，PCT/US93/048131和PCT/US94/00899，以及它们所引用的优先权申请，这些文献的每一篇都在本文中引用作为参考。除了这些专利申请中所述的给药方案之外，输送DNA的其他方法可参见美国专利No.4,945,050和5,036,006，它们都在此引用作为参考。此外，上述的综述文章描述了DNA疫苗技术并列举了DNA疫苗的例子。在每种情况下，质粒DNA被输送至个体的细胞，细胞摄入该质粒然后表达质粒所编码的免疫原性靶蛋白。所产生的针对免疫原性靶蛋白的免疫应答，为接种疫苗的个体提供了预防或治疗上的好处。
根据本发明，在质粒上的编码免疫靶蛋白的编码序列是与编码一氨基酸序列的编码序列一起提供的，因该氨基酸序列存在于蛋白质上而导致表达的蛋白有特定的细胞内定位。编码引导胞内蛋白质运输的氨基酸序列、并被包含在免疫原性蛋白质的编码序列(该编码序列被包含在用作DNA疫苗组合物的质粒构建物中)中的核苷酸序列，可引导在细胞中定位于特定区域，这导致特异性免疫应答被增强。
如本文所用，术语“遗传构建物”指含有编码序列的质粒，该编码序列编码免疫原性靶蛋白和指导胞内蛋白运输的氨基酸序列，该编码序列可操作地连于在真核细胞中表达该编码序列所需的调控元件。用于DNA表达的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，其他元件如Kozak区也可被包含在遗传构建物中。起始信号和终止信号是必需的调控元件，它们常常被认为是编码序列的一部分。本发明遗传构建物的编码序列包括功能性的起始信号和终止信号。
如本文所用，术语“免疫原性靶蛋白”指这样的抗原，它是针对与病症、感染、疾病或失调相关的蛋白质的免疫应答所针对的靶目标，如病原体、病原体抗原、与癌症细胞或自身免疫疾病相关细胞有关的抗原。免疫原性靶抗原由DNA疫苗中所用的遗传构建物的编码序列所编码。将DNA疫苗施用于接种疫苗的个体，遗传构建物被个体细胞所摄入，编码序列被表达，然后产生免疫原性靶蛋白。免疫原性靶蛋白在个体中诱导针对免疫原性靶蛋白的免疫应答。免疫应答针对与病症、感染、疾病或失调相关的蛋白质，如病原体、病原体抗原、与癌症细胞或自身免疫疾病相关细胞有关的抗原。因此，接种的个体可以预防性或治疗性地被免疫，以防止或治疗该病症、感染、疾病或失调。免疫原性靶蛋白指由本发明基因构建物所编码的肽和蛋白质，它们作为免疫应答的靶蛋白。术语“免疫应答靶蛋白”指这样的蛋白质，针对该蛋白质可引发免疫应答。免疫原性靶蛋白与来自需要免疫来对抗的变应原、病原体、不利蛋白或细胞类型(如癌症细胞或自身免疫疾病中所涉及的细胞)的蛋白，共享至少一个表位(抗原决定蔟)。针对免疫原性靶蛋白的免疫应答会保护个体以对抗特定的感染或疾病，以及治疗个体的特定感染或疾病，而其中来自变应原、病原体、不利蛋白或细胞类型的蛋白与该感染或疾病是相关的。免疫原性靶蛋白并不要求与需要免疫应答来针对的蛋白质完全一样。相反，免疫原性靶蛋白必须能够引发免疫应答，而该免疫应答能够与需要免疫应答来针对的蛋白质发生交叉反应。
如本文所用，术语“非天然信号序列”指，相对编码指导免疫原性靶抗原胞内运输的信号序列的核苷酸序列而言，是异源的信号序列。非天然信号序列在自然界中并不与免疫原性靶蛋白相连；相反，它是通过制备基因构建物而产生的，其中在该基因构建物中编码信号序列的核苷酸序列与编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列相连。在某些例子中，可以从编码免疫原性靶蛋白的编码序列中去除天然信号序列，然后用非天然信号序列加以替换来指导蛋白质定位，从而将其引导至与天然序列引导蛋白所到达的部位不同的部位，或者更有效地引导至与天然序列引导蛋白所到达的部位相同的部位。
根据本发明，免疫原性靶蛋白包含指导在细胞内定位的序列。通过提供信号序列、设计嵌合蛋白或将序列移植(graft)入免疫原性蛋白质序列中，可以将指导蛋白定位的天然存在序列掺入到DNA疫苗的免疫原性靶蛋白中。DNA疫苗是质粒，因而可用标准的分子生物学方法对免疫原性靶蛋白的编码序列进行操作以产生编码序列，该编码序列编码含有指导胞内蛋白质运输的信号序列的免疫原性靶蛋白，或者编码含有指导胞内蛋白质运输的区域的嵌合免疫原性靶蛋白。此外，可用常规的分子生物学技术来改变免疫原性靶蛋白的氨基酸序列，从而使它在其序列中就含有指导胞内蛋白质定位的序列。在某些例子中，编码指导免疫原性靶抗原胞内运输的信号序列的核苷酸序列，是非天然的信号序列。通过使用众所周知的技术，可以鉴定、分离编码一种蛋白质的信号序列的核苷酸序列，并将其连接于编码不同蛋白质的编码序列。
免疫原性靶蛋白在细胞内被引导到达的位置，会影响个体产生的针对免疫原性靶蛋白的免疫应答。已发现，由DNA疫苗遗传构建物所编码的免疫原性靶蛋白的胞内定位，可导致对免疫原性靶抗原的免疫应答增强。通过将胞内定位信号的编码序列作为免疫原性靶蛋白编码序列的一部分，可以使免疫原性靶蛋白定位于细胞的该部位。已发现，某些定位与更强的特异性免疫应答是相关的。例如，已发现，与使用不含引导特异性胞内定位的序列的疫苗时的观察结果相比，将引导蛋白质停留于内质网或再循环至内质网(尤其是糙面内质网)，可在接种动物中引发更强的CTL应答。
本发明的改进是包含指导胞内定位的遗传物质，以指导在施用了DNA疫苗的个体细胞中产生免疫原性靶蛋白的胞内定位。
本发明涉及将遗传物质引入个体细胞的方法，以诱导针对遗传物质所编码的蛋白质或肽的免疫应答。所述方法包括步骤给该个体的组织施用DNA，该DNA含有编码序列，该编码序列可操作地连于表达所需的调控序列。该编码序列包括连于或含有胞内运输信号编码序列的免疫原性靶蛋白编码序列。
胞内运输信号是众所周知的。
在某些例子中，蛋白质需要被分泌。这类蛋白质包含N端疏水序列。当RNA被翻译时，N端的疏水序列导致蛋白质被粘于糙面内质网。随后，疏水序列被蛋白酶切除，然后蛋白质被分泌。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白可含有N端疏水前导序列，当免疫原性靶蛋白在细胞中表达时，该前导序列会指导免疫原性靶蛋白的分泌。
在某些例子中，蛋白质需要被结合于膜上。这类蛋白质包含N端疏水序列和内部疏水区域。与分泌形式相同，当RNA被翻译时，疏水序列导致蛋白质被粘于糙面内质网。随后，疏水序列被蛋白酶切除。蛋白质依照相同的分泌途径，但是内部疏水序列防止了分泌，蛋白质就结合于膜上。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白可含有N端疏水前导序列和内部疏水序列，当免疫原性靶蛋白在细胞中表达时，这些序列导致免疫原性靶蛋白成为膜结合蛋白。
在某些例子中，蛋白质需要被定位于胞质。这类蛋白质不包含N端疏水序列。当RNA被翻译时，蛋白质不粘于糙面内质网，因而蛋白质成为胞质蛋白质。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白不含有N端疏水前导序列，因此当免疫原性靶蛋白在细胞中表达时，就成为胞质蛋白质。
在某些例子中，蛋白质需要被定位于溶酶体。这类蛋白质可包含序列DKQTLL(SEQ ID NO1)，该序列会引导蛋白质定位于溶酶体。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白含有序列DKQTLL(SEQ ID NO1)，因此当免疫原性靶蛋白在细胞中表达时，就被引导至溶酶体。
在某些例子中，蛋白质需要从高尔基体被定位回内质网。这类蛋白质可包含位于C末端的序列KDEL(SEQ ID NO2)，该序列会引导蛋白质被再循环回内质网。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白在C末端含有序列KDEL(SEQ ID NO2)，因此免疫原性靶蛋白被引导至内质网。
据报道，这种“内质网再循环信号”的另一例子是腺病毒E19蛋白的C末端序列。该蛋白质被定位于内质网，在内质网中，该E19蛋白结合于主要组织相容性复合体(MHC)，并且有效地防止它们荷载(loading)蛋白质，而这些蛋白质是由MHC在表面所呈递的(在表面上，它们与T细胞受体复合从而作为免疫应答诱导过程的一部分)。E19蛋白是一种六肽DEKKMP(SEQ ID NO3)。在某些例子中，需要通过在C末端含有DEKKMP(SEQ ID NO3)序列而使蛋白质被定位于内质网。在本发明的某些例子中，免疫原性靶蛋白在C末端含有序列DEKKMP(SEQ IDNO3)，因此免疫原性靶蛋白被引导至内质网。
取决于需要增强的免疫应答类型，需要不同的胞内定位。在I类免疫应答情况下，在细胞中合成的蛋白质被降解并运输至内质网，在内质网中它们被荷载在MHC上，然后MHC移至细胞表面并与CD8+T细胞的T细胞受体复合。该反应导致了CTL应答。在II类免疫应答情况下，蛋白质与抗原呈递细胞(APC)复合，而APC与CD4+T细胞相互作用，并使辅助性T细胞(包括与抗体应答相关的辅助性T细胞)参与。
为了增强I类免疫应答，使蛋白质定位于胞质或内质网可使这些蛋白质更易进入I类途径。
为了增强II类免疫应答，使蛋白质定位于跨膜或溶酶体或使蛋白质分泌，将使这些蛋白质更易进入II类途径。
本发明提供了可用作DNA疫苗的遗传构建物，它含有免疫原性靶蛋白的编码序列，而该免疫原性靶蛋白含有胞内定位所需的序列。
在某些例子中，遗传构建物含有Biocca，S.等人(1990，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)9101-108)所述的定位引导序列。遗传构建物可含有处于与图6A所示相同方向的这些引导序列。具体地，前导序列位于蛋白质的N末端，正好位于启动子和感兴趣蛋白质的编码序列之间。在某些例子中，本发明的遗传构建物含有本申请图6A中所示的前导序列之一。在某些例子中，本发明的遗传构建物含有本申请图6B中所示的前导序列之一。
在某些例子中，遗传构建物含有腺病毒E19蛋白的末端六肽，以便被保留在内质网中。当DNA疫苗的免疫原性靶蛋白C末端为DEKKMP(SEQ ID NO3)时，蛋白质会被保留在内质网中。
在某些例子中，遗传构建物含有C末端的四肽，以便被保留在内质网中。当DNA疫苗的免疫原性靶蛋白C末端为KDEL(SEQ ID NO2)时，蛋白质会被保留在内质网中。
图7A和7B显示了数种用于留在内质网的C末端序列。Jackson，M.R.，等人(1990，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)，93153-3162)报道，当图7A中的C末端序列被连于那些通常不保留在内质网中的蛋白质的C末端时，会导致嵌合蛋白质留在内质网中。
在某些例子中，遗传构建物含有位于免疫原性靶蛋白C末端尾部处的溶酶体定位双联体。C末端尾部是最后的20-30个氨基酸。通过包含双联体LL和/或YQ和/或QY，可使蛋白质被引导至溶酶体。在某些例子中，含有一个或多个溶酶体定位双联体的C末端尾部是跨膜蛋白的细胞质尾部。在某些例子中，双联体被包含在免疫原性蛋白的序列的最后30个氨基酸中。
根据本发明，所提供的是预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法，以抵抗变应原、病原体或异常的与疾病相关的细胞或蛋白质。遗传物质编码靶蛋白(即这样的肽或蛋白质，它与待针对的变应原、病原体或抗原或细胞共有至少一个表位)，而且遗传物质还编码胞内运输信号。遗传物质由个体的细胞表达，并作为免疫原性靶目标，以引发针对它的免疫应答。胞内运输信号的存在，会引导蛋白质定位于细胞中的某个部位，而在该部位可更有效地诱导所需的免疫应答。与用缺少胞内运输信号的类似遗传构建物所诱导的免疫应答相比，这样所导致的与变应原、病原体、或抗原或细胞反应的免疫应答得到了增强。
本发明可用于引发免疫应答，以针对与变应原、病原体或个体自身“异常”细胞特异性相关的蛋白的免疫应答。本发明可用于免疫个体以抵抗变应原或病原性物质和生物体，由此，针对某病原体蛋白的免疫应答可提供抵抗该病原体的保护性免疫力。本发明可用于抵抗超增殖性疾病和紊乱(例如癌症)，即通过引发针对与超增殖细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答。本发明可用于抵抗自身免疫疾病和紊乱，即通过引发针对与涉及自身免疫病的细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答。
根据本发明，DNA编码免疫原性靶蛋白，该蛋白或者连于胞内运输信号序列，或者该蛋白是包含胞内运输序列的肽序列。作为细胞正常蛋白质加工的一部分，信号序列会被切除。此外，编码免疫原性靶蛋白的DNA可在蛋白质的编码序列中包含胞内运输序列。DNA表达所需的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，遗传构建物中还可包含诸如Kozak区之类的其它元件。
如本文所用，“可表达形式”表示这样的基因构建物，它包含与编码免疫原性靶蛋白的编码序列操作性连接的必需调控元件，从而当位于个体细胞内时，能够表达编码序列。
如本文所用，“共(享)有一个表位”表示某蛋白质含有至少一个与另一蛋白的表位完全相同或基本相似的表位。
如本文所用，“基本相似的表位”表示所述表位所具有的结构与某蛋白表位不完全相同，但是能够引发与该蛋白发生交叉反应的细胞或体液免疫应答。
遗传构建物包含一段核苷酸序列，它编码靶蛋白和/或免疫调节蛋白，它包含与基因表达所需的调控元件操作性连接的胞内运输序列。
当遗传构建物被细胞摄入时，它们留在细胞内作为功能性的染色体外分子，和/或整合到细胞的染色体DNA中。可以将DNA引入细胞，使其在细胞中仍为质粒形式的独立遗传物质。或者，可将能与染色体整合的线性DNA引入细胞。在将DNA引入细胞时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。也可以在DNA分子内包含促进整合的DNA序列。或者，可以将RNA施用于细胞。也可以考虑提供线性小染色体形式的遗传构建物，它具有着丝粒、端粒和复制起始位点。基因构建物可以作为活在细胞内的减毒活疫苗或重组微生物载体中遗传物质的一部分。基因构建物可以是重组病毒疫苗基因组的一部分，其中遗传物质或者整合到细胞染色体内，或者仍留在染色体外。
遗传构建物包括核酸分子进行基因表达时所必需的调控元件。这些元件包括启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，为了编码免疫原性靶蛋白的序列的基因表达，常需要增强子。这些元件必须与编码所需蛋白的序列操作性连接(可操作地连接)，而且这些调控元件在作为给予对象的个体内有效(可操作)。
起始密码子和终止密码子一般被认为是编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，这些元件在给予基因构建物的个体内必须是可发挥功能的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列处于相同读码框。
所用的启动子和聚腺苷酸化信号在个体的细胞内必须是有功能的。
可用于实施本发明，尤其是用于生产人用遗传疫苗的启动子实例，包括但不限于猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子例如HIV长末端重复序列启动子(LTR)、莫洛尼氏(Moloney)病毒启动子、ALV启动子、巨噬细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒启动子、罗丝肉瘤病毒(RSV)启动子和来自人基因的启动子，如来自人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和人金属硫蛋白等人基因的启动子。
可用于实施本发明，尤其是用于生产人用遗传疫苗的聚腺苷酸化信号的实例，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。具体地，使用的是位于pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego，CA)内的SV40聚腺苷酸化信号，文中称为SV40聚腺苷酸化信号。
除了DNA表达所需的调控元件外，DNA分子内还可以包含其它元件。这些其它元件包括增强子。增强子可以选自但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸，以及诸如来自CMV、RSV和EBV等的病毒增强子。
为了使构建物保留在染色体外并在细胞内产生多拷贝的构建物，可以使遗传构建物具有哺乳动物复制起始位点。Invitrogen(San Diego CA)的质粒pCEP4和pREP4，含有EB病毒复制起始位点和核抗原EBNA-1的编码区域，它们不发生整合，而是产生高拷贝游离型复制产物。
在有关免疫应用的较好实施方案中，被输送的核酸分子包括编码靶蛋白、IL-2蛋白和其他额外蛋白质基因(该额外蛋白质基因进一步加强针对该靶蛋白免疫应答)的核苷酸序列。这类基因来自例如编码细胞因子和淋巴因子的基因，所述的因子有例如α干扰素、γ干扰素、血细胞衍生生长因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2。在有些实施方案中，在用于免疫组合物的遗传构建物中宜包含GM-CSF基因。
如果出于某种理由需要消灭接受了遗传构建物的细胞，可以加入其他元件以作为摧毁细胞的靶目标。可以在遗传构建物中包含处于可表达形式的疱疹腺苷激酶(tk)基因。可以给个体施用药物9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gangcyclovir，简称GCV)，该药将选择性地杀灭所有产生tk的细胞，由此提供了选择性摧毁具有遗传构建物的细胞的手段。
为了尽可能扩大蛋白质的生产，可以选择调控序列使得它们非常适合在施用了构建物的细胞内表达基因。而且，可以选用在细胞内转录效率最高的密码子。本领域一般技术人员能够制造在细胞内具有功能的DNA构建物。
本发明方法包括步骤将核酸分子施用于个体的组织。在优选的实施方案中，核酸分子的给药途径是肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药，或通过灌洗而用于选自下组的粘膜组织阴道、直肠、尿道、口腔和舌下。
在有些实施方案中，将核酸分子与促进剂(facilitating agent)一起施用于细胞。促进剂又称多核苷酸功能增强子或遗传疫苗促进剂。有关促进剂的描述，可参见1993年1月26日提交的美国专利申请08/008,342、1993年3月11日提交的美国专利申请08/029,336、1993年9月21日提交的美国专利申请08/125,012和1994年1月26日提交的国际专利申请PCT/US94/00899，这些申请均被本文引用作为参考。此外，促进剂还被描述于1995年3月30日提交的PCT/US95/04071，该申请被本文引用作为参考。与核酸分子联用的促进剂，可以以与核酸分子形成的混合物形式来施用，也可以在施用核酸分子的同时、之前或之后单独施用。此外，具有转染剂(transfecting agent)和/或复制剂和/或促炎剂(inflammatory agent)作用的，以及可以在有或没有促进剂时同时给药的其它物质包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，例如α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2，以及成纤维细胞生长因子、诸如免疫刺激性复合物(ISCOMS)之类表面活性剂、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酸脂A(monophosphoryl Lipid A，MPL))/胞壁酰肽、醌类似物和诸如角鲨烯和角鲨烯之类的泡囊(vesicle)。透明质酸也可以与遗传构建物联用。
在优选的实施方案中，本发明遗传构建物可与选自下组的促进剂配制在一起或联用苯甲酸酯、酰替苯胺、脒、氨基甲酸乙酯以及它们的盐酸盐，例如局部麻醉剂家族的那些种类。
在一些优选实施方案中的促进剂可以是具有以下结构之一的化合物Ar-R1-O-R2-R3或 Ar-N-R1-R2-R3或 R4-N-R5-R6或 R4-O-R1-N-R7式中，Ar是苯、对氨基苯、间氨基苯、邻氨基苯、取代的苯、取代的对氨基苯、取代的间氨基苯、取代的邻氨基苯，其中在氨基苯化合物中的氨基可以是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺，而取代化合物中的取代基是卤素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基；R1是C＝O；
R2是C1-C10烷基，包括支链烷基；R3是氢原子、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺；R2+R3可形成环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R4是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基，环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R5是C＝NH；R6是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R7是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基、环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)。
酯的实例包括苯甲酸酯，例如哌罗卡因、美普卡因和异布卡因；对氨基苯甲酸酯，例如普鲁卡因、丁卡因、丁胺卡因、丙氧卡因和氯普鲁卡因；间氨基苯甲酸酯，例如美布他明和primacaine；和对乙氧基苯甲酸酯，例如对乙氧卡因。酰替苯胺的实例包括利多卡因、依替卡因、甲哌卡因、布比卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。此类化合物的其它实例包括辛可卡因、苯佐卡因、达克罗宁、普莫卡因、丙美卡因、布它卡因、奥布卡因、卡波卡因、甲基布比卡因、苦味酸butasin、非那卡因、diothan、luccaine、intracaine、nupercaine、美布卡因、匹多卡因、珍尼柳酯和源自植物的二环化合物，例如可卡因、肉桂酰可卡因、吐昔林和cocaethlene，以及所有以上物质与盐酸形成的化合物。
在优选实施方案中，促进剂是布比卡因。布比卡因与甲哌卡因的区别在于布比卡因用N-丁基代替了甲哌卡因中的N-甲基。化合物在该N位上可以有C1-C10。化合物可以被卤素取代，例如普鲁卡因和氯普鲁卡因。较好的是酰替苯胺(anilide)。
促进剂在遗传构建物之前、同时或之后给予。可以将促进剂与遗传构建物配制在同一组合物中。
布比卡因-盐酸的化学名称是2-哌啶甲酰胺(2-piperidinecarboxamide)，1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-一盐酸，一水合物，其市场来源广泛，可从包括AstraPharmaceutical Product Inc.(Westboro，MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York，NY)，Eastman Kodak(Rochester，NY)等渠道购得以用于药物用途。市售的布比卡因有时与羟苯甲酸甲酯和肾上腺素配制在一起，有时则不。以上所述的制剂均可使用。购来用于药用的浓度为0.25％，0.5％和0.75％，这些可用于本发明。如果需要，可以配制引发所需效果的其它浓度，尤其是0.05％至1.0％之间的浓度。根据本发明，可给予约250μg至10mg布比卡因。在有些实施方案中，可给予约250μg至7.5mg。在有些实施方案中，可给予约0.05mg至5.0mg。在有些实施方案中，可给予约0.5mg至3.0mg。在有些实施方案中，可给予约5至50μg。例如，在有些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在施用疫苗的同一部位施用约50μl至2ml，较好的是约50μl至1500μl，更好的是约1ml配制在等渗药用载体内的0.25-0.50％盐酸布比卡因和0.1％羟苯甲酸甲酯溶液。类似地，在有些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在施用疫苗的同一部位施用约50μl至2ml，较好地约50μl至1500μl，更好地约1ml配制在等渗药用载体内的0.25-0.50％盐酸布比卡因溶液。布比卡因和任何其它作用类似的化合物，尤其是相关的局部麻醉剂家族中的那些化合物，可以在能够有助于细胞摄入遗传构建物的浓度下进行施用。
在本发明的有些实施方案中，在给予遗传构建物之前，先给个体注射促进剂。即，在给予遗传构建物之前约1周至10天之内，先给个体注射促进剂。在有些实施方案中，在给予遗传构建物之前或之后的约1至5天，有时是24小时给个体注射促进剂。或者，只要被使用，促进剂可以在给予遗传构建物的同时、或之前或之后的几分钟内进行施用。所以，可将促进剂与遗传构建物合并在同一药物组合物中。
在有些实施方案中，可给予遗传构建物而不给予促进剂。即，使用不含促进剂的制剂，并且使用不将遗传构建物与促进剂联用的给药方案。
本发明中输送给细胞的核酸分子可以作为蛋白质的遗传模板，而所述蛋白的功能就是预防性和/或治疗性免疫剂。在优选的实施方案中，核酸分子包含在动物细胞内转录和翻译编码序列所必需的调控序列。
本发明可用于免疫个体以抵抗病原体，例如病毒、原核生物和病原性真核生物如单细胞病原体和多细胞寄生虫。本发明特别适用于免疫个体以抵抗感染细胞的病原体和无包被(not encapculated)的病原，例如病毒和诸如淋病、李斯特氏菌属(listeria)和志贺氏菌属(shigella)之类的原核生物。此外，本发明还可用于免疫个体以抵抗原生动物病原体，这些病原体在其生命周期内有一阶段是胞内病原体。“胞内病原体”在此表示这样的病毒或病原体，在其繁殖或生命周期中至少部分时期是在宿主细胞内的，并在宿主细胞内产生或导致产生病原蛋白。表1列出了可根据本发明制备针对性疫苗的部分病毒的科和属。在疫苗中可使用这样的DNA构建物，它们所含的DNA序列编码多肽，该多肽具有至少一个表位与病原抗原(例如表中所列出的那些抗原)上的表位完全相同或基本相似。而且，本发明还可用于免疫个体以抵抗其它病原体，其中包括原核和真核的原生动物病原体以及多细胞寄生虫，例如表2所列的那些。
为了生产提供免受病原体感染保护作用的遗传疫苗，必须在遗传构建物中包含编码免疫原性蛋白的遗传物质以作为靶蛋白编码序列，所述的免疫原性蛋白能够引起针对它的保护性免疫应答。不论病原体是胞内感染(对于胞内感染，本发明尤其适用)，还是胞外感染，不可能所有的病原体抗原都引发保护性应答。因为DNA和RNA都较小，而且较容易生产，本发明的优点还在于可以用多种病原体抗原进行免疫接种。用于遗传疫苗的遗传构建物可以包括编码多种病原体抗原的遗传物质。例如，可将数个病毒基因包括在同一构建物中，由此提供多个靶目标。
表1和表2列出了部分病原性物质或生物体，可以制备针对它们的疫苗以保护个体免受它们的感染。在部分优选实施方案中，免疫个体以抵抗病原体的方法可针对HIV、HTLV或HBV。
在本发明的另一方面，提供了一种给予基础广泛的保护性免疫应答以抵抗超增殖性细胞(这些细胞是超增殖性疾病的特征)的方法，还涉及治疗超增殖性疾病患者的方法。如本文所用，“超增殖性疾病”指以细胞超增殖为特征的疾病或紊乱。超增殖性疾病的例子包括各种形式的癌症和牛皮癣。
已经发现，将包含编码免疫原性“超增殖细胞”相关蛋白的核苷酸序列的遗传构建物引入个体细胞，会导致在个体的接种细胞内生成这些蛋白。如本文所用，“超增殖性相关蛋白”表示与超增殖性疾病相关的蛋白。为了免疫以抵抗超增殖性疾病，可给个体施用包含编码超增殖性疾病相关蛋白的核苷酸序列的遗传构建物。
为了使超增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶目标，该蛋白必需只在超增殖细胞内产生，或在超增殖细胞内产生的水平高于正常细胞。靶抗原包括这样的蛋白、其片段和肽，它们包含所述蛋白上的至少一个表位。有时，超增殖相关蛋白是编码某蛋白的基团发生突变的产物。突变基因编码的蛋白与正常蛋白几乎完全相同，仅有细微的氨基酸序列差异并产生了正常蛋白上所没有的不同表位。这样的靶蛋白包括由诸如myb，myc，fyn之类的癌基因和转位基因bcr/abl，ras，src，P53，neu，trk和EGRF等所编码的蛋白。除了作为靶抗原的癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护性治疗的靶蛋白还包括用B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区(它们有时还用于引导自身免疫病的抗原)。还可以使用其它肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，例如在肿瘤细胞内含量很高的蛋白，其中包括被单克隆抗体17-1A识别的蛋白和叶酸结合蛋白。
虽然本发明可用于免疫个体以抵抗一种或多种形式的癌症，本发明尤其适用于对个体进行预防性免疫，所述个体具有患某种癌症的倾向性或曾经患有癌症因而怀疑会复发。遗传学和技术以及流行病学的发展，已能够确定个体患癌症的可能性和进行风险评估。利用遗传筛选和/或家族健康史，可以预测某个体患上数种癌症中任何一种的可能性。
同样，那些已经患上了癌症的个体，以及接受治疗已去除癌症或处于缓和期的个体，尤其容易复发。作为治疗方案的组成部分，为了避免复发，可以针对已确诊的癌症对个体进行免疫。这样，一旦得知个体曾患有某种癌症并有可能复发，就可以对他们进行免疫，从而使得他们的免疫系统作好准备以抵抗任何将发生的癌症。
本发明提供了一种治疗患超增殖性疾病个体的方法。在这种方法中，引入遗传构建物起着免疫治疗的作用，即引导和促进个体的免疫系统以抵抗产生靶蛋白的超增殖细胞。
本发明提供了治疗患自身免疫疾病和失调的个体的方法，即提供基础广泛的保护性免疫应答，以抵抗与自身免疫相关的靶目标，其中包括细胞受体和产生导向于“自身”的(self-directed)抗体的细胞。
T细胞介导的自身免疫病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、Sjogren氏综合征、肉状瘤病、胰岛素依赖性糖尿病(ID DM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、僵硬性脊椎炎、硬皮病、多肌炎、皮肤肌炎、牛皮癣、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病、Crohn氏病和溃疡性结肠炎。上述疾病的特征均在于T细胞受体结合内源性抗原，由此引发与自身免疫病有关的炎性级联反应。针对T细胞可变区的免疫接种，可引发包括CTL在内的免疫应答，以消灭这些T细胞。
在类风湿性关节炎(RA)中，已经定性了数种参与该疾病的T细胞受体(TCR)的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。这样，用编码以上蛋白中至少一种蛋白的DNA构建物来免疫接种，将引发针对参与RA的T细胞的免疫应答。参见Howell，M.D.等，1991美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8810921-10925；Paliard，X.等人，1991，科学(Science)253325-329；Williams，W.V.，等人，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90326-333；以上文献均被本文引用作为参考。
在多发性硬化症(MS)中，已经确定了数种参与该疾病TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。这样，用编码以上蛋白中至少一种蛋白质的DNA构建物来免疫接种，将引发针对参与MS的T细胞的免疫应答。参见Wucherpfennig，K.W.等人，1990科学(Science)2481016-1019；Oksenberg，J.R.等人，1990，自然(Nature)345344-346；以上文献均被本文引用作为参考。
在硬皮病中，已经确定了数种参与该疾病的TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。这样，用编码以上蛋白中至少一种蛋白质的DNA构建物来接种免疫，将引发针对参与硬皮病的T细胞的免疫应答。
为了治疗患T细胞介导的自身免疫病(尤其是TCR可变区还是未知的疾病)的患者，可以进行滑液活检。可以获取存在的T细胞的样品，用标准技术鉴定TCR的可变区。利用以上信息就可以制备遗传疫苗。
B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)，格雷夫斯氏病，重症肌无力，自身免疫溶血性贫血，自身免疫性血小板减少、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆硬化和恶性贫血。上述疾病的特征均在于抗体结合于内源抗原，由此引发与自身免疫病相关的炎性级联反应。用针对这些抗体的可变区的免疫接种，将引发包括CTL在内的免疫应答，从而消灭这些产生抗体的B细胞。
为了治疗患B细胞介导的自身免疫病的患者，必需鉴定出参与自身免疫活性的那些抗体的可变区。可以进行活检，获取位于炎性反应部位的抗体样品。用标准技术鉴定这些抗体的可变区。利用这一信息就可以制备出遗传疫苗。
以SLE为例，一种抗原被认为是DNA。这样，对于待接受抗SLE免疫的患者，可对其血清进行抗DNA抗体的筛选，然后就能够制备出疫苗，该疫苗包含编码血清中发现的抗-DNA抗体的可变区的DNA构建物。
TCR和抗体两者可变区的一般结构特征是众所周知的。一般，可以利用公知技术来找到编码特定TCR或抗体的DNA序列，所述技术可参见Kabat等人，1987，免疫学上感兴趣蛋白质的序列(Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest)U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD，该文献在此引用作为参考。此外，克隆抗体的功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary，V.K.等人，1990，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)871066，该文献在此引用作为参考。
实施例实施例1肾源性(nephritogenic)自身抗体抗-DNA IL/IM该单克隆抗体是从衍生自MRL-lpr/lpr小鼠的杂交瘤大板(panel)(Vlahakos等人，1992，Kidney Int.41，1690-1700)上鉴别出的，因为它与从患肾炎的MRL-lpr/lpr小鼠肾脏洗脱出的Ig共享抗原结合特性。抗-DNA IL/IM是J558 VH基因家族的一种IgG2a抗体，其pI为5.1。抗-DNA IL/IM抗体特异性地结合于ssDNA、dsDNA、SmRNP和肾小球抽提物。在施用于正常的组织相容性小鼠后，抗-DNAIL/IM会在肾脏形成肾小球膜的、内皮下层的、和管腔内的免疫沉淀物。
当产生抗-DNA IL/IM的杂交瘤细胞被施用于组织相容性小鼠的腹腔内时，会产生大量的膜内的和管腔内的沉淀物，这与毛细管壁增厚、肾小球膜间位(interposition)和膨胀、动脉瘤膨胀和肾小球毛细袢的管腔内闭合、以及严重的蛋白尿等有关。尽管肾小球免疫沉淀物的形态学现象让人想起与冷球蛋白血症相关的现象，但是在携带抗-DNA IL/IM杂交瘤且具有高血清抗-DNA抗体活性的小鼠中，并没有检测到冷球蛋白或类风湿因子。肾小球免疫沉淀物的形成与毛细管壁增厚、肾小球膜间位(interposition)和膨胀、动脉瘤膨胀和肾小球毛细袢的管腔内闭合、以及严重的蛋白尿等有关。
在给出了其交叉反应特性和特征性的肾源性特征之后，考虑分析抗-DNAIL/IM是否通过与肾小球抗原的直接作用而形成免疫沉淀物。为了阐明这一可能性，对单克隆抗-DNA IgG2a抗体，抗-DNA IL/IM结合于肾小球细胞表面抗原的能力加以评估。在体内施用于正常小鼠后，抗-DNA IL/IM产生肾小球膜的、内皮下层的、和管腔内的免疫沉淀物。通过FACS，抗-DNA IL/IM(用杂交瘤编号H221来称呼)结合于肾小球膜的、管上皮的和主动脉上皮的细胞表面，而没有发现同种型匹配的抗-DNA抗体(该抗体不产生肾小球免疫沉淀物)与表面的结合。结果示于图1A、1B和1C(鼠内皮细胞是Dr.Fuad Ziyadeh(Renal Division，Universityof Pennsylvania)的惠赠)。
用抗DNA抗体对肾小球细胞的总细胞裂解液进行Western印迹分析，结果表明抗-DNA IL/IM可与多个条带反应，而不形成免疫沉淀物的抗-DNA抗体则不反应。在对细胞表面抗原进行生物素标记和用抗-DNA IL/IM进行免疫沉淀之后，在肾小球膜细胞裂解液中鉴别出一个100kD条带，该条带不能被同种型匹配的对照单克隆抗-DNA抗体所识别。
因此，这表明抗-DNA IL/IM单克隆抗体可结合于鼠肾脏的肾小球膜血小板和主动脉内皮细胞，因而鉴别出了一种候选的表面蛋白质靶目标。这显示了该单克隆抗体的多特异性抗原结合特性(这是病原性SLE抗体的共同特征)，因而在形成肾小球免疫沉淀的起始过程中可能负责与细胞表面抗原的结合。
对抗-DNA IL/IM(H221)进行了序列分析。在此给出了完整的VL-JL序列(SEQID NO4)和几乎完整的VH-DH-JH序列(SEQ ID NO6)。
H221VL-JL 序列 (SEQ ID NO4)GAC ATT GTG ATA TCA CAG TCT CCA TCC ACC CTG GCT GTG TCA GCA GGA GAG AAG GTC ACT ATG AACasp ile val ile ser gln ser pro ser thr leu ala val ser ala gly glu lys val thr met asnCDR ITGC AAA TCC AGT CAG AGT CTG TTC AAC AGT AGA ACC CGA AAG AAC TAC TTG GCT TGG TTC CAG CAGcyslys ser ser gln ser leu phe asn ser arg thr arg lys asn tyr leu alatrp phe gln glnCDR IIAAA CCA GGG CAG TCT CCT AAA CTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC CCT GATlys pro gly gln ser pro lys leu leu ile tyrtrp ala ser thr arg glu sergly val pro aspCGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GACarg phe thr gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser val gln ala glu aspCDR IIICTG GCA GTT TAT TAC TGC AAG CAA TCT TAT TAT CTT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AGG CTG GAAleu ala val tyr tyr cyslys gln ser tyr tyr leu arg thrphe gly gly gly thr arg leu gluH221 VH-DH-JH 序列 (SEQ ID NO6)GAG GTC CAG CTG CAG CAG CCT GGT GCT GAA CTT GTG AAG TCT GGG GCC TCA GTG AAG CTGglu val gln leu gln gln pro gly ala glu leu val lys ser gly ala ser val lys leuCDR ITCC TGC AAG GCT TCT GAC TTC ACT TTC ACC AGC TAC TGG ATA AAC TGG GTG AAA CAG AGGser cys lys ala ser asp phe thr phe thrser tyr trp ile asntrp val lys gln argCDR IICCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA AAA TTT TAT CCT GGT AGT GGT ACT ATT AAC TACpro gly gln gly leu glu trp ile glylys phe tyr pro gly ser gly thr ile asn tyrAGT GAA AAT TTT AAG AAA AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGT ACA TCC TACser glu asn phe lys lyslys ala thr leu thr val asp thr ser ser ser thr ser tyrATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAC GAC TCT GCG GTC TAT TAT TGT GCA AGA GAA CGTmet gln leu ser ser leu thr ser asp asp ser ala val tyr tyr cys ala argglu argCDR IIICTC CTG GGG TTT GTT TAT TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT ACA GCC AAA ACAleu leu gly phe val tyrtrp gly gln gly thr leu val thr val ser thr ala lys thrACA GCC CCA TCG GTC TAT CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGC ACTthr ala pro ser val tyr arg gly ser ser arg val asp leu gln ala cys lys leu gly thr结果证实，抗-DNA IL/IM(H221)是J558 VH家族的一个成员，并且它提供了进行“研究设计和方法”章节中所述试验的材料。额外的序列分析正在进行以完成重链的序列。
进行针对抗-DNA IL/IM的遗传免疫接种进行了初步试验，即用编码抗-DNA IL/IM VH或Fv区的DNA构建物来免疫AKR×DBA/2小鼠，然后用致死剂量的亲代杂交瘤细胞来攻击它们。简而言之，如图2A所示，将VH或Fv区克隆入遗传免疫载体中并将V区置于CMV启动子的控制之下。如图2B所示，V区被定向于细胞膜、或被分泌、或留在胞质中、或用腺病毒E19蛋白ER保留信号而留在内质网中。还开发了定向于溶酶体的构建物。
Biocca，S.等人，1990，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)9101-108描述了定位于细胞膜、被分泌、胞质定位，该文献在此引用作为参考。Nilsson等人，1989，细胞(Cell)58707-718，Jackson等人，1993，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)121(2)317-333和Jackson等人，1990，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)93153-3162描述了用腺病毒E19蛋白ER保留信号，将蛋白质留在内质网。Letourneur，F.和R.D.Klausner 1992，细胞(Cell)691143-1157描述了将蛋白质导向溶酶体。
在初步试验中，在用布比卡因预处理后，将纯化的质粒DNA接种于小鼠。在数次加强免疫之后，评估小鼠的抗体应答。对照包括杀死的杂交瘤细胞和纯化的抗体Fv区。这些免疫原中没有一种能够引发针对抗-DNA IL/IM Fab片段的血清应答(用标记的葡萄球菌G蛋白进行检测)。在初步研究中，用数种构建物来引发增殖性和细胞毒性T细胞应答。选择出最佳的构建物，在更大的小鼠组中进行评估。用100微克质粒DNA和布比卡因同时来免疫各组一次，每组有4只AKR×DBA/2小鼠。一周后，杀死小鼠，评估细胞毒性T细胞和增殖反应。增殖是这样评估的用纯化的H221单克隆抗体(25或5＝B5g/孔)或用20,000或100,000杀灭的抗-DNA IL/IM杂交瘤细胞刺激免疫脾细胞72小时，然后用含氚的胸苷脉冲过夜。结果示于图3。
最佳的增殖反应是由杀灭的杂交瘤细胞所引发的。对于大多数构建物都观察到了可观的反应(仅与载体比较)，但是在程度上仅仅是适度而已。对于用杀灭细胞或用导向于内质网的疫苗所免疫的小鼠，针对纯化单克隆抗体的增殖反应是显著的(与主轴(backbone)对照相比，超过2倍标准差)。对于用导向于内质网的疫苗和用VH-可溶型且VH-胞质型疫苗两者，针对杂交瘤细胞的增殖反应是显著的(与主轴(backbone)对照相比，超过2倍标准差)。与之相反，引导的CTL应答是惊人的。这些结果示于图4A、4B和4C。
在杀灭的抗-DNA IL/IM刺激物(脾细胞与刺激物之比为20∶1)存在下，培养免疫脾细胞7天，其中在前2天存在伴刀豆球蛋白A，然后仅与刺激物一起培养。用51Cr标记抗-DNA IL/IM杂交瘤细胞，在圆底微量滴定板中测定裂解情况。对于各种不同的效应子∶靶目标之比，显示出了平均值＝B1标准差％特异性裂解(如上对CD4所示的那样)。有趣的是，与作为测试中阳性对照的杀灭细胞相比，除了一种构建物(可溶的重链V区或VHsol)之外，所有的构建物都同等地或更佳地引发CTL活性。具体地，对于胞质和ER导向型构建物，观察到了异常出色的应答。这表明，导向于这些区室(compartment)可以加强观察到的CTL应答。
这些结果表明，大多数评估的DNA疫苗可引导从良好至优秀的CTL应答。该试验可作为该策略的一个例子，该策略可用于选择具体疫苗以进行研究并排除其他疫苗。因此，定向于胞质的Fv构建物所引发的CTL应答明显高于其他构建物(＞2倍标准差)。根据这一分析，该疫苗值得进一步评估。类似地，VH可溶性疫苗并不引发良好的CTL应答。因此，该疫苗可以被剔除而不必进一步评估，因为根据在CD4系统中所建立的假设，预计它不会引发保护性的应答。
对于该疫苗额外试验揭示，情况的确如此。在该试验中，用100＝B5g的DNA疫苗免疫各组3次，每组有5或6只小鼠。然后用抗-DNA IL/IM杂交瘤细胞对它们进行腹腔内攻击。4周后，当肿瘤在对照动物中出现时，所有的小鼠都被杀死，并评估肿瘤负荷和腹水数量。还定量分析了患肿瘤的小鼠的比例。这些结果示于图5A、5B和5C。
图5A显示患肿瘤的小鼠比例。图5B显示了在各组的平均肿瘤质量和每只小鼠的具体值。类似地，图5C显示了获得的恶性腹水的体积。注意，在该具体试验中，用杀灭的细胞所免疫的小鼠(我们的阳性对照)与仅用载体免疫的小鼠(我们的阴性对照)相比，在各方面都没有很大差异。尽管如此，数种DNA疫苗显示出明显的保护力，尤其是Fv胞质定向型疫苗以及Fv和VH两者的内质网(ER)定向型疫苗。这与这些疫苗引发CTL应答的能力具有很好的吻合性。VH可溶性疫苗不表现出保护力，这与它不显示CTL活性是相一致的。
实施例2有数种人类疾病与B细胞和T细胞的病理性增殖有关。这包括恶性或超增殖性疾病例如淋巴瘤和白血病，以及自身免疫疾病如全身性红斑狼疮(SLE)(其中致病的自身抗体导致组织受损)。这些疾病的目前治疗手段是不够的，治疗常伴有发生率高的副作用。一种更合逻辑的治疗这些疾病的方法是特异性地消除致病细胞。这可以通过主动性的、针对其可变区的免疫治疗而实现。针对V区的主动免疫有消除致病细胞的潜在可能。此外，通过引发保护性免疫，可以消除致病克隆的再次出现。然而，由免疫所引发免疫应答，也有可能会产生不利的后果。例如，针对产生B细胞V区的自身抗体的理想化免疫，应引发细胞毒性T细胞(CTL)应答以消除致病的B细胞，从而限制自身抗体的产生。但是，如果引发了辅助性T细胞(即TH2型应答)，那么自身抗体的产生事实上会增加，从而有害于病人。因此，针对致病的B细胞或T细胞V区的主动免疫应当被设计成引发所需的免疫应答(如CTL应答)，同时又限制潜在不利的应答(如TH2应答)。
针对自身抗体V区的DNA免疫接种，如下进行评估。产生自身抗体的杂交瘤抗-DNA IL/IM(也称为H221)是从衍生自MRL-lpr/lpr小鼠的杂交瘤大板(panel)上选出的；当产生抗-DNA IL/IM的杂交瘤细胞被施用于组织相容性小鼠的腹腔内时，导致了肾小球性肾炎，其特征是大量膜内的和管腔内的沉淀物，这与毛细管壁增厚、肾小球膜间位(interposition)和膨胀、动脉瘤膨胀和肾小球毛细袢的管腔内闭合、以及严重的蛋白尿等有关。这就提供一种体内系统，在该系统中可以评估独特型DNA免疫接种在引发保护性免疫方面的效力。为了调查增强这些DNA疫苗免疫原性的可能性，将基因表达导向于特定的胞内或胞外区室(导向胞质、导向内质网(ER)以便分泌和导向ER以便保留)。采用了针对单个V区(VH区)和针对整个Fv(VH与VL相连)片段的免疫接种。结果表明，针对H221 VH和Fv区的DNA接种会引发特异性的细胞免疫应答，尤其是强效的CTL应答，并且通过将待表达的V区引导至胞质或保留在ER中，使CTL活性得以增强。此外，独特型DNA免疫接种引发了针对H221细胞的保护性免疫，尤其是当基因产物被引导至保留在ER中时。
材料和方法DNA构建物pBBkan是一种真核表达载体，它用CMV启动子和RSV增强子来指导转录(图8)。它最初是这样进行修饰将来自小鼠IgG的分泌前导序列或细胞质前导序列亚克隆入多克隆位点的NotI和XbaI位点之间。具有分泌前导序列的载体是分泌型和ER保留型疫苗的亲代载体。同样，具有细胞质前导序列的载体是胞质表达型疫苗的亲代载体。H221的VH和VL区通过聚合酶链反应(PCR)扩增，并使用重组PCR来产生Fv编码序列(Srikatan等人，1994，AIDS 81525-32，该文献在此引用作为参考)。将XbaI限制性位点引入单个重链产物的5′端和κ-轻链产物(Fv)的5′端。PCR产物被限制性消化，然后通过标准的苯酚-氯仿抽提法从2％低熔点琼脂糖纯化出，再凝胶纯化，然后或者直接连入载体(与前导序列一起连入)，或者连于其他片段并用作模板进行进一步PCR反应，从而按所示的拼接于3′导向序列(CD4 TM拼接于E19，Fv或VH拼接于CD4-E19)。E19信号序列是从CD8-E19上扩增出的(Nilsson等人，1989，细胞(Cell)58707-718，该文献在此引用作为参考)。使用的引物列于表3。在表4中列出了下列物质的氨基酸序列免疫球蛋白前导序列(用于分泌或保留的ER导向)(SEQ ID NO22)、胞质前导序列(SEQ ID NO23)、H221 VL区(SEQ ID NO24)、接头肽(SEQ ID NO25)、H221 VH区(SEQ IDNO26)和CD4跨膜和E19细胞质结合域(用于保留于ER)(SEQ ID NO27)。免疫球蛋白前导序列(SEQ ID NO22)是鼠的免疫球蛋白前导序列，它被用于将基因产物引导至内质网以便被分泌或保留。胞质前导序列(SEQ ID NO23)是一种早已报道的用于在胞内表达抗体的序列(Biocca等人，1990欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)，9101-108，该文献在此引用作为参考)。VH和VL序列(分别为SEQ IDNO24和SEQ ID NO26)是在PCR产物的克隆之后确定的。接头肽(SEQ ID NO25)被用于功能性地表达Fv区。将人CD4跨膜区与腺病毒E19导向序列合二为一，以用于ER保留(SEQ ID NO27)。
这些PCR产物被克隆入pBBkan中，然后转入DH5α大肠杆菌(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg，MD)中。用ABI荧光测序试剂盒(AppliedBiosystems Inc.，Foster City，CA)对具有正确限制性图谱的克隆进行测序。按试剂盒说明书，对产物进行纯化和干燥，然后由宾西法尼亚大学癌症中心核心测序研究所(University of Pennsylvania Cancer Center Core Sequencing Facility)进行凝胶电泳和分析。序列分析揭示，H221采用了J558 VH和JH3基因，并与VK1基因配对。载体、构建物和插入片段序列示于图8和表4。质粒制备物在超级肉汤培养基(Super Broth)(1.2％w/v Difco胰蛋白胨、2.4％w/v Difco酵母提取物、0.5％v/v甘油、72mM磷酸氢二钾、28mM磷酸二氢钾)中生长，然后根据制造商的方案用Qiagen 500端头(tips)(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)进行纯化。在布比卡因预处理后(Wang等人，1993，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904156-4160，该文献在此引用作为参考)，进行DNA免疫接种。
增殖分析在无菌方式下，取出免疫接种小鼠的各脾脏，在RMPI中轻柔地使之破裂，用Gey′s溶液进行处理以裂解红细胞。将脾细胞接种至96孔平圆底的组织培养板(Falcon 3072；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，每孔为500,000个细胞，终体积为200微升。将一式三份的孔暴露于仅培养基、2微克/毫升伴刀豆球蛋白A、5和25微克/毫升H221单克隆抗体、以及5∶1或25∶1(脾细胞∶刺激物)用丝裂霉素C杀伤过的H221杂交瘤细胞。在37℃，用25微克/毫升丝裂霉素C在PBS中处理106杂交瘤细胞/毫升45分钟，然后用PBS洗涤3次以去除毒素。在37％和5％二氧化碳下培养3天之后，将1μCi含氚胸苷(NEN Life Sciences，Boston，MA)加至20微升培养液中，18小时后，在Tomtec Harvester 96(Tomtec，Orange，CT)上收获平板。过滤物(filtermats)被干燥，然后用Microbeta 1450闪烁计数器(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)对β闪烁进行计数，细胞毒性T细胞分析将5×105/毫升的脾细胞与2微克/毫升伴刀豆球蛋白A和丝裂霉素C处理过的刺激物(脾细胞与刺激物之比为20∶1)一起培养24小时，然后更换培养基以去除促细胞分裂素。培养4天后，将细胞收集入10毫升培养基中，在Ficoll上于1500g离心20分钟。接着，细胞被计数，然后按下列效应子∶靶细胞之比，与数目固定的靶细胞一起接种于各圆底孔中100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1。靶细胞是这样制备的将107个活的H221细胞再悬浮于250微升培养基中，然后加入75μCi51Cr-铬酸钠(NEN/Life Sciences，Boston，MA)，然后在室温下孵育2小时。然后，用RPMI完全培养基洗涤这些细胞3次，并再悬浮以进行平板接种。平板在800rpm离心2分钟，然后在37℃孵育5和16小时，在5和16小时时小心地取出50微升上清液，用Optiphase闪烁流体(Wallace Inc.，Gaithersburg，MD)在闪烁计数器中进行计数。特异性裂解百分比按下式进行计算
(自发释放是仅在培养基中孵育的细胞所释放的cpm，而总释放是通过在1％SDS中孵育而使全部靶细胞裂解所释放的cpm)。
体内肿瘤攻击在3次DNA接种的最后一次时，用降植烷(1毫升，腹腔内)对小鼠进行致敏。一周后，对小鼠(6只/组)腹腔内注射106个活H221杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞已洗涤过2次，并以107细胞/毫升的浓度再悬浮于无菌PBS中。在前2周内每周检查小鼠是否有肿瘤生长的信号(可触摸的肿块或腹水)，随后每2周检查一次。在攻击后4周时，杀死小鼠，解剖下肿瘤块，并称重以确定肿瘤质量。在有恶性腹水的小鼠中，腹水的细胞内含物也被称重并加入到肿瘤质量中。
抗-DNA抗体分析用抗-dsDNA ELISA法(Madaio等人，1984，免疫学杂志(J.Immunol.).132872，该文献在此引用作为参考)。
结果独特型DNA免疫接种引发特异性的免疫应答在初步试验中，将纯化的质粒DNA接种入AKR×DBA/2小鼠中，在数次加强免疫之后，评估小鼠的细胞和体液免疫应答。对照包括杀灭的杂交瘤细胞和纯化的H221单克隆抗体。在检测不到的针对抗-DNA IL/IM Fab片段的血清学应答的情况下(用标记的链球菌G蛋白进行检测)，用构建物可引发淋巴细胞增殖性和细胞毒性T细胞应答这两种针对H221细胞的应答。细胞免疫应答被进一步仔细地评估。对于每组4只AKR×DBA/2小鼠的各组，用质粒DNA和盐酸布比卡因同时接种一次。一周后，杀死小鼠，评估其细胞毒性T细胞和增殖反应。结果示于图9和10。
在评估单次DNA接种后脾细胞的增殖反应的试验中，用100微克DNA和0.25％布比卡因接种小鼠一次。在一周后，取出脾细胞，或者仅与培养基一起孵育，或者与杀灭的H221细胞一起孵育，或者与H221 Fab一起孵育。通过用纯化的H221单克隆抗体(25或5微克/孔)，或用杀灭的抗-DNA IL/IM杂交瘤细胞(20,000或100,000细胞/孔)刺激免疫脾细胞，来评估增殖情况。阳性对照是用杀灭的H221细胞(杀灭的细胞)进行接种，阴性对照是仅用载体进行接种。在培养3天后，细胞用含氚胸苷脉冲过夜，然后测定掺入情况的每分钟计数(cpm)。对于2种浓度的Fab和2种浓度杀灭的H221细胞，给出了一式三份的孔的平均值ΔCPM(试验值减去仅培养基时的值)±标准差。结果示于图9。
在评估单次DNA接种后细胞毒性T细胞(CTL)应答的试验中，用100微克DNA和0.25％布比卡因接种小鼠一次。在一周后，取出脾细胞，与伴刀豆球蛋白A和杀灭的H221细胞(效应子∶沉积物之比为20∶1)一起孵育。24-48小时后，除去伴刀豆球蛋白A，加入细胞并再继续培养，总共培养5天。阳性对照w是用杀灭的H221细胞(杀灭的细胞)进行接种，阴性对照是仅用载体进行接种。在培养5天后，通过非连续梯度离心分离出效应细胞，然后用于在不同比例下裂解经51Cr标记的靶细胞。特异性裂解百分比如“材料和方法”章节中所述的那样进行计算。对于一式三份的测量值，给出了特异性裂解百分比的平均值±标准差。结果示于图9。在全部3张图中，都显示对照(杀灭的H221细胞和单用载体的情况)以供参照。结果示于图10A、10B和10C。
与其他试验相同，最佳的增殖反应是由杀灭的杂交瘤细胞所引发的(图9)。对于大多数构建物，可观察到可检测的应答(与单用载体相比)，但是程度很轻。对于用杀灭的细胞或用ER-保留型疫苗免疫的小鼠，针对纯化mAb的增殖反应是显著的(与主轴(backbone)对照相比，超过2倍标准差)。对于ER-保留型疫苗和VH可溶且VH-胞质型疫苗两者，针对杂交瘤细胞的增殖反应是显著的(与主轴(backbone)对照相比，超过2倍标准差)。
与之相反，引导的CTL应答是惊人的(图10)。除了可溶的重链V区(VHsol)这种构建物之外，所有的构建物都与作为测试中阳性对照的杀灭的细胞同等良好地或更佳地引发CTL活性。在其他试验中，与对照相比，VHsol可引发显著的CTL应答(在100∶1的效应子∶靶细胞之比时，在典型试验中VHsol和对照的特异性裂解百分比分别为22％和10％)。对于胞质型和ER引导型构建物，观察到了优异的应答，这表明引导至这些区室可加强CTL应答。除了ER-保留型疫苗之外，Fv构建物通常可引发更强的CTL。
防止杂交瘤攻击的保护作用为了评估这些DNA疫苗在防止产生自身抗体的杂交瘤细胞进行体内攻击方面的保护效力，用100微克DNA疫苗和布比卡因，按2周一次的间隔，对每组5-6只小鼠的各组进行免疫。用活的抗-DNA IL/IM杂交瘤细胞(H221细胞)腹腔内攻击小鼠。4周后，评估小鼠的肿瘤负荷和腹水。所有具有肿瘤或腹水的小鼠都被杀死，切下肿瘤，测定肿瘤负荷。结果示于图11A和11B。图11A显示了各接种组的肿瘤质量。平均值显示于柱状图中，并重迭标出了各小鼠的测量值。图11B显示了在4周时，各组中患质量的小鼠比例。以肿瘤负荷平均值的下降为证据，显示出数种DNA疫苗有特异性效果。与杀灭细胞接种组的3/6和接受载体的对照组的2/5相比，Fv和VHER保留型疫苗分别在6/6和4/5小鼠组中防止了肿瘤的形成。
与基线应答相比，几乎所有被评估的小鼠都显示出血清抗-DNA效价的增加。对于这个参数在各组之间没有显著差异，尽管与单用载体相比，用FvER-保留型疫苗免疫的组中观察到抗-DNA水平较低(对于FvER-保留型疫苗，效价增加为0.83±0.41，而载体对照组小鼠中为1.6±0.55，p＝0.025，Student′s t-测试)。因此，最强的疫苗的确显著降低了该模型动物中循环的抗-DNA的水平。
在存活者中的免疫应答在肿瘤攻击后存活的数只小鼠中，评估它们对杀灭的H221细胞的CTL活性和增殖情况。这包括了3只用杀灭的细胞免疫的小鼠，3只用胞质Fv构建物免疫的小鼠，和3只用ER-保留型Fv构建物免疫的小鼠。在5周时(在开始肿瘤攻击后的38天)，杀死小鼠，并且如图9所述，测定脾细胞对于杀灭的H221细胞的增殖反应。对于各小鼠，显示了一式三份的孔的平均CPM，并根据所接受的疫苗进行标示。CTL应答有所下降(小鼠没有在分析之前进行加强免疫)，其中在用ER保留型构建物免疫的小鼠中观察到最高的应答(在50∶1的效应子∶靶细胞之比下，特异性裂解为13％)，但是在其他小鼠中观察到类似应答(在用杀灭的细胞免疫的小鼠中为7％在用Fv胞质型构建物免疫的小鼠中为7％)。与之相反，增殖反应仍强烈(图12)。最初用杀灭的细胞或用胞质导向型Fv构建物免疫的小鼠，在体外对杀灭的H221细胞有应答(与单用培养基的对照(721±409和5,044±1,902)相比，CPM平均值分别为7,488±5,864和6,663±4,171)。相反，最初用ER保留型Fv构建物免疫的那些小鼠，在体外对杀灭的H221细胞有应答(与单用培养基的4,651±1,345)相比，CPM平均值为37,351±9,004)。这一强烈的增殖反应通过平行培养物中IL-2产量增加而得以反映(与用杀灭的细胞免疫的培养物相比，在用Fv内质网保留型疫苗免疫的培养物中，IL-2产量平均高2倍)。同时，这些结果显示，在用Fv内质网保留型疫苗免疫并且攻击后存活的小鼠中，有强的细胞增殖反应。
讨论这些研究表明，在没有可检测的体液免疫应答的情况下，独特型DNA免疫接种能够引发细胞免疫应答。此外，对于大多数评估的疫苗，CTL应答水平相当于或超过了用杀灭细胞所引发的CTL应答(图10)。然而，与杀灭细胞型疫苗相反，在DNA免疫接种后几乎检测不到增殖反应(这通常与TH应答相关)(图9)。因此，可以用独特型DNA免疫接种来引发强CTL应答，而同时仅引发轻微的TH应答。这可以研究CTL在引导保护性免疫力方面的效力。通过将DNA疫苗引导至具体的细胞区室，可显著增加这些独特型DNA疫苗的免疫原性，尤其是在CTL引导方面(图10)。引导至胞质和保留在内质网中可增强CTL应答，这对于MHC I类限制性应答是可预期的。观察到Fv疫苗(同时有VH和VL区)的免疫原性高于仅VH区。这可能是因为有更多数目的表位被呈递给免疫系统。连接肽的直接效应还不能被排除。
如果疫苗被导向合适的胞内区室，那么独特型DNA免疫接种能够保护小鼠以避免组织相容性的肿瘤攻击(图11)。这种保护性应答很明显是由细胞免疫力所造成的，因为在该系统中即使在肿瘤攻击后的存活小鼠中也检测不到体液免疫。所看到的保护作用最可能是由引发的CTL应答所导致的，因为ER保留型疫苗作为“最具保护力”的疫苗，引发了强的CTL应答。这暗示，是在内质网中的抗原浓度和引发CTL，导致了保护性免疫。其他因素可能对保护性应答有贡献，例如在用于免疫接种的构建物中存在非自身的抗原决定蔟。用ER保留型疫苗免疫的且在肿瘤攻击后存活的小鼠，引发了抑制性的增殖反应(图12)。这表明，ER保留型FvDNA疫苗导致免疫系统对肿瘤攻击产生次级应答，在该次级应答中对独特型特异的T细胞的数目显著膨胀。在最初用杀灭细胞或Fv胞质型疫苗免疫的存活小鼠中，该增殖反应并不那么高。这可能与攻击后免疫应答的时间有关，因为在研究中仅对一个时间点进行了采样。然而，ER保留型疫苗在引发强次级应答方面的选择性效果，得到了该组别中小鼠得到充分保护而避免了肿瘤攻击这一结果的支持。
DNA疫苗的能够进行表达、细胞定位的能力以及DNA疫苗的其他参数，使得它们特别适用于研究引发的、可导致体内保护作用的免疫应答的本质。DNA免疫接种已用于抵抗各种不同的典型肿瘤抗原，其中包括我们研究中使用表达人CD4的鼠淋巴瘤细胞，类似的使用β-半乳糖苷酶基因、人癌胚抗原、来自人p53基因突变形式的单个表位的系统。这些研究确立了DNA免疫接种在对抗典型肿瘤抗原方面的有用性。事实上，所有这些使用的抗原都是外源蛋白质，它们的免疫原性通常比临床上遇到的肿瘤自身抗原大得多。
已有报道，在有或没有连锁表达人GM-CSF的情况下，可在同时编码人Cγ1和Cκ的表达载体中使用鼠淋巴瘤的VH和VL区(Syrengelas等人，1996，自然医学(Nature Medicine)21038-1041，该文献在此引用作为参考)。因此，该抗原具有与感兴趣的自身-V区相连的外源抗原决定蔟。用这些构建物进行的肌内或皮内DNA接种，导致了抗-独特型抗体的应答以及在体内部分防止肿瘤攻击的保护作用。人GM-CSF的连锁表达可明显增强所引发的应答。DNA免疫可诱导针对弱的、原本不能被识别的肿瘤抗原的免疫应答，而这取决于DNA所导致的额外刺激(即人恒定区和GM-CSF)。
独立的同生型(syngeneic)V区DNA免疫，已表明能够在自身免疫疾病的鼠模型中引发保护性的免疫应答。已表明，基于DNA且针对鼠Vβ8.2基因的免疫，可以保护H-2u小鼠防止试验性自身免疫性脑膜炎(EAE)(Waisman等人，1996，自然医学(Nature Medicine)2899-905，该文献在此引用作为参考)。检测到了细胞免疫应答，而且结果揭示DNA免疫切断了在该系统中由表达Vβ8.2的克隆所支配的病原性T细胞。它们的免疫方法(使用独立的不与前导肽或CDR3相连的V区)，没有显示出携带Vβ8.2的细胞被消除的证据。表1细小RNA病毒科鼻病毒属(医用)造成50％的普通感冒。
Etheroviruses(医用)包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，ECHO病毒，人肠道病毒例如甲肝病毒。
Apthoviruses(兽医用)这些是足或口腔疾病病毒。
靶抗原VP1，VP2，VP3，VP4，VPGCalcivirus科Norwalk组病毒(医用)这些病毒是传染性胃肠炎的重要成因。披膜病毒科α病毒属(医用和兽医用)其实例包括Senilis病毒、RossRiver病毒和东方和西方脑膜炎病毒。
呼肠孤病毒属(医用)风疹病毒。黄病毒科例如(医用)登革热病毒、黄热病毒、日本脑膜炎病毒、圣路易斯脑膜炎病毒和虱传脑膜炎。丙肝病毒(医用)这些病毒不属于任何科，但被认为或者是披膜病毒或者是黄病毒。与披膜病毒科最为相似。冠状病毒科(医用和兽医用)传染性支气管炎病毒(禽)猪可转移胃肠道病毒(猪)猪血细胞凝集脑脊髓炎病毒(猪)猫肠道病毒(猫)狗冠状病毒(狗)人呼吸道冠状病毒引起约40％普通感冒。EX.224E，0C43。
注意冠状病毒可能引起甲肝、乙肝和丙肝以外的肝炎。
靶抗原
E1-又称M蛋白或基质蛋白E2-又称S蛋白或刺突蛋白E3-又称HE或血细胞凝集elterose糖蛋白(并不是存在于所有的冠状病毒中)N-核衣壳弹状病毒科Vesiliovirus属狂犬病毒(医用和兽医用)狂犬病靶抗原G蛋白，N蛋白线状病毒科(医用)出血热病毒，例如Marburg病毒和Ebola病毒副粘病毒科副粘病毒属(医用和兽医用)腮腺炎病毒，新Castle病病毒(重要的鸡病毒)麻疹病毒属(医用和兽医用)麻疹病毒、狗瘟热肺病毒(医用或兽医用)呼吸道合胞病毒正粘液病毒科(医用)流感病毒环蛇属病毒科环蛇病毒属(医用)加利福尼亚脑膜炎，LA Crosse白蛉热病毒属(医用)Rift峡谷热Hantavirus属Puremala是一种hemahagin热病毒内罗毕病毒属(兽医用)内罗毕绵羊病还有许多未归类的环蛇属病毒属沙粒病毒科(医用)LCM，Lassa热病毒呼吸道肠道病毒科呼吸道肠道病毒属可能是一种人病原Rotavirus儿童急性呼吸道肠道炎眶病毒属(医用和兽医用)克罗拉多虱传热病毒、Lebombo(人)、马脑膜炎病毒、蓝舌病毒逆转录病毒科致癌病毒亚科(兽医用和医用)猫白血病病毒、HILVI和HTLVII慢性病毒亚科(医用和兽医用)HIV，猫免疫缺陷病毒、马传染病病毒、贫血病毒泡沫状病毒亚科乳多空病毒科多瘤病毒亚科(医用)BKU和JCU病毒乳头瘤病毒亚科(医用)与癌症或乳头瘤的恶性发展有关的许多种病毒腺病毒(医用)EXAD7，ARD.，O.B.-引起呼吸道疾病部分腺病毒，例如275，引起肠炎细小病毒科(兽医用)猫细小病毒引起猫肠炎猫肠炎病毒狗细小病毒猪细小病毒疱疹病毒科α疱疹病毒亚科单纯疱疹病毒属(医用)HSVI，HSVII水痘病毒属(医用和兽医用)假狂犬病-水痘-带状疱疹病毒β疱疹病毒亚科巨细胞病毒属(医用)HCMV，Muromegalovirusγ疱疹病毒亚科淋巴隐病毒属(医用)EBV-(Burkitts淋巴细胞)，Rhadinovirus痘病毒科带状痘病毒亚科(医用-兽医用)天花病毒属牛痘属副痘病毒属-(兽医用)山羊痘病毒属-兽医用兔痘病毒属猪痘病毒属Entermopoxviridue亚科嗜肝DNA病毒科乙型肝炎病毒未分类的δ肝炎病毒表2细菌病原体革兰氏阳性病原球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌；和链霉球菌。
革兰氏阴性病原球菌包括脑膜炎球菌和淋球菌。
病原性革兰氏肠道杆菌包括肠杆菌；假单孢菌，不动杆菌和eikenilla；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌；嗜血杆菌；软下疳；不鲁杆菌病；土拉菌热；巴斯德菌；链杆菌属；念珠菌和螺菌属；产单核细胞李斯特氏菌；猪红斑单毒丝菌；白猴菌；霍乱杆菌；炭疽杆菌；杜诺凡菌；和巴尔通氏体。
病原性厌氧菌包括破伤风菌；肉毒菌和其它羧菌；结核菌；麻风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病；；雅四疹；品它病和地方流行性梅毒；和钩端螺旋体病。由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它疾病包括放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病，酵母菌病，组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子丝菌病，巴西芽生菌病，petriellidosis，球拟酵母菌属，足分枝菌病和着色芽生菌病；和皮肤真菌病。
立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。
支原体和衣原体感染的病例包括支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和产期衣原体感染。真核病原由原虫和蠕虫引起的感染包括阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；肺泡子虫病；隆突；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；马来丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫；和绦虫感染。
表3.用于PCR和重组PCR的引物分泌型和ER保留型前导序列5′GGGCGGCCGC AATGGACATG AGGGTCCCCG CTCAGCTCCT GGGGCTCCTG (SEQ ID NO8)3′CCTCTAGAAC ATTTGGCACC TGGGAGCCAG AGCAGCAGGA GCCCCAGGAG C (SEQ ID NO9)细胞质前导序列5′GGGCGGCCGC AATGGGATGG AGCTGTAAGA GGCGCTCCTC GGAAG (SEQ ID NO10)3′CCCTCTAGAG TGGACACCAG CTGTAGCTGT TTCTTCCGAG GAGCG (SEQ ID NO11)CD4跨膜5′GTGCAGCCCA TGGCCCTGAT TGTG (SEQ ID NO12)3′TTCATTGGGC TAGGCATCTT CTTCAGATCT AGGTGC (SEQ ID NO13)ER-保留信号(腺病毒E19)5′TTCTTCAGAT CTAGGCGCAG TTTTATTGAT GAA (SEQ ID NO14)3′CGTAAAACGC GTTTAAGGCA TTTTCTTTTC (SEQ ID NO15)用于Fv表达的5′VκGGGGTTCTAG AGACATTGTG ATATCMCARW CTC (SEQ ID NO16)用于表达接头肽的3′CL引物(以反平行方式书写)CTGATAAGAT TTAGATTCGG AGCCAGAACC GGAAGATTTA CCTTCTGCAG CATCAGCCCG (SEQ IDNO17)用于单链表达的5′VH2引物GGGGTTCTAG AGAGGTCCAG CTGCARCARY CTGG (SEQ ID NO18)用于与接头肽一起表达的5′VH引物GGCTCCGAAT CTAAATCTTA TCAGGAGGTC CAGCTGCARC ARYCTGG (SEQ ID NO19)用于跨膜/ER保留的3′IgG2a CHlATAGACCATG GGGGCTGTTG TTTTGGC (SEQ ID NO20)用于可溶性分泌的3′IgG2a CHlATAGAACGCG TGTCAGGCTG TTGTTTTGGC (SEQ ID NO21)M＝A或CR＝A或GW＝T或AY＝T或C表4免疫球蛋白前导序列(ER导向至分泌或保留)Met asp met arg val pro ala gln leu leu gly leu leu leu leu trpleu pro gly ala lys cys ser arg (SEQ ID NO22)胞质前导序列Met gly trp ser cys lys arg arg ser ser glu glu thr ala thr alagly val his ser arg (SEQ ID NO23)H221VL区域Asp ile val ile ser gln ser pro ser thr leu ala val ser ala glyglu lys val thr met asn cys lys ser ser gln ser leu phe asn serarg thr arg lys asn tyr leu ala trp phe gln gln lys pro gly glnser pro lys leu leu ile tyr trp ala ser thr arg glu ser gly valpro asp arg phe thr gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thrile ser ser val gln ala glu asp leu ala val tyr tyr cys lys glnser tyr tyr leu arg thr phe gly gly gly thr arg leu glu (SEQ ID NO24)接头肽Arg ala asp ala ala glu gly lys ser ser gly ser gly ser glu serlys ser tyr gln gly ser glu ser lys ser tyr gln (SEQ ID NO25)H221 VH区域Glu val gln leu gln gln ser gly ala glu leu val lys ser gly alaser val lys leu ser cys lys ala ser gly phe thr phe thr ser tyrtrp ile asn trp val lys gln arg ala gly gln gly leu glu trp ilegly asn ile tyr pro gly ser asn thr ile asn tyr ser glu asn phelys lys lys ala thr leu thr val asp thr ser ser ser thr ala tyrmet gln leu ser ser leu thr ser asp asp ser ala val tyr tyr cysala arg glu arg leu leu gly phe val tyr trp gly gln gly thr leuval thr val ser thr ala lys thr thr ala (SEQ ID NO26)CD4跨膜和E19细胞质结构域(用于ER保留)Met ala leu ile val leu gly gly val ala gly leu leu leu phe ilegly leu gly ile phe phe arg ser arg arg ser phe ile asp glu lyslys met pro (SEQ ID NO27)序列表(1)一般信息(i)申请人Williams，William V.
Madaio，MichaelWeiner，David B.
(ii)发明名称改良疫苗(iii)序列数目27(iv)通信地址(A)收信人Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris(B)街道One Liberty Place，46th floor(C)城市Philadelphia(D)州Pennsylvania(E)国家USA(F)邮编19103(v)计算机可读形式(A)记录介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统Windows(D)软件Wordperfect(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料
(A)申请号US60/029,592(B)申请日23-10月-1996(viii)律师/代理人信息(A)姓名DeLuca，Mark(B)登记号33,229(C)参考/案卷号UPN-3304(ix)通讯信息(A)电话215-568-3100(B)传真215-568-3439(2)SEQ ID NO1(i)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Lys Gln Thr Leu Leu1 5(2)SEQ ID NO2(i)序列特征(A)长度4氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Asp Glu Leu1(2)SEQ ID NO3(i)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Glu Lys Lys Met Pro1 5(2)SEQ ID NO4(i)序列特征(A)长度330碱基对(B)类型核酸(C)链型两种(both)(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/分类符号CDS(B)位置1..330(xi)序列描述SEQ ID NO4GAC ATT GTG ATA TCA CAG TCT CCA TCC ACC CTG GCT GTG TCA GCA GGA 48Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAA TCC AGT CAG AGT CTG TTC AAC AGT 96Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30AGA ACC CGA AAG AAC TAC TTG GCT TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45TCT CCT AAA CTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGC AAG CAA 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95TCT TAT TAT CTT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AGG CTG GAA 330Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO5(i)序列特征(A)长度110氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO6(i)序列特征(A)长度330碱基对(B)类型核酸(C)链型两种(both)(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/分类符号CDS(B)位置1..427(xi)序列描述SEQ ID NO6GAG GTC CAG CTG CAG CAG CCT GGT GCT GAA CTT GTG AAG TCT GGG GCC48Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GAC TTC ACT TTC ACC AGC TAC96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30TGG ATA AAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT144Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45GGA AAA TTT TAT CCT GGT AGT GGT ACT ATT AAC TAC AGT GAA AAT TTT192Gly Lys Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60AAG AAA AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGT ACA TCC TAC240Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ser Tyr65 70 75 80ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAC GAC TCT GCG GTC TAT TAT TGT288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95GCA AGA GAA CGT CTC CTG GGG TTT GTT TAT TGG GGC CAA GGG ACT CTG336Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu90 95 100GTC ACT GTC TCT ACA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC TAT CGG GGA388Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Arg Gly105 110 115TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGC ACT427Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly Thr120 125 130(2)SEQ ID NO7(i)序列特征(A)长度131氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构两种(both)(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Lys Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ser Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Arg Gly115 120 125Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly Thr130 135 140(2)SEQ ID NO8(i)序列特征(A)长度50碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GGGCGGCCGC AATGGACATG AGGGTCCCCG CTCAGCTCCT GGGGCTCCTG 50(2)SEQ ID NO9(i)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTCTAGAAC ATTTGGCACC TGGGAGCCAG AGCAGCAGGA GCCCCAGGAG C51(2)SEQ ID NO10(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GGGCGGCCGC AATGGGATGG AGCTGTAAGA GGCGCTCCTC GGAAG 45(2)SEQ ID NO11(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CCCTCTAGAG TGGACACCAG CTGTAGCTGT TTCTTCCGAG GAGCG 45(2)SEQ ID NO12
(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GTGCAGCCCA TGGCCCTGAT TGTG24(2)SEQ ID NO13(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13TTCATTGGGC TAGGCATCTT CTTCAGATCT AGGTGC 36(2)SEQ ID NO14(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14TTCTTCAGAT CTAGGCGCAG TTTTATTGAT GAA 33(2)SEQ ID NO15(i)序列特征(A)长度30碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CGTAAAACGC GTTTAAGGCA TTTTCTTTTC 30(2)SEQ ID NO16(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GGGGTTCTAG AGACATTGTG ATATCMCARW CTC 33(2)SEQ ID NO17(i)序列特征(A)长度60碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17CTGATAAGAT TTAGATTCGG AGCCAGAACC GGAAGATTTA CCTTCTGCAG CATCAGCCCG 60(2)SEQ ID NO18(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GGGGTTCTAG AGAGGTCCAG CTGCARCARY CTGG34(2)SEQ ID NO19(i)序列特征(A)长度47碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19GGCTCCGAAT CTAAATCTTA TCAGGAGGTC CAGCTGCARC ARYCTGG 47(2)SEQ ID NO20(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO20ATAGACCATG GGGGCTGTTG TTTTGGC 27(2)SEQ ID NO21(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO21ATAGAACGCG TGTCAGGCTG TTGTTTTGGC 30(2)SEQ ID NO22(i)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Pro Gly Ala Lys Cys Ser Arg20(2)SEQ ID NO23(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Met Gly Trp Ser Cys Lys Arg Arg Ser Ser Glu Glu Thr Ala Thr Ala1 5 10 15Gly Val His Ser Arg20(2)SEQ ID NO24(i)序列特征(A)长度110氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30Arg Thr Arg Lys Asn Tyr leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO25(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Arg Ala Asp Ala Ala Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser1 5 10 15Lys Ser Tyr Gln Gly Ser Glu Ser Lys Ser Tyr Gln20 25(2)SEQ ID NO26(i)序列特征(A)长度122氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala115 120(2)SEQ ID NO27(i)序列特征(A)长度35氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile1 5 10 15Gly Leu Gly Ile Phe Phe Arg Ser Arg Arg Ser Phe Ile Asp Glu Lys20 25 30Lys Met Pro3权利要求
1.一种质粒，其特征在于，它含有可操作地连于调控元件的编码序列，该编码序列编码连于或含有胞内引导序列的免疫靶蛋白。
2.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该免疫靶抗原是变应原、病原体抗原、癌症相关抗原或连于自身免疫疾病相关细胞的抗原，或者该免疫靶抗原可引发与变应原、病原体抗原、癌症细胞抗原或抗原发生交叉反应的免疫应答。
3.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该胞内引导序列是非天然信号序列。
4.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该免疫靶抗原是变应原、病原体抗原、癌症相关抗原或连于自身免疫疾病相关细胞的抗原。
5.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该胞内引导序列将在细胞中表达的该免疫原性靶抗原引导定位于胞质、内质网、溶酶体。
6.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该胞内引导序列，引导在细胞中表达的该免疫原性靶抗原成为分泌型蛋白或膜结合蛋白。
7.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，该胞内引导序列选自下组DKQTLL(SEQ ID NO1)、位于免疫原性靶蛋白C末端的KDEL(SEQ ID NO2)，和在免疫原性靶蛋白C末端的DEKKMP(SEQ ID NO3)。
8.一种含有权利要求1所述的质粒的药物组合物。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，还含有多核苷酸功能增强子。
10.一种免疫个体以抵抗抗原的方法，其特征在于，给该个体施用权利要求1所述的质粒。
全文摘要
公开了改良疫苗。改良疫苗包括一核苷酸序列,该核苷酸序列编码的免疫靶蛋白连于胞内引导序列或含有胞内引导序列,该编码序列可操作地连于调控元件。还公开了使个体免疫的方法。
文档编号A61K39/00GK1244807SQ97180856
公开日2000年2月16日 申请日期1997年10月23日 优先权日1996年10月23日
发明者W·V·威廉斯, M·马戴奥, D·B·韦纳 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会