专利名称：Hcv疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及HCV疫苗。
免疫系统是已演化出来以保护多细胞生物免受感染性微生物侵害的相互关联的细胞类型和分子之复杂网络。其可分为演化较早的先天(或天然)免疫和适应性(或获得性)免疫。先天免疫系统针对病原体的识别模式通常是广谱和基本的。对于这种有限数目的分子结构，已演化出种系编码的受体。相反地，适应性免疫系统-B细胞和T淋巴细胞—可识别大量种类的抗原性结构。受体，根据表达其的细胞类型称为B细胞受体(BCR，其可溶性版本被称为抗体)和T细胞受体(TCR，只有与细胞表面结合的形式)，由体细胞重组产生并且显示克隆性分布。因此，最初只有少量具有某些特异性的细胞。一旦接触抗原，这些细胞开始分裂(克隆性扩增)以产生能够与所述抗原结合的效应群体。在消除抗原后，特异性识别该抗原的特异性细胞亚群体作为免疫记忆保留下来。综合起来所述适应性免疫系统是慢速的(与天生免疫相比)，但却是特异性的并且其在反复暴露于给定的病原体/抗原后得到提高。
T细胞在适应性免疫中具有中心作用。其受体(TCR)识别“主要组织相容性复合物”(MHC或HLA)细胞表面的肽复合物。这些肽称为T细胞表位，代表抗原的降解产物。存在两种主要类型的T细胞CD8-阳性细胞毒T细胞(CTL)被限定于MHC I类。CD4-阳性辅助T细胞(HTL)限定于MHC II类。HTL对适应性免疫的许多特征来说是必需的所谓“专门的抗原呈递细胞”(APC)的激活、免疫球蛋白(Ig)类型转换、生发中心反应和Ig亲和力成熟、CTL的激活、免疫记忆、免疫应答的调节等。
MHC分子在细胞内部收集肽并将其在细胞表面上呈递给T细胞的TCR。有两种主要类型的MHC，由CD8-阳性CTL识别的I类和由CD4阳性HTL识别的II类。
MHCI类分子由45kDa的膜锚定α链和12kDA的非共价附着b2微珠蛋白(b2m)组成。X射线晶体学(Stern和Wiley 1994)三维结构的解析显示α链拥有在两端都封闭的并且可容纳8至11个氨基酸长度的肽裂隙。I类分子是遍在表达的并且其提供来源于细胞质蛋白的肽。这些蛋白被蛋白酶体降解，所得的肽被主动地转运到内质网(ER)中。在那里，在几种伴侣蛋白的帮助下，形成了MHC肽复合物，并被转运至所述细胞表面(Heemels 1995)。因此，MHCI类蛋白反映了细胞表面的蛋白质组并允许T细胞识别细胞内的病原体或恶性肿瘤细胞。
MHCII类分子由两个分别为35kDa和30kDa的膜锚定蛋白(α-和β-)组成。这些蛋白在一起形成了在两端开口的裂隙，其可容纳多种长度的肽，通常从12至25个氨基酸。尽管存在这些差异，但I类和II类分子具有惊人的结构相似性((Stern和Wiley 1994)。II类分子只在专门的APC(包括树突状细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞/单核细胞)中表达。这些细胞在内体途径中专门化，以吸收和加工抗原。在其刚刚生物合成后，II类分子被所谓的恒定链(Ii)复合，这在ER中阻止肽的结合。当含有II类Ii复合物的囊泡与含有外源抗原的降解产物的囊泡融合时，Ii被降解直至所述MHC结合裂隙只与所谓的CLIP肽复合为止。后者在伴侣分子如HLA-DM的帮助下与抗原肽交换(Villadangos 2000)。最后，MHC肽复合物再被呈递至APC表面，其以多种方式与HTL相互作用。
由于多基因和非常多态性的原因，MHC系统高度复杂。人中的I类α链存在称为HLA-A、-B和-C的三个基因座。同样，存在三个II类α链基因座(DRA、DQA、DPA)；II类β链基因座状况甚至更加复杂，因为存在4种不同的DRβ链(DRB1、2、3、5)以及DQB和DPB。除了单态DRα链DRA，在群体中，各基因座存在许多不同的等位基因(数打至数百)(Klein 1986)。不同的等位基因对肽具有显著不同的结合特异性。等位基因命名为例如HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
通过各种方法已鉴定了T细胞表位(Van den Eynde 1997)。T细胞系和克隆已经例如用于筛选cDNA表达文库(例如在经合适的HLA-分子转染的COS细胞背景中)。可选择地，也使用了生物化学方法。后者包括洗脱来自靶细胞表面的MHC分子的天然配体，通过几个层析步骤分离这些肽，在表位重建测定中分析其与淋巴细胞的反应性和通过质谱仪进行测序(Wolfel等人1994，Cox等人1994)。
近年来高灵敏性的细胞因子检测测定法(如IFN-γ ELIspot)的出现允许使用淋巴细胞直接离体地筛选重叠的合成肽(Maecker 2001，Kern 2000，Tobery 2001)。最初，Kern等人(1999&2000)使用重叠的9mer肽库阵列在体外进行CD8+T细胞表位作图。后来，Tobery等人(2001)修饰了该方法并证明含有多至64个20mer的肽库可用于在小鼠中筛选CD8+和CD4+T细胞表位。这两种方法都基于监控抗原特异性应答，通过细胞内染色(Kern等人，2000)或ELLspot测定(Tobery等人，2001)测量IFN-γ产生来进行监控。CD4+T细胞在使用15mer的混合物时的应答与用完整的可溶性蛋白作为抗原时所测得的应答几乎相当，同时，令人毫不惊奇的是，CD8+T细胞的应答显著高于通常可忽略的用可溶性蛋白刺激后检测到的应答。此外，CD8+T细胞对15个氨基酸肽的混合物之应答与用8-12个氨基酸肽(经选择代表已知的MHC I类的最小表位)获得的应答相似。绝大部分与细胞膜结合的肽酶在这些情况下负责将肽“剪”成最优化的长度(Maecker等人，2001)。
引人注目的另一种选择是用特异性淋巴细胞筛选合成的组合肽文库。例如，由以位置扫描形式排列的200种混合物组成的十肽文库已成功地用于鉴定刺激T细胞的克隆类型群体的肽配体(Wilson，等人，J.Immunol.，1999，1636424-6434)。
通过所谓的“反向免疫学方法”(Rammensee 1999)已鉴定了许多T细胞表位。在这种情况下产生潜在的T细胞表位的蛋白是已知的，并且就HLA结合基序对其一级序列进行扫描。通常数打至数百的候选肽或甚至全套交叠肽被合成，并对其与HLA分子的结合进行检验。通常，选择最好的结合者以进一步表征其与T细胞的反应性。例如可通过在体外或体内在HLA转基因小鼠的帮助下活化(priming)T细胞来进行该测定。
丙型肝炎病毒(HCV)是在世界范围内慢性感染大约1.7亿人口的黄病毒科的成员。现已描述了至少6种HCV基因型和超过50种亚型。在美国、欧洲和日本，基因型1、2和3最为普便。HCV基因的地理分布差异很大，在美国和部分西欧地区基因型1a占主导，而在南欧和中欧1b占主导(Bellentani 2000)。
HCV是通过肠胃外或经皮肤传播的，并在肝细胞中进行复制。大约15％的患者遭受与病毒清除和恢复相关的急性自限性肝炎。大约80％经感染的人变成慢性携带者。感染通常无症状地持续缓慢发展数年，但最终HCV是导致硬化(肝脏疾病的最后阶断)和肝癌的主要原因(Liang 2000)。HTL和CTL应答的强度和质量决定患者是否康复(自发地或由于治疗的原因)或发展成慢性感染(Liang 2000)。
标准的HCV治疗方法包括聚乙二醇化的α干扰素和抗病毒的利巴韦林(ribavirin)的组合。在大约50％的HCV患者中获得病毒学应答，所述应答依赖于基因型。很明显这种治疗的低耐受力和相当大的副作用使得需要新的治疗性干涉(包括治疗疫苗)(Corngerg 2002)。然而，目前缺乏对导致成功免疫应答的MHC组合表位的详细理解(Ward2002)。因此，发展基于表位的治疗性疫苗要求对针对完整的HCV的T细胞应答进行综合分析。
HCV病毒体包含9.5kb编码大约3000个氨基酸的大单一多蛋白的正单链RNA基因组。通过宿主和HCV编码的蛋白水解酶活性将后者加工成至少10个蛋白(Liang 2000)。重要的是，HCV RNA依赖性RNA聚合酶为差错倾向的，产生病毒准种的演变并促成免疫逃避变体(Farci 2000)。
尽管在过去15年中在本领域提出了许多观点并且在这期间已提出许多有前景的抗原候选者，但在市场上仍然没有HCV疫苗(也没有令人满意的治疗方法；唯一可获得的治疗方法，如上述α干扰素和利巴韦林的组合，只在少数患者身上有效)。在HCV序列公开后的早期，许多表位和抗原被建议作为与HCV疾病抗争的有效手段(例如Koziel等人，J.Virol.67(12)，7522-7532；Shirai等人，J.Virol.68(5)(1994)，3334-3342；Ler-oux-Roels等人，Hepatology 23(1)(1996)，8-16；Hoffmann等人，Hepatology 21(3)(1995)，632-638；Sarobe等人，J.Clin.Invest.102(6)(1998)，1239-1248；Battegay等人，J.Virol.69(4)(1995)，2462-2470；Wentworth等人，Int.Imunol.8(5)(1996)，651-659；Rehermann等人，J.Virol.70(10)(1996)，7092-7102；Diepolder等人，J.Virol.71(8)(1997)，6011-6019；Lamonaca等人，Hep-atology 30(4)(1999)，1088-1098；WO 00/11186、WO 95/12766、WO 95/27733、WO 94/20127、WO 95/25122、WO 95/22317、WO 94/25601、WO 92/03458和WO 93/00365)。此外，已用黑猩猩开展了重要的原理验证性离体中和研究，黑猩猩是除了智人以外的其它容易患上慢性HCV感染的物种。事实上，通过急性减退和慢性感染对比在个体和黑猩猩中诱导免疫应答的研究，到目前为止只揭示了在活性病毒感染建立后最初的潜在保护性免疫应答的情景。然而，在暴露于HCV之前，经肠胃外免疫之后，预防性疫苗保护的关联预期主要是在肝外。只有少数疫苗有效性研究使用黑猩猩进行研究并且这些研究显示在用完全相同的克隆(用于免疫和攻击)进行低剂量同源攻击后，最多保护7只动物中的5只免受感染。此外，HCV呈现出高度的可变性，所述高度可变性为HCV提供了逃避由疫苗或感染诱导的免疫应答的能力。考虑到这个问题，也曾提出以不同的大蛋白片段组合作为DNA疫苗的另一种可选择的接种策略(Rollier等人，J.Virol.78(1)(2004)，187-196；Dunas-Carrera等人，Biotech.Appl.Biochem.Imm.Publ.(29.September 2003；BA20030112))。
尽管过去15年特别是过去10年取得的所有进步，但仍迫切需要发展新的针对HCV的治疗方法和接种策略(Heile等人，J.Virol.74(15)(2000)，6885-6892)。
因此本发明的目的是提供这种针对HCV的有效治疗方法和接种策略。
因此本发明提供了包含至少2个表位的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，各表位来自不同的热点(hotspot)表位，其中热点表位定义为包含选自下列的肽的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL，TTILGIGTVLDQAET，FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
在2003年8月27日提交的申请WO 04/024182(要求2002年9月13日的A1367/2002的优先权)中，描述了用于分离接种疫苗用的HCV肽，特别是HCV T细胞表位的新方法。在该申请中，第一次公开了“HCV热点表位”的概念T细胞表位“热点”定义为至少包含超过一个T细胞表位的短肽序列。例如，两个或多个表位可相互间隔很短(很短定义为少于5-10个氨基酸)，或相互之间直接相连，或部分或甚至完全重叠。热点可以只包含I类或II类表位，或两者都包含。热点上的表位可具有不同的HLA限制性。
由于I类和II类抗原加工的高度复杂性和选择性途径(如导言中所提到的)的原因，不能只通过多肽序列轻易地预测T细胞的表位。尽管被广泛使用，但用于T细胞表位预测的计算机算法产生高比例的假阴性和假阳性。
因此，即使对单个T细胞表位在多肽序列内也不是显然的，对于热点更是如此。根据本发明将几个完全不同的实验方法组合起来对T细胞表位进行鉴定，包括表位捕获、HLA-转基因动物和人单核细胞的体外刺激。将所有这三种方法系统地应用于跨越目的抗原的重叠肽上，以使能够综合地鉴定表位。在这种不限定于特定的HLA等位基因而是揭示群体内所有可能被靶向的表位的综合分析后，表位热点才可以变得明晰。在抗原内，只有少数(如果有的话)序列显示热点的特征。因此热点的鉴定总是件令人吃惊的事情。
T细胞表位热点提供了重要的有利方面热点可激活和可被受试者的不同T细胞克隆识别。热点(当包含具有不同HLA限制性的表位时)可与来自不同非HLA匹配的个体之T细胞相互作用。
基于表位的疫苗，目前已瞄准所选普遍性HLA等位基因，例如HLA-A2，所述基因在大约一半的白种人中表达。因为其它等位基因频率较低，因此针对广泛的世界人口范围的基于表位的疫苗必须包含许多不同的表位。疫苗的化学实体(例如肽)的数目受制于来自生产、配制和产品稳定性的限制。
热点使这种具有广泛的世界人口范围的基于表位的疫苗成为可能，因为其通过有限数量的肽提供了显著大量的表位。事实上，目前所拥有的现有技术(参见上述关于本领域讨论的表位的文献和仍未开发出HCV疫苗的事实)已清楚地显示，发展HCV疫苗已被认为是很困难的，同时显示尽管在过去10年里积累了丰富的关于HCV抗原在几种感染模型中引起体液和细胞免疫应答的有效性的文献，但在发展HCV疫苗和治疗方法方面总体上是失败的。HCV感染的治疗和预防总是复杂而难以预测的。
现在本发明的概念(通过提供基于HCV热点表位特征的疫苗)第一次使得HCV免疫接种系统成为可能，所述系统提供了用于HCV感染的患者(特别是慢性感染的患者)的合适的和特异性的预防接种和有效的治疗方案。
本申请的发明人显示了在HCV疫苗中只使用一个或两个特异性表位是不足以满足免疫接种的。提供HCV蛋白混合物(核心、E1和E2作为DNA疫苗；Duenas-Carrera等人(2003))或这些HCV蛋白的大片段的混合物(核心、E1、E2和NS3作为DNA疫苗；Rollier等人，(2004))的概念也没有带来想要的结果。
本发明的HCV疫苗包含含有来自上面所列热点表位之表位的短多肽。本发明疫苗不依赖于与DNA疫苗相关的风险和不确定性(缺少长效免疫应答；主要在肝外作用；作用模式、定位等)。此外，本发明也不会面临全蛋白或长链蛋白片段生产的生产问题。
通过功能性测定已鉴定了此处公开的热点表位，所述功能性测定主要使用Th1/Tc1型反应(即，γ干扰素)作为示值读数(read-out)。众所周知(整个或至少大片段)抗原不仅包含这种激动性表位，也可以编码拮抗性配体。这种拮抗剂潜在地存在于整个抗原中，在热点中的缺乏可妨碍免疫原性和疫苗的有效性。此外，整个抗原几乎肯定诱导体液免疫应答。这种抗体应答本身对存在于细胞内的HCV影响极小，但其可严重地减弱想要的T细胞应答。由于其受限制的长度，来源于本发明的热点表位不太可能诱导不想要的抗体应答。最终，HCV抗原只有相对小的部分在不同基因型之间是保守的。因此，用于疫苗的整个抗原可以诱导针对非保守区或表位的应答，所述应答与绝大多数患者无关。相反地，此处公开的热点来源于在主要HCV基因型1、2和3中保守性大于80％的区域。
HLA-super类型(如在例如WO 01/21189中公开的)描述了在一些情况下给定的HLA I类T细胞表位不是专门地被限定在并且只限定在一个HLA等位基因上，而且还可以在另一个HLA等位基因的背景中被T细胞识别(例子肽可结合HLA-B*0702和B*3501)。本质上这种肽在群体中具有更广泛的HLA盖度，从而成为引人注目的疫苗候选者。
相反地，本发明的T细胞表位热点显著不同于这种HLA-super类型，因为本发明的热点是蛋白内的肽区域，所述蛋白显示具有非常大量的不同的相邻和甚至重叠的表位。热点在相对短的区域递送了大量的表位，同时保证正确地加工热点内的表位。
事实上，本发明的热点在不同HCV种类间显示相当低的变异，所述相当低的变异使其更有利地用于疫苗途径，因为即使只使用小的多肽也可能存在异源攻击。无论以任何方式，本发明提供的表位不会超过100个氨基酸长度，但通常明显更短。优选地本发明的表位的长度至少是6、7、8、9、10、11或12个氨基酸。最大长度13、15、20、25、30、40或50个氨基酸也被认为是优选的。
根据本发明，用于给定疫苗的表位可选自上述热点区域。当然，在疫苗中可提供整个热点区域或仅提供其部分(只要所述部分包含至少一个表位)。然而，如果在疫苗中提供一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)表位是有利的，其包含完整的热点区域或至少含有超过一个表位的区域。本发明所使用的表位也可以是在上面定义的热点“主”序列上具有缺失(优选地缺失1、2、3、4、5、6或7个氨基酸)的序列变体。优选地，热点序列内的缺失不会改变所述表位；当然尽管缺失但必须在所述热点区域保留至少一个表位。
特别优选地，在疫苗中提供了表位混合物，所述表位混合物由一组只具有一种表位的肽与另一组具有超过一种表位的肽混合构成。例如包含至少一种或至少两种具有一种表位的肽和至少一种或至少两种具有超过一种表位(例如，整个热点序列)的肽的疫苗是优选的。
可以不作任何修饰的多肽形式提供表位；合适地可用某些化学或生物学部分修饰所述多肽链，特别是考虑有关溶解或药物配制时(例如，如WO01/78767中所描述的)。用于本HCV疫苗的表位可以包含整个热点区域或其连续片段(包含至少一个所述热点内所包含的表位)或包含所述热点的非连续部分(但是，至少也包含一个所述热点内包含的表位；在这种情况下可在该热点的非连续部分提供一个或多个连接体(例如，氨基酸或肽连接体))。
根据优选的实施方案，本发明的HCV疫苗包含至少三个，特别地至少四个表位，各表位来自不同热点表位。
更优选地，所述HCV疫苗包含至少五个表位，各表位来自不同的热点表位。尽管这种基于表位的疫苗包含的表位越多，有关配制的问题越大，但权衡广泛的保护能力和配制缺点(特别是有关工业规模生产的缺点)，4、5或6个表位的数目是最优的。
因此，在某些情况下包含至少六个表位(各来自不同的热点表位)的HCV疫苗也可以是本发明的优选的实施方案。最优的热点表位数目也依赖于所选择的表位相互之间的相对相互作用，已证明所述相互作用是疫苗中某些长度较短的多肽组合的主要障碍。
本发明的优选的HCV疫苗的特征在于表位选自下列KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，YLLPRRGPRL，LPRRGPRL，GPRLGVRAT，RLGVRATRK；GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVL，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT；DLMGYIPAV，GYIPLVGAPL，DLMGYIPLVGAPL；CINGVCWTV，GEVQVVSTATQSFLAT，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，MWNFISGIQYLAGLSTLPGN，NFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，QYLAGLSTL，HMWNFISGI；VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI，DYPYRLWHY，TVNYTIFKI，TINYTIFK，TVNFTIFKV，HYPCTVNYTI，HYPCTVNFTI，RMYVGGVEHR；AAWYELTPAETTVRLR，TPAETTVRL；GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLG，GQGWRL-LAPITAYSQ，RLLAPITAY，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，GQGWRLLAP-ITAYSQQTRGLLG，AYSQQTRGLL，AYSQQTRGL；IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAL-VAFK，ILAGYGAGV，VAGALVAFK，GYGAGVAGAL；VVCCSMSYTWTGALITPC，SMSYTWTGALITP，SMSYTWTGAL，SYTWTGALI；FTDNSSPPAVPQTFQV；LEDRDRSELSPLLLSTTEW，LEDRDRSELSPLLLST，RSELSPLLL，ELSPLLLST，DRDRSELSPL，LEDRDRSEL，LEDRDRSEL；YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，YLVAYQATV；MSTNPKPQRKTKRNTNR，PQRKTKRNTNR，QRKTKRNTN，RKTKRNTNR，MSTNPKPQR，MSTNPKPQK；LINTNGSWHINRTALNCNDSL，NGSWHINRTALNCNDSL，LINTNGSWHI，RTALNCND-SL，LINTNGSWHINRTALN，SWHINRTALN；TTILGIGTVLDQAET，TTILGIGTV，TILGIGTVL；FDSSVLCECYDAGAAWYE，FDSSVLCECYDAGCA，VLCECYDAGA，VVLCECY-DAGAAWYE；ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，ARLIVFPDL，RLIVFPDLGV，RVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV；GVLFGLAYFSMVGNW；TRVPYFVRAQGLIRA；TTLLFNILGGWVAAQ，LLFNILGGWV.
通常，从一组表位中只应选择一种表位，以获得良好的结果。当然不是所有上面所列的热点表位都具有相同的强度，而且不同组群之间功效可能不同。优选地，个体的接种策略可用于主要基于HLA覆盖范围的各组。因此，本发明的优选的HCV疫苗的特征在于其包含至少一种来自至少两种，优选地至少三种，更优选地至少四种下列热点表位的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA.
对于不同的特异性，本发明的HCV疫苗包含至少一种来自两种，优选地至少三种，特别地至少四种下列热点表位的表位VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，
FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR和LINTNGSWHINRTALNCNDSL.
对于进一步不同的特异性，本发明的HCV疫苗包含至少一种来自至少两种，优选地至少三种，特别地至少四种下列热点表位的表位TTILGIGTVLDQAET，FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
作为此处所列的精确的抗原和表位的另一种备择，在本发明的疫苗中可使用抗原/表位变体。根据同源物(包含一个或多个存在于同源HCV株系上的交换)或异源表位设计优选的变体。其中优选的变体是通过保守性氨基酸替代从此处公开的序列变化而来的变体。这些替代是用另一个具有类似特征的氨基酸替代多肽上给定氨基酸的替代。通常看作保守替代的是在脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile之间用一个置换另一个；羟基残基Ser和Thr的交换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的替代、碱性残基Lys和Arg之间的替代和芳香族残基Phe和Tyr之间的置换。
在这个方面特别优选的是具有此处公开的任何多肽的氨基酸序列的变体，在所述变体中以任何组合发生了1、2、3、4或5个氨基酸残基的替代、删除或添加。在这些变体当中优选的是不改变本发明多肽的性质和活性的沉默替代、添加和删除。在此方面特别优选的是保守替代。特别适合的氨基酸替代是此处公开的同源序列中包含的氨基酸的替代。因此此处公开的抗原或表位的合适序列变体包括一个或多个存在于一种或多种HCV株系或血清型中的变异(优选地基于这种同源变异的1、2、3、4或5个氨基酸交换)。这些抗原包含可以是天然发生的序列或新近建立的人工序列的序列。这些优选的抗原变体基于这种天然发生的序列变异，例如形成针对本发明多肽的抗原性区域的“混合序列”。例如，此处公开的给定HCV序列可通过包含这样的一个或多个变异进行修饰从而产生该给定(天然发生的)抗原或表位序列的人工(即，非天然发生的)变体。
很清楚通过氨基酸交换改进的、保守的或至少不显著地阻止表位的T细胞激活能力之来源于本发明表位或肽的表位或肽也属于本发明的表位或肽。因此，本表位或肽也包含不含有来源于HCV特定株系的原始序列但引发相同的或优选地提高的T细胞应答的表位或肽。这些表位称作“不规则表位(heteroclitic)”。这些表位包括任何表位，所述表位能够引发与原始表位相同的T细胞并且优选地在体内或体外具有优选地更有效的T细胞激活能力。本发明也包括来自其它HCV株系的各同源表位。
通过合理设计，即考虑单个残基对结合MHC/HLA的贡献(例如Ramensee等人，1999(Immunogenetics 50213-219或Sturniolo等人1999(Nature Biotechnology 17555-562)中所描述的)和潜在地与TCR发生相互作用的残基的系统性交换和用针对原始表位的T细胞检验所得序列，从而可获得不规则表位。这种设计对本领域技术人员来说是可行的并且无需过多实验。
另一种可能性包括用针对原始表位的T细胞来筛选肽文库。优选的方法是定向扫描合成的肽文库。这种方法已在例如Blake等人1996()和Hemmer等人1999()和此处给出的参考文献中进行了详细描述。
作为由同源HCV衍生的氨基酸序列代表的表位或不规则表位的另一种选择，也可使用模拟这些表位的物质例如“肽模拟”或“逆向倒位肽(retro-inverso-peptides)”。
此外，化学基团特别是氨基酸残基、连接体(和结合到载体上)、转运促进基团等可加到本发明的HCV疫苗中的肽的N和/或C末端。WO01/78767中描述的氨基酸附着是优选的。
设计改善的热点表位的另一方面是用增强其刺激T细胞的能力的物质与其一起配制或对其进行修饰。这些包括T辅助细胞表位、脂质或脂质体(或WO01/78767中所描述的优选的修饰)。
增加表位的T细胞刺激能力的另一种方法是用免疫刺激物质与其一起配制，所述免疫刺激物质是例如抗体、细胞因子或趋化因子如白细胞介素-2、-7、-12、-18、I类和II类干扰素(IFN)、特别是IFN-α、GM-CSF、TNF-α、flt3-配体等。
根据进一方面，本发明涉及本发明的HCV表位或HCV肽制备用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的HLA限制性疫苗的用途。
优选的本发明的HCV疫苗包含至少两种下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DLMGYIPAV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，GYKVLVLNPSVAAT，CINGVCWTV，AAWYELT-PAETTVRLR，YLVAYQATVCARAQAP PPSWD，TAYSQQTRGLLG，HMWNEIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
优选地，该HCV疫苗包含至少4种，优选地至少5种，至少6种，至少8种或所有这十二种表位。
本发明另一优选的HCV疫苗至少包含下列表位中的两种KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKVAAWYELTPAETTVRLR，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGK-VLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
优选地，该HCV疫苗包含至少4种，至少5种，特别地所有这7种表位。
本HCV疫苗优选地包含至少一个A2表位和至少一个DR1表位。
本HCV疫苗优选地包含至少一个DR7表位。
下列表位组合被认为是特别强大的(至少一组来自(1)至(5)组中的至少三组)(1)KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK或KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL或YLLPRRGPRLGVRATRK或YLLPRRGPRL或LPRRGPRL或，LPRRGPRLGVRATRK或GPRLGVRATRK或RLGVRATRK或KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK，(2)AYAAQGYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVL或AAQGYKVLVLNPSVAAT或KVLVLNPSVAAT或GYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVLVLNPSV或AYAAQGYK-VLVLNPSVAA或AAQGYKVLVLNPSVA或AYAAQGYKVLPSVAAT或AYAAQGYKV-LAAT，(3)DLMGYIP(A/L)VGAPL或DLMGYIPALVGAPL或DLMGYIP(A/L)VG或DLMGYIP(A/L)VGAP或DLMGYIP(A/L)V或DLMGYIPLVGAPL或DLMGYIPLVGA或DLMGYIPLV，(4)GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT或CINGVCWTV或VSTATQSFLATCINGVCWTV或TQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT-CING或GEVQVVSTATQSFLAT，(5)HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或HMWN-FISGI或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN或NFISGIQYLAGLSTLPGN或QYLAGLSTL或HMWNFISGIQYLAGLSTL或HMWNFISGISTLPGNPA或HMWQYLAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN；特别是已证明包含表位GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA的HCV疫苗特别强大。
优选地，为本发明HCV疫苗提供特别合适的辅助物质。因此某些类型的免疫刺激物质已被证明对本发明是有利的。
因此，优选的HCV疫苗进一步包含含有序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之间的整数，优选地是5，X是带正的天然和/或非天然氨基酸残基，Z是选自L、V、I、F和/或W的氨基酸残基，而R1和R2是相互独立地选自-H、-NH2、-COCH3、-COH、至多达20个氨基酸残基的肽或肽反应性基团或具有或不具有肽的肽连接体；X-R2的可以是所述肽(“肽A”)的C末端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。
另一个优选的HCV疫苗实施方案进一步包含具有式(I)的结构的免疫刺激性寡脱氧核酸分子(ODN)
式(1) 其中R1选自次黄嘌呤和尿嘧啶，任何一个X是O或S，任何一个NMP是2’脱氧核苷酸单磷酸或单硫代磷酸，选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞嘧啶-、脱氧尿苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基1-脱氧胞嘧啶-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷-或N-异戊基-脱氧腺苷-单磷酸或-单硫代磷酸、NUC是2’脱氧核苷，选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞嘧啶-、脱氧肌苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧尿苷-、5-甲基-脱氧胞嘧啶-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷-或N-异戊基-脱氧腺苷，a和b是0至100之间的整数，前提是a+b在4和150之间，和B和E是核酸分子(“I-/U-ODN”)的5’或3’末端的公共基团。
本发明的HCV疫苗组合物可进一步包含聚阳离子化合物，优选地聚阳离子多聚体、更优选地聚阳离子肽，特别是多聚精氨酸、多聚赖氨酸或抗微生物肽。
用于本发明的聚阳离子化合物可以是任何展示WO97/30721的特征效应的聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应当具有至少4个氨基酸残基的链长度。特别优选的是包含肽键的物质，如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和在超过8个特别是超过20个氨基酸的范围内包含超过20％、特别地超过50％碱性氨基酸的多肽或其混合物。其它优选的聚阳离子和其药物组合物描述于WO 97/30721(例如，聚乙烯亚胺)和WO 99/38528。优选地这些多肽包含20至500个氨基酸残基，特别优选地包含30至200个残基。这些聚阳离子化合物可通过化学或重组方法产生或可来源于天然来源。
阳离子(多)肽也可以是聚阳离子抗菌微生物肽。这些(多)肽可以是原核或动物或植物来源，或可以是通过化学地或重组方法产生的。肽也可以属于防卫素类别。这种宿主防卫肽或防卫素也是本发明的聚阳离子多聚体的优选形式。通常，允许作为激活(或下调)适应性免疫系统(优选地由APC(包括树突状细胞)介导的)的终产物的化合物用作聚阳离子多聚体。
用于本发明的方法的聚阳离子物质是cathelicidin，所述cathelicidin来源于抗微生物或其衍生物(WO 02/13857 A，此处引用作为参考)，特别是来源于哺乳动物cathelicidins，优选地来自人、牛或小鼠的抗微生物肽或刺激神经组织的化合物例如(人)生长激素(如WO 01/24822中所描述的)。
来源于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角足肽、脱乙酰壳多糖或壳多糖的其它衍生物)或其它通过生物化学或重组方法产生的来源于这些肽或蛋白的肽。其它优选的聚阳离子化合物是来自cathelin特别是小鼠、牛或特别是是人的cathelin和/或cathelicidin的相关的或衍生的物质。相关的或衍生的来自cathelin物质包含完整的或部分的具有至少15-20个氨基酸残基的来自cathelin序列。衍生可包括用不属于20种标准氨基酸中的氨基酸替代或修饰天然氨基酸。此外，阳离子残基可引入这类cathelin分子中。优选地将这些cathelin分子与本发明的HCV肽组合物组合。然而，令人惊奇的原来是这些cathelin也具有与抗原佐剂相同的作用，从而进一步无需加入进一步的佐剂。因此可能在含有或不含有其它免疫刺激物质的疫苗制剂中使用这类cathelin分子作为有效的佐剂。
优选地，本HCV疫苗进一步包含了Al(OH)3佐剂和/或聚阳离子肽。
根据特别优选的实施方案，上述肽A是KLKL5KLK和/或上述I-/U-ODN是寡d(TC)13。
在特定实施方案中，HCV疫苗可优选地进一步包含含有CpG基序的寡脱氧核苷酸。
优选地，以在15分钟内在37℃下可重构的形式冻干本发明的HCV疫苗。取决于HCV疫苗中的个体表位，这可能是件困难的工作。因此，本发明也提供了用于配制这种HCV疫苗的有效方法。
本发明的HCV疫苗优选地包含10μg至10mg各表位(每剂)。
混合物中各表位的数目和特别是其浓度视应用而变化。在本发明优选的实施方案中，在要递送至患者的HCV疫苗中各肽的浓度在5μg/ml至5mg/ml、优选地50μg/ml至4mg/ml、更优选地100μg/ml至3mg/ml的范围内变化。
由于本发明的冻干方法的原因，本发明的冻干HCV疫苗优选地包含痕量乙酸。
本发明的另一个方面也涉及本HCV疫苗用于制备用于预防和治疗HCV感染的药物的用途，即，给个体特别是HCV患者或处于获得HCV感染风险的个体(例如，医院职员、临床研究人员、献血人员等)施用有效的HCV疫苗免疫药物。
溶解肽混合物例如本发明的HCV疫苗可能是非常困难的。因此，本发明的目的提供了用于溶解本发明的HCV肽混合物(即，由两种或多种肽特别是亲水性和疏水性肽组成的肽混合物)的方法。另一个目的是获得用于生产灭菌的和任选地冻干的包含肽混合物的药物制剂的方法。
因此，本发明的另一个方面提供了用于制备包含溶解的本发明HCV肽混合物药物的制剂之方法，其特征在于通过用包含至少一种有机酸的水溶液溶解所述肽混合物，所述有机酸选自甲酸、醋酸、丙酸、丁酸和其卤代或羟基化形式。为了延长保存限期，可进一步将所述溶解的肽混合物除菌(通过过滤、辐射、热处理、化学灭菌或其它方法)和冻干。
在优选的实施方案中，肽混合物包含亲水性和疏水性肽。当然本方法也适用于只包含一种类型的肽的肽混合物(特别是包含例如两种或多种亲水性肽的混合物)。
在另一个优选的实施方案中，溶解在本发明水溶液中的肽包含至少6种，优选地至少8种，更优选地至少10种，特别优选地至少12种氨基酸。根据本发明，可以溶解肽和包含最大数目为30、40或50(或甚至高达100，尽管由于更长的抗原片段之不利方面的原因使得长表位是较不优选的)个氨基酸的多肽。
本发明肽的这个方面的特征在于其溶解性。在水溶液中溶解度低于100μg/ml的肽被认为是疏水性的。另一方面，亲水性肽以超过100μg/ml的浓度溶解在缓冲水溶液中。亲水性肽可进一步分成阳离子(＞20％碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、阴离子(＞20％酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸)和富含羟基肽(＞30％-OH，包括氨基酸例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。
因此本发明的另一个方面涉及用于制备本HCV疫苗的方法，其特征在于下列步骤-通过化学方法合成至少两种上面定义的表位，-通过包含至少一种有机酸的水溶液溶解这些表位，所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其卤代或羟基化形式，-混合所述溶解的表位，和-任选地冻干所述经混合的表位。
为方便贮藏可将所述HCV肽混合物进行深度冷冻(如果不进行冻干步骤)。
通过标准的化学方法(例如，依照Merrifield的固相合成)合成本发明的肽混合物中的肽。当然所述肽也可通过重组产生的或天然分离的蛋白之化学或酶促片段化而获得。在另一个实施方案中，从真核和原核细胞中直接分离HCV肽。在所有这三种情况下，在某些情形在目的肽或多肽冻干和混合在一起前要求对其进行额外的纯化。
用于水溶液(用于溶解肽的)中的有机酸是药物可接受的，这是对该特殊方法的基本要求。在本发明优选的实施方案中，所述有机酸是任选地含有乙腈的乙酸和/或甲酸。
实验显示(依赖于肽混合物的组成)水溶液中有机酸的浓度必须至少为10％，优选地至少20％，优选地至少30％，优选地至少40％，优选地至少50％，优选地至少60％。
在一些情况下，向水溶液中加入有机酸的衍生物(例如，乙腈)可以帮助溶解含有更大量疏水性肽的肽混合物。有机溶剂(例如DMSO和DMF)也有助于增进含有高疏水性肽浓度的肽混合物的溶解。然而，包含DMSO和/或DMF的水性肽混合物不能冷冻干燥。
在优选的实施方案中，当要将产物冻干时向所述肽混合物中加入膨胀剂。特别地，在较低的肽浓度时，不能保证形成良好的冻干块。因此在量较低时加入肽膨胀剂。优选的膨胀剂是山梨醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和其混合物。
在另一个优选的实施方案中，通过过滤对溶解的肽混合物进行灭菌。为了获得增加的产物回收和允许过滤大量的肽混合物，所包含的肽必须完全溶解并且不能形成凝胶。
溶解的或任选地灭菌的肽混合物可直接或在装入瓶中后进行冻干。冻干法是种延长上述肽混合物的保存期限的有用和有效的方法。对于溶解的肽，可获得最多包含5％的残留溶剂(在含水的系统中是水)和痕量有机酸的肽混合物冻干制剂，所述制剂可在含有NaCl和/或山梨醇的缓冲水溶液中在10分钟内重构＞95％，优选地98％，特别优选地99％，产生浑浊的悬浮液或清澈的溶液(依赖于所述肽混合物的组成)。这种快速重构在紧急情况下是特别必要的，在所述情况下必须在数分钟内提供整个冻干瓶剂量的几乎完全重新溶解的即用溶液。
通过下列实施例和附图更详细地描述发明，当然发明不会被限定于其中。
图1显示KLK/O-d(IC)13诱导HCV肽特异性I类细胞免疫应答；实施例实施例1.来源于HCV的肽与HLA II类分子的结合根据WO04/024182，合成几种掺入重叠的反应性HCV肽或不含关键残基(如半胱氨酸)的序列的新肽。重新检验这些新肽与II类可溶性HLA分子的亲和力并将结果与用原始肽获得的结果进行比较(表1)。
表1.所选来源于HCV的肽和其15mer对应物与可溶性HLA II类分子的结合(“+++”强亲和力，“++”中等亲和力，“+”弱亲和力，“-”无亲和力，“nd”没有进行；核心结合基序用下划线标出)。
在肽1798的情况下，与其更短的对应物(B84-B96)相比其对DRB1*0101和DRB1*0401的亲和力消除可能是由于长序列(26个氨基酸)的原因造成的，所述长序列可具有阻止结合的二级结构。可以预期在体内，在蛋白水解酶切割后，肽1798将产生两个更短的II类表位。除去肽1827和1829(分别为肽C114和1604的衍生物)上的半胱氨酸(C)残基似乎对结合DRB1*0401分子是至关重要的但不会本质上改变对其它受试DR亚型的亲和力。
实施例II.HCV表位热点的鉴定和表征如上所述，T细胞表位热点(“热点”)被定义为至少包含超过一种T细胞表位的短肽序列。例如，两种或多种表位相互之间具有很短间隔(很短间隔定义为少于5-10个氨基酸)，或相互之间直接相连，或部分或甚至完全重叠。热点可以只包含I类或II类表位或包含两者的组合。热点上的表位可具有不同的HLA限制性。
由于I类和II类抗原加工的高度复杂性和选择性途径(参见导言)，仅根据多肽的序列不能容易地预测T细胞表位。尽管被广泛地使用，但用于细胞表位预测的计算机算法会产生高比率的假阴性和假阳性。
因此，多肽序列内甚至单个T细胞表位也不易判明，对于热点更是如此。根据本发明将几种完全不同的实验方法组合起来以对T细胞进行表位鉴定，包括表位捕获，HLA转基因动物和人单核细胞的体外刺激。将所有三种方法系统地应用于跨越目的抗原的重叠肽上，使能够对表位进行综合鉴定。在进行这种不限定于特定的HLA等位基因而是揭示群体内所有可能被靶向的表位的综合分析后，表位热点才可变得显而易见。在抗原内，只有少数(如果有的话)序列显示热点特征。因此热点鉴定总是件令人惊奇的事情。
T细胞表位热点提供重要的有利方面热点可激活和可被受试者的不同T细胞克隆识别。热点(当包含具有不同HLA限制性表位时)可与来自不同的非HLA匹配个体的T细胞相互作用。
目前基于表位的疫苗已瞄准所选普遍性HLA等位基因，例如HLA-A2，所述基因在大约一半的白人体内表达。因为其他等位基因频率较低，所以具有广泛世界人口覆盖性的基于表位的疫苗必须包含许多不同的表位。疫苗中化学实体(例如肽)的数目受限于来源于生物、配制和产品稳定性的限制。
热点使这种具有广泛的世界人口盖度基于表位的疫苗成为可能，因为其通过有限数目的肽提供了显著大量的表位。
表2HCV保守区域内的T细胞表位热点。
以粗体显示热点(包括一些变异)，包含于热点内的表位以正常字体(normal font)显示。给出肽的数目和序列以及HLAI类和II类覆盖度。如果原始数据不是由WO04/024182提供的，那么就参考文献资料。
实施例III.HCV表位热点Ipep 1426至少包含HLA-A*0201和几个混杂II类T细胞表位该实验的主要目的是将“热点”Ipep 1426的免疫原性与单个表位的进行比较，所述Ipep 1426包含至少一个HLA-A*0201表位(Ipep1334)和2个混杂的II类表位(Ipeps 1006和1425)。用1426或者用1334、1006、1425的混合物体外刺激来自几个健康HLA型血液供体的外周血单核细胞(PBMC)。进行三轮刺激产生寡克隆T细胞系。然后，通过γ干扰素(IFN-γ)ELIspot分析估计针对所有四种肽的应答。
肽1426，诱导类似于包含于其序列中单个表位所诱导的T细胞应答。特别地，成功地产生了针对HLA-A*0201限制性表位1334的CD8阳性T细胞。
表3肽诱导的寡克隆T细胞系的IFN-γ分泌。
通过在体外用肽1426或用肽1006+1425+1334的混合物进行三轮引发，从两个HLA型健康个体产生细胞系。通过IFN-γ ELIspot估计在这些系中CD4阳性和CD8阳性T细胞的反应性(“+++”非常强，“++”强，“+”显著，“-”无IFN-γ分泌)。
实施例IV.通过五种不同的HCV衍生的肽、抗微生物肽KLK和合成的寡脱氧核苷酸o-d(IC)13的组合注射诱导强烈的HCV特异性I型细胞应答。
小鼠HLA-A*0201转基因小鼠(HHD.1)肽 将肽p83、p84、p87、p89、p1426用于疫苗。
p83HCV-衍生的肽，(KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL)p84HCV-衍生的肽，
(GYKVLVLNPSVAAT)p87HCV-衍生的肽，(DLMGYIPAV)p89HCV-衍生的肽，(CINGVCWTV)p1426HCV-衍生的肽，(HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA)p1274作为非相关肽用于再刺激(YMDGTMSQV；HLA-A*0201限制性的)通过标准的固相F-moc合成方法合成所有多肽，用HPLC纯化和通过质谱学分析纯度。
剂量每种肽200ug/小鼠通过MPS(Multiple Peptide System，USA)合成KLKKLKLLLLLKLK-COOH剂量10nmol/小鼠通过Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成oligo-d(IC)13(＝ODNla)ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICICICIC3′剂量0.4nmol/小鼠制剂 10mM Tris/135mM NaCl；pH～7
建立实验(5只小鼠/组)1.HCV肽2.HCV肽+KLK+o-d(IC)13在第0、14和28天给HHD.1小鼠两只后爪皮下(s.c.)注射含有上面所列化合物的总体积为100μl/小鼠(50μl/爪)的试剂。在第35天(最后一次免疫后7天)通过磁力分离(MACS，Miltenyi)从脾细胞的单个细胞悬浮液中分离CD4+和CD8+T细胞。用介质(背景对照)温育T细胞，或在用于接种的不同肽或非相关肽p1274存在的情况下，用来自新生HDD.1小鼠的经辐射的脾细胞作为APC再免疫T细胞。过夜温育后，使用ELIspot测定分析IFN-γ产量。
图1显示在用五种来源于HCV的肽和KLK/o-d(IC)13共注射后，诱导了大量由抗p84、p87、p89、p1426的CD4+T细胞产生的IFN-γ。此外，检测到由抗p87、p89的CD8+T细胞的强IFN-γ产生。
实施例V肽混合物(HCV肽加多聚L精氨酸)的溶解肽混合物包含肽83、84、87、89、1426和作为免疫素的pR(参见表4)，其中肽83和84溶于水和DMSO，肽87和89水溶性较差但能容易地溶于DMSO中，而肽1426只溶于DMSO。为生产悬浮制剂，首先必需将肽83和84溶解在缓冲水溶液中，将肽87、89和1426溶解在DMSO中。灭菌过滤后可将所述溶液混合形成最终的悬浮液。
水/乙腈混合物以及DMSO和DMF不能用作溶剂，并且其会产生这样的悬浮物，所述悬浮物由于堵塞过滤器从而不能进行灭菌过滤。令人吃惊的是发现50％的乙酸/水混合物溶解所有组分。所获得的包含上述肽的肽溶液可容易地灭菌过滤而无任何过滤堵塞。
表4 肽混合物I
下列实施例(实施例V.1至V.12，表5至16)说明，包含至少两种具有可变长度的肽的肽混合物和根据本发明氨基酸组合物适合溶解。此外表中显示已知的肽对HLA I类和II类分子的亲和力。
实施例V.1表5 多肽混合物II
实施例V.2表6多肽混合物III
实施例V.3表7多肽混合物IV
实施例V.4表8多肽混合物V
实施例V.5表9多肽混合物VI
实施例V.6表10多肽混合物VII
实施例V.7表11多肽混合物VIII
实施例V.8表12多肽混合物IX
实施例V.9表13多肽混合物X
实施例V.10表14多肽混合物XI
实施例V.11表15多肽混合物XII
实施例V.12表16多肽混合物XIII
实施例VI.设计本发明进一步的HCV疫苗变体的基本原理表17优选的“热点I”组合
优选的热点I组合的特征肽的数目12通过半胱氨酸的潜在的肽相互作用在3个肽(1846、89、1547)中存在4个Cys；潜在的肽同型和异型二聚体以及寡聚体的形成。
覆盖的HCV抗原数目5(核心、E2、NS3、NS4、NS5)覆盖的HLA I类等位基因至少8个A2(8次)、A3(2次)、A11(2次)、A24(1次)B7(2次)、B35(1次)、B60(1次)Cw7(1次)覆盖的HLA II类混杂肽结合的多个等位基因DR1(8次)、DR4(6次)、DR7(8次)、DR11(7次)优选的热点I组合由来源于5个不同HCV抗原的保守区(在基因型1、2、3中＞80％)的12个肽组成。总共覆盖了至少8个重要的HLAI类等位基因(每个基因1-8次)，其在欧洲中提供了83-91％的人口覆盖，在美国白种人提供了89-91％的覆盖，在日本人中提供了87-89％的覆盖(根据来自HLA-prevalence studies，Gjertson和Terasaki，编，HLA 1998，American Society of Histocompatibility andImmunogenetics，Lenexa，Kansas，USA的数字进行估计)。类似地，覆盖了几种重要的HLA II类等位基因，主要由所谓的混杂肽(结合超过一种HLA II类等位基因)。单独地特别普遍的等位基因(DR1、4、7、11)被独立地覆盖了6-8次。重要的是，DR11被覆盖了7次。这些等位基因的存在与HCV感染的自发恢复有关联(Thursz等人，1999Lancet354(9196)2119-24)。包含于该热点组合中的大量表位不仅确保了广泛的人口覆盖度，从而确保了疫苗的实用性，而且还确保了在使用这种组合物治疗的个体中的广泛免疫应答。这是有功效的前提条件，因为HCV感染的自发恢复与通常针对10个或更多表位的广泛的免疫应答相关联(Day等人，2002 J Virol.76(24)12584-95)。
针对多个表位的T细胞应答也降低HCV表位逃避变体(不再包含被免疫应答靶向的表位的HCV病毒)演变的风险，因为在同一时间被靶向的表位越多，病毒同一时刻改变其自身越困难。在黑猩猩上的实验已确定这些HCV逃避变体是维持慢性感染的重要机制(Weineretal，1995 Proc Natl Acad Sci U S A.92(7)2755-9)。
最后，靶向大部分HCV抗原(核心、E2、NS3、4、5)而不是例如仅靶向一个也提供了重要的有利方面不同的抗原可被T细胞差异地识别(例如由于抗原加工上的差异的原因造成的，或由个体的特定HLA单元型控制的)。还有，在HCV生命周期中，不同抗原具有不同的功能重要性。
热点I组合也包含来源于热点(Ipep87来源于Ipep87EX，Ipep89来源于Ipep89EX)的单个表位。这具有将想要的应答故意集中在特定表位上的有利方面。例如使用Ipep89保证产生HLA-A2限制性CTL应答，尽管使用89EX可导致HLA-A2限制性CTL应答，但该应答可被伴随的DR4或DR7限制性T辅助细胞应答削弱。
使用热点组合具有优于使用全长抗原(无论是以重组蛋白或作为DNA疫苗的形式)的许多有利方面。如在前面段落中所详细说明的，在某些情况下使用单个表位可优于使用热点或完整的抗原。其次，通过主要使用Th1/Tc1型反应(即V干扰素)作为示值读出进行功能测定已鉴定了此处公开的热点。众所周知，抗原不仅包含这种激动性表位，而且也可以编码拮抗性配体。这种拮抗剂潜在地存在于整个抗原上，但在热点上的缺少可妨碍疫苗的免疫原性和有效性。再次，完整的抗原几乎一定会诱导体液免疫应答。这种抗体应答自身对存在于细胞内的HCV具有很小的影响，但其可以严重地削弱想要的T细胞应答。热点，由于其有限的长度，不太可能诱导不想要的抗体应答。最后，在不同基因型之间只有HCV抗原中相对小的部分保守。因此，用于疫苗的完整抗原可以诱导针对非保守区域或表位的应答，所述应答与大多数患者无关。相反地，此处公开的热点来源于在主要的HCV基因型1、2和3中保守性大于80％的区域。
表18优选的“热点II”的组合
优选的“热点II”的组合的特征肽数目7通过半胱氨酸的潜在的肽相互作用1个Cys(1846)；潜在的1846的同型二聚体的形成。
覆盖的HCV抗原数目5(核心、E2、NS3、NS4、NS5)覆盖的HLA I类等位基因至少7个A2(5次)、A3(2次)、A11(2次)、A24(1次)B7(2次)、B35(1次)Cw7(1次)覆盖的HLA II类混杂肽结合的多个等位基因DR1(6次)、DR4(5次)、DR7(5次)、DR11(5次)优选的热点II组合由来源于5个不同的HCV抗原的保守区(在基因型1、2、3中＞80％)的7个肽组成。总共覆盖了至少7个重要的HLA I类等位基因(1-5次)，在欧洲提供了81-90％的人口覆盖，在美国白种人提供了89-91％的覆盖以及在日本人中提供了85-88％的覆盖(根据来自HLA-prevalence studies，Gjertson和Terasaki，编，HLA 1998，American Society of Histocompatibility andImmunogenetics，Lenexa，Kansas，USA的数字进行估计的)。类似地，覆盖了几种重要的HLA II类等位基因，其主要由所谓的混杂肽(结合超过一个HLA II类等位基因)。单独地特别普遍的等位基因(DR1、4、7、11)被独立地覆盖了5-6次。重要的是，DR11被覆盖了5次。这些等位基因的存在与HCV感染的自发恢复有关联(Thursz等人，1999Lancet354(9196)2119-24)。
与组合I相反，组合II具有明显更少的肽(7比12)，组合II在这种产品的可生产性、配制和竞争性生产上具有潜在的有利方面。重要的是，只存在一种具有半胱氨酸侧链的肽(1846)。因此，在这种组合中只形成1846的同型二聚体而不会形成异型二聚体或寡聚体。
同时，组合II覆盖相同的5个HCV抗原和与组合I相似数量的HLA I类和II类等位基因。因此，在前面部分讨论的观点也适合于组合II。
从制剂开发的观点上看，组合II具有优于组合I的有利方面(只有7个而非12个组分)。最重要的是，只有一种肽(1846)携带自由半胱氨酸侧链。因此，只可能形成1846的同型二聚体而不可能形成异型二聚体或寡聚体。
实施例VIIHCV疫苗102剂量最优化试验产生T细胞免疫原性在临床试验过程中，将许多肽/多聚精氨酸混合物用作疫苗给健康志愿者施用。各组由12个受试者组成，受试者呈HLA-A2阳性。受试者接受4次接种，每次间隔一个月(在3至6月随访)。在第1次访问至第6次访问，在最后一次接种后一个月(第7次访问)和在最后一次接种3个月后(第8次访问)抽取血液用于免疫学分析。为了监控临床试验，Intercell已建立用于确定在GLP/GCP应变性下免疫学终点的具有当今技术水平的T细胞测定法γ干扰素ELIspot测定法、T细胞增殖测定法、HLA四聚体/FACS测定法。这些测定法允许对由治疗性HCV疫苗诱导的表位特异性T细胞应答进行可靠的测量。所述疫苗诱导的T细胞免疫应答用作功效的替代参数(Keilholz等人，JImmunother.2002Mar-Apr；25(2)97-138)。
通过T细胞增殖测定法确定作为初级终点(primary end point)的T细胞免疫原性。
增殖测定法允许在生物学样品(如人血)中检测肽特异性T细胞。所述测定法的基本原理是，T细胞在用其T细胞抗体特异性识别的肽刺激后，通过分泌细胞因子和随后进行增殖来产生反应。可通过各种方法测量细胞的增殖；最灵敏的方法按照将放射性标记的胸苷整合到细胞分裂前合成的DNA中的量进行分级。该反应可在96孔板中进行。各孔含有固定数量的细胞，所述细胞在抗原/肽存在的情况下培养数天。在最后16-20小时加入用氚标记的胸苷(3H-胸苷)。然后将细胞收集到滤纸板上含游离放射性的培养基介质被清洗掉，但DNA粘附在滤纸上。通过β闪烁计数器可对掺入的放射性进行定量。通常产量以每分钟的计数表示(cpm)。
通过γ干扰素ELIspot确定作为次级终点的T细胞免疫原性ELIspot允许在生物学样品(如人血)中对肽特异性、功能性(即，分泌细胞因子)T细胞进行定量。所述测定法的基本原理是，T细胞在用所述T细胞受体特异性识别的肽刺激后通过分泌细胞因子如IFN-γ起反应。该反应可在96孔板中进行。用特异性针对IFN-γ的Mab包被该板的滤纸孔。然后，各分泌IFN-γ的细胞留下IFN-γ印迹，所述印迹随后可用颜色反应进行观察。使用自动板读数器可计算印迹数。获得的数目就是样品中肽特异性、分泌IFN-γ的T细胞的频率。
进行作为额外的次级终点的HLA-四聚体/FACS分析
HLAI类四聚体(HLA分子和抗原肽的复合物的可溶性重组形式)结合用于T细胞识别的抗原特异性T细胞受体。通过对荧光四聚体使用流式细胞仪，可容易地计算和表征抗原特异性CD8+T淋巴细胞。所述测定使用了与HCV疫苗I类表位复合的由Beckman CoulterImmunomics生产的根据HLA-A*0201定做的iTagTM-四聚体。
如果受试者在第4次至第8次访问中的任一次显示明显的T细胞应答而在处理前没有应答时，他们就被分类为应答者。
相对于接受盐水的25个受试者对照组中25％的比例，可获得高达92％的最高应答者比率(针对任何肽，在第4次至第8次访问中的任一次，在三种T细胞测定中的任一种中)。
Ipep89、Ipep84和Ipep1426中每个肽的应答者比率此处显示了针对T细胞表位热点肽pep89(I类T细胞表位)、Ipep84和Ipep1426的应答的例子。在4次每次间隔1个月的接种后获得这些应答。对于B组，使用只含有多聚L精氨酸的疫苗。对于C组，使用含有5种肽(包括Ipep89、Ipep84和Ipep1426)的混合物的疫苗。对于G组，使用含有与C组相同的5种肽的混合物和作为完全合成的T细胞佐剂的多聚L精氨酸的疫苗。
表19显示在对照组B中在ELIspot和HLA-四聚体/FACS分析中没有观察到应答者和观察到3个总计只有3次阳性观察的应答者。后者可以解释为在增殖测定中获得的假阳性应答者比率。
在只包含肽但没有多聚L精氨酸的C组中，观察到在ELIspot中1个针对Ipep84的应答者，在增殖分析中观察到5个和4个分别针对Ipep84和Ipep1426的应答者，以及在HLA-四聚体/FACS分析中4个针对Ipep89的应答者。最后G组(具有与C组中相同的肽再加上多聚L精氨酸)显示，在所有三种测定中观察到所有受试者都是应答者。重要的是，特别一致(所有三种肽)和持续的(参见完全阳性观察的数目)ELIspot应答表明功能性T细胞依赖于作为合成的T细胞佐剂的多聚L精氨酸。
表19在B、C和G组中每种肽的应答者和阳性访问数目。
注REV/PEIV应答者-ELISPOT应答者(I类或II类)；n/H(％)-每个肽的应答者除以处理组中应答者数目的比例RPII应答者-T-细胞增殖应答者(仅对II类)RFI应答者-HLA-四聚体/FACS应答者(仅对I类)疫苗应答者-任何RES/REIV，RPII或RFI1.T-细胞增殖应答仅对IPEP1426计算2.FACS应答仅对IPEP 89计算。
个体时程(ELISpot)例子G组受试者5表20显示了获自G组特定受试者的系列血点的干扰素γ，ELISpot结果(5肽+聚-L-精氨酸)。在访问5中(一个月于两次II类表位Ipep84免疫接种后的次级免疫)，1426显示应答，在第三次免疫后，在所有应答中达到峰值，I类表位Ipep89显示应答。此外，Ipep1426显示持续应答，即使在访问8的末次接种3个月后。
表20来自G组的5个受试者在一段时间内针对Ipep 89、84、1426的ELIspot值(每1百万PBMC的印迹数，减去背景的；将非显著值设为零)。
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权利要求
1.包含至少两种表位的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，其中各表位来自不同的热点表位，其中热点表位定义为包含选自下列的肽的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL，TTILGIGTVLDQAET，FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
2.权利要求1的HCV疫苗，其包含至少三种，优选地至少4种表位，各自来自不同的热点表位。
3.权利要求1的HCV疫苗，其包含至少5种表位，各自来自不同的热点表位。
4.权利要求1的HCV疫苗，其包含至少6种表位，各自来自不同的热点表位。
5.权利要求1至4中任一项的HCV疫苗，其特征在于所述表位选自下列KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，YLLPRRGPRL，LPRRGPRL，GPRLGVRAT，RLGVRATRK；GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVL，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT；DLMGYIPAV，GYIPLVGAPL，DLMGYIPLVGAPL；CINGVCWTV，GEVQVVSTATQSFLAT，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，MWNFISGIQYLAGLSTLPGN，NFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，QYLAGLSTL，HMWNFISGI；VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI，DYPYRLWHY，TVNYTIFKI，TINYTIFK，TVNFTIFKV，HYPCTVNYTI，HYPCTVNFTI，RMYVGGVEHR；AAWYELTPAETTVRLR，TPAETTVRL；GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLG，GQGWRL-LAPITAYSQ，RLLAPITAY，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，GQGWRLLAP-ITAYSQQTRGLLG，AYSQQTRGLL，AYSQQTRGL；IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAL-VAFK，ILAGYGAGV，VAGALVAFK，GYGAGVAGAL；VVCCSMSYTWTGALITPC，SMSYTWTGALITP，SMSYTWTGAL，SYTWTGALI；FTDNSSPPAVPQTFQV；LEDRDRSELSPLLLSTTEW，LEDRDRSELSPLLLST，RSELSPLLL，ELSPLLLST，DRDRSELSPL，LEDRDRSEL，LEDRDRSEL；YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，YLVAYQATV；MSTNPKPQRKTKRNTNR，PQRKTKRNTNR，QRKTKRNTN，RKTKRNTNR，MSTNPKPQR，MSTNPKPQK；LINTNGSWHINRTALNCNDSL，NGSWHINRTALNCNDSL，LINTNGSWHI，RTALNCND-SL，LINTNGSWHINRTALN，SWHINRTALN；TTILGIGTVLDQAET，TTILGIGTV，TILGIGTVL；FDSSVLCECYDAGAAWYE，FDSSVLCECYDAGCA，VLCECYDAGA，VVLCECY-DAGAAWYE；ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，ARLIVFPDL，RLIVFPDLGV，RVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV；GVLFGLAYFSMVGNW；TRVPYFVRAQGLIRA；TTLLFNILGGWVAAQ，LLFNILGGWV.
6.权利要求1至5中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含来自至少三种，优选地至少4种下列热点表位中的至少一种表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA.
7.权利要求1至6中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含来自至少两种，优选地至少三种，特别地至少4种下列热点表位中的至少一种表位VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR和LINTNGSWHINRTALNCNDSL.
8.权利要求1至7中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含来自至少两种，优选地至少三种、特别地至少4种下列热点表位中的至少一种表位TTILGIGTVLDQAET，FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
9.权利要求1至8中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含下列表位GYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIPAV，CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA
10.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK。
11.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位DLMGYIPAV。
12.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位CINGVCWTV。
13.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。
14.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位GYKVLVLNPSVAAT。
15.权利要求1至9中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含表位VVCCSMSYTWTGALITPC。
16.权利要求1至15中任一项的HCV疫苗，其特征在于其进一步包含含有序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之间的整数，优选地是5，X是带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基，Z是选自L、V、I、F和/或W的氨基酸残基，而R1和R2是相互独立地选自-H、-NH2、-COCH3、-COH、具有至多达20个氨基酸残基的肽或肽反应性基团或具有或不具有肽的肽连接体；X-R2可以是所述肽(“肽A”)的C末端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。
17.权利要求1至16中任一项的HCV疫苗，其特征在于其进一步包含具有式(I)结构的免疫刺激性寡脱氧核酸分子(ODN) 其中R1选自次黄嘌呤和尿嘧啶，任何一个X是O或S，任何一个NMP是2’脱氧核苷单磷酸或脱氧核苷单硫代磷酸，选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞嘧啶-、脱氧尿苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧肌苷-、5-甲基-脱氧胞嘧啶-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧-鸟苷-或N-异戊基-脱氧腺苷-单磷酸或-单硫代磷酸，NUC是2’脱氧核苷，选自脱氧腺苷-、脱氧鸟苷-、脱氧肌苷-、脱氧胞嘧啶-、脱氧肌苷-、脱氧胸苷-、2-甲基-脱氧尿苷-、5-甲基-脱氧胞嘧啶-、脱氧假尿苷-、脱氧核糖嘌呤-、2-氨基-脱氧核糖嘌呤-、6-S-脱氧鸟嘌呤-、2-二甲基-脱氧鸟苷-或N-异戊基-脱氧腺苷，a和b是0至100之间的整数，前提是a+b为4至150之间，和B和E是核酸分子(“I-/U-ODN”)的5’或3’末端的公共基团。
18.权利要求1至17中任一项的HCV疫苗，其特征在于其进一步包含Al(OH)3佐剂。
19.权利要求1至18中任一项的HCV疫苗，其特征在于其进一步包含聚阳离子肽。
20.权利要求1至19中任一项的HCV疫苗，其特征在于所述肽A是KLKL5KLK。
21.权利要求1至20中任一项的HCV疫苗，其特征在于所述I-/U-ODN是寡d(IC)13。
22.权利要求1至21中任一项的HCV疫苗，其特征在于其进一步包含含有CpG基序的寡脱氧核苷酸。
23.权利要求1至23中任一项的HCV疫苗，其特征在于其以在15分钟内在37℃下可重构的形式被冻干。
24.权利要求1至23中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含20μg至10mg的各表位。
25.权利要求1至24中任一项的HCV疫苗，其特征在于其被冻干且包含痕量乙酸。
26.权利要求1至25中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含至少两种下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DLMGYIPAV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，GYKVLVLNPSVAAT，CINGVCWTV，AAWYELT-PAETTVRLR，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，TAYSQQTRGLLG，HMWNFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
27.权利要求25的HCV疫苗，其特征在于其包含至少4种，优选地至少5种，特别地至少6种这些表位。
28.权利要求25的HCV疫苗，其特征在于其包含至少8种，优选地所有12种这些表位。
29.权利要求1至25中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含至少两种下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKVAAWYELTPAETTVRLR，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGK-VLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
30.权利要求29的HCV疫苗，其特征在于其包含至少4种，优选地至少5种，特别地所有12种这些表位。
31.权利要求1至30中任一项的HCV疫苗，其特征在于其包含至少一个A2表位，至少一个DR1表位，至少一个DR7表位或至少一个这些表位中的各个表位。
32.权利要求1至31中任一项的疫苗制备用于预防和治疗HCV感染的药物制剂的用途。
33.用于制备权利要求1至31中任一项的疫苗的方法，其特征在于下列步骤-通过化学方法合成至少两个权利要求1至15和26至31中定义的表位，-通过包含至少一种有机酸的水溶液溶解这些表位，所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其卤化或羟基化形式，-混合所述溶解的表位和-任选地冻干所述经混合的表位。
全文摘要
公开了丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，所述疫苗包含至少两种表位，各表位来自不同的热点表位，其中热点表位定义为包含选自下列序列的肽的表位KFPGGGQIVG－GVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLA-GLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT (V/I)N(F/Y) TIFK(V/I)-RMYVGGVEHRL，AAWYELTP AETTVRLR，GQGWRLLA-PITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVA-GALVAFK，FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLL-STTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRK-TKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL,TTILGIGTVLDQ-AET，FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVR-VCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYF-SMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRA-QGLIRA和TTLLFNILGGWVAQ。
文档编号C07K14/18GK1822856SQ200480019878
公开日2006年8月23日 申请日期2004年7月9日 优先权日2003年7月11日
发明者M·布什勒, J·弗里施, C·克拉德, K·林瑙, W·曹纳, G·策特尔迈瑟尔 申请人:英特塞尔股份公司