ACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
[0077]对本发明中生产的突变细胞系的核苷酸序列进行分析，并且结果可以看出，在来自MDCK细胞的K-E4、J-ClO和J-DlO细胞系的等位基因的移码突变。
[0078]如本文所用，术语“移码突变”是指导致能够读取三核苷酸的遗传密码的移码改变的1、2或更多个核苷酸(除3的倍数之外)的缺失或插入。
[0079]在突变细胞系中，J-DlO以保藏号KCLRF-BP-00285保藏。
[0080]另一个方面，本发明涉及一种细胞凋亡被抑制的产病毒突变细胞系的方法，所述方法包括突变在产病毒突变细胞系中的Bst-2基因。
[0081]在本发明的一个例子中，通过在VERO细胞系的Bst-2基因的外显子I区域中缺失1-12个核苷酸来生产D-D8和G-D5细胞系。结果表明，用HlNl或H3N2病毒感染的突变细胞系的细胞凋亡降低。
[0082]根据本发明的细胞凋亡被抑制的产病毒突变细胞系可以是动物细胞系。
[0083]动物细胞系可以是任何用于开发流感疫苗的细胞系。优选地，可以选自MDCK、VERO和小鼠成纤维细胞组成的组中。
[0084]根据本发明的突变可以是Bst-2基因的外显子I区域的一部分的插入、缺失、重复、倒置、取代或易位，整个Bst-2基因的外显子I区域的缺失，或Bst-2基因的沉默。
[0085]Bst-2基因的外显子I区域可编码Bst-2蛋白的胞质域。
[0086]在本发明的另一个例子中，发现将野生型Bst-2基因导入到Bst缺失的小鼠成纤维细胞时，出现类似于野生型细胞系的细胞凋亡，但是当导入具有胞质域缺失的Bst-2基因时，细胞凋亡减少，这与Bst-2缺失的细胞系相似。
[0087]在本发明的另一例子中，表明野生型Vero细胞在感染流感病毒后经历细胞凋亡，并且因此显示出低的病毒生产能力，而Bst-2突变的Vero细胞的病毒诱导的细胞凋亡减少并在3天后显示出病毒生产能力增加了 50倍以上。
[0088]在本发明的又另一例子中，具有缺失参与细胞凋亡的胞质域的Bst-2基因在正常小鼠成纤维细胞中额外表达以干扰正常基因的功能。结果观察到，细胞生产病毒的能力。另外观察到，当在对病毒具有增加的能力的Bst-2缺失的B2K细胞系中表达具有胞质域缺失的Bst-2基因时，细胞维持病毒生产能力。这证明细胞病毒生产能力的增加归因于细胞凋亡的减少。
[0089]在又另一个方面，本发明涉及突变细胞系，其中导入在产病毒细胞系中不表达Bst-2的突变的Bst-2基因，其中该突变细胞系通过引入突变的Bst-2基因而具有增加的病毒生产能力。
[0090]Bst-2突变基因可以具有在野生型Bst-2基因的外显子I区域的一部分中的一个或多个核苷酸的插入、缺失、重复、倒置、置换或易位，或野生型Bst-2基因的整个外显子I区域的缺失，或Bst-2基因的沉默。
[0091]在又一个方面，本发明涉及一种生产所需病毒的方法，该方法包括以下步骤:(a)用所需病毒感染具有增加的病毒生产能力的突变细胞系；和(b)培养被所需病毒感染的细胞系，然后离心培养物的上清液以回收所需病毒。
[0092]在本发明中，将具有移码突变的细胞铺于6孔平板，培养24-48小时，然后接种到含有流感病毒的培养基。
[0093]细胞的数目可以是IX 14至IX 10 7，优选5X 14至5X10 6，更优选IX 15至IXlO60
[0094]接种到培养基中的病毒优选在5% CO2培养箱中于37°C感染30分钟到2小时。
[0095]可以将感染的病毒在新鲜培养基中孵育50-70小时，然后可以收集培养基并在合适的条件下离心，收集上清液。优选地，可以在4°C至15°C以1500-5000rpm进行离心5_15分钟来收集上清液。
[0096]在本发明中，检查在没有表达Bst-2基因的突变细胞系的病毒感染时形成的菌斑。
[0097]突变细胞系在培养基中稀释，并用病毒感染，然后培养。结果可以看出，突变细胞系的病毒生产能力增加。
[0098]对病毒具有增加的能力的突变细胞系可以用于生产预防或治疗由流感病毒引起的疾病的疫苗。
[0099]在进一步的方面，本发明涉及一种生产针对病毒疾病的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤:(a)用所需病毒感染具有增加的病毒生产能力的突变细胞系；和(b)培养被所需病毒感染的细胞系，然后离心培养物的上清液以回收所需病毒；和(C)衰减或灭活回收的病毒。
[0100]疫苗组合物可以进一步包含药学上可接受的佐剂或赋形剂。作为佐剂，可以使用任何佐剂，只要它在向体内注射时可以促进抗体形成以实现本发明的目的。具体地，佐剂优选铝酸盐(Al (0H)3、AlPO4)、角鲨烯、脱水山梨醇、聚山梨醇酯80、CpG、脂质体、胆固醇、MPL(单磷酰脂质A)和GLA (吡喃葡萄糖基脂A)中的一种或多种，但并不限于此。
[0101]实施例
[0102]以下，参照实施例对本发明进行更详细地说明。对本领域的普通技术人员这显而易见的是，这些实施例是说明性的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物来限定。
[0103]实施例1:Bst_2突变的MDCK细胞系的生产和其中突变的确认
[0104]将5X 15个从Moon-Jung Song教授(韩国大学，韩国)的实验室获得的野生型MDCK细胞在100Φ培养皿中的DMEM完全(GIBC0，美国)培养基(含有10% FBS，2mM的L-谷氨酰胺，5 μ M的β -巯基乙醇，10 μ g/ml庆大霉素，50U/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素)中培养24小时。然后，将15 μ g的一对能够结合由SEQ ID NO:1所代表的Bst_2基因的外显子I区域的TALEN载体(ToolGen，韩国)，一个报告载体(ToolGen，韩国)和Turbofect试剂(Thermo，USA)的混合物加入到培养的细胞中，然后在37°C，5% CO2的条件下孵育48小时。
[0105]将培养的细胞通过FACS Aria (BD B1science，美国)进行分选，以筛选500个对GFP和RFP呈阳性的细胞，并将所筛选的细胞接种在96孔板中，由此获得单克隆细胞。
[0106]为了证实在所得到的单克隆细胞中的突变，向单克隆细胞中加入裂解缓冲液(50mM 的 Tris-Cl，pH8.0，50mM EDTA, 1% SDS，1mM NaCl，100 μ g/ml 蛋白酶 K) (300 μ I)然后在54°C孵育16小时。然后，向培养的细胞中加入300 μ I的苯酚和氯仿的1:1混合物中并混合，然后以1700Xg离心10分钟。将上清液(300 μ I)转移到新管中，并向其中加入100%乙醇(600 μ I)和3Μ乙酸钠(90 μ I)，然后以1700xg离心10分钟。然后，除去上清液，向剩余的材料中加入Iml的70%乙醇，然后以1700Xg离心2分钟。然后，除去上清液，并将残留在底部的基因组DNA干燥3分钟，然后悬浮于50 μ I的去离子水(DW)中。使用由SEQ ID NO:11所代表的dBst-2-F引物和由SEQ ID NO: 12所代表的dBst-2-R引物，在下列条件下对提取的基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR):95°C 5分钟，然后25个循环，每个循环包括94°C 30秒，60°C 30秒和72°C I分钟，随后72°C 10分钟。
[0107]将反应产物稀释至10 3，并使用由SEQ ID NO:13所代表的NdBst-2-F引物和由SEQ ID NO:14所代表的NdBst-2-R引物在下列条件下进行PCR:95°C 5分钟，然后25个循环，每个循环包括94°C 30秒，60°C 30秒和72°C I分钟，随后72°C 10分钟。
[0108]SEQ ID NO:11:GGTCAGGATGGCTCCTATGC
[0109]SEQ ID NO:12:AACCTGACAGGGTCACCTGG
[0110]SEQ ID NO:13:GTAGCCCCAGCCAAAGGTTTC
[0111]SEQ ID NO:14:AGGCCTCCCCATGCCCAAAC
[0112]为了确认在反应产物中的靶区域中的突变，将反应产物在下述条件下通过PCR熔化并退火:保持95°C 5分钟，温度以2°C /秒的速度从95°C降低到85°C，温度以0.3°C /秒的速度从85°C降低到25°C，并停止在16°C。然后，将得到的反应产物用T7E1酶(ToolGen，韩国)处理并在37°C孵育15分钟，之后通过电泳分析反应产物大小。结果表明，在由SEQID NO:1所代表的外显子I区域中具有假定突变的细胞系具有一个正常PCR反应产物大小和两个额外由内切酶切割所造成的条带，表明在外显子I区域中发生了突变(图1)。
[0113]为了分析被证实具有突变的细胞系的核苷酸序列，将PCR反应产物用Bgl I1-XbaI消化，与PUC18载体连接，并在含有氨苄青霉素和X-gal-1PTG的培养基中培养，由此得到白色菌落。在获得的白色菌落中，对每个克隆选择6个菌落并测序。
[0114]结果表明，在具有Bst-2的外显子I区域的核苷酸缺失或插入的7种突变细胞系(K-E4、J-C10、J-D10、D-E2、K-G3、J-E2 和 H-G5)中，3 种突变细胞系(K-E4、J-C10、J-DI O)具有在一对等位基因中发生的移码突变。
[0115]实施例2:Bst-2突变VERO细胞系的生产和其中突变的确认
[0116]将5X 15个从Chengyu Liang教授(南加州大学)的实验室获得的野生型VERO细胞在100Φ培养皿中的DMEM完全(GIBC0，美国)培养基(含有10% FBS，2mM的L-谷氨酰胺，5 μ M的β -巯基乙醇，10 μ g/ml庆大霉素，50U/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素)中培养24小时。然后，将15 μ g的一对能够结合由SEQ ID NO:2所代表的Bst_2基因的外显子I区域的TALEN载体(ToolGen，韩国)，一个报告载体(ToolGen，韩国)和Turbofect试剂(Thermo,USA)的混合物加入到培养的细胞中，然后在37°C，5% CO2的条件下孵育48小时。
[0117]将培养的细胞通过FACS