抑制素组合物和提高生产能力的方法

专利名称：抑制素组合物和提高生产能力的方法
发明所属技术领域一般来说，本发明涉及通过向鸟类施用一种包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的异源蛋白来提高鸟类生产能力的方法。本发明也涉及通过向鸟类施用一种融合基因产物来提高鸟类生产能力的方法，这种基因产物包含编码α-亚基鸟类抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。本发明还涉及上述的异源蛋白和融合基因产物以及产生这些产物的方法。
背景技术：
平胸类是不能飞行的，一般来说是大的行走(running)鸟类，这种鸟类涉及几个目，包括下列物种鸵鸟、食火鸟、Rhea、食火鸡和无翼鸟。食火鸟(Dromiceius novaehollandiae)是澳大利亚平胸类鸟，其特征在于初级翼及羽状头和颈。成年食火鸟高平均为大约6英尺，重大约150磅。驼鸟(Struthio camelius)是大的行走鸟类，其翼很小但腿很发达。标准成年驼鸟高大约8英尺，重大约325至375磅。名词＂rhea＂是鸟类目Rheiformes成员的通称。Rheiformes是南美洲行走鸟类目，称为美洲鸵鸟，其在其它特征上与真正鸵鸟的区别是它们体积小，具有羽状头和颈及三趾足(feet)。
鸵鸟和食火鸟长期以来在它们的天然生长环境南部非洲和澳大利亚分别具有重要的商业价值。对驼鸟产品的需求已有100多年了，实质上它们的兽皮、肉和羽毛有广阔的市场。例如，驼鸟皮用于靴子、手提包、外套、手提皮包、皮夹和许多其它物品。驼鸟羽毛用于时装、化妆服和羽毛掸子。
相比而言，食火鸟是市场的新商品。对于加入了化妆品工业中使用的精油之相同的产品来说它是有价值的。皮下厚脂肪层提供的食火鸟油具有很强的渗透性，这种渗透性使之在化妆品乳油(例如去皱润肤剂)中是有用的。而且对食火鸟油的可能的医疗用途(如治疗关节炎)正在进行试验研究。典型的成年食火鸟身高可达到1.6至1.9米或更多，体重可达30至45kg或者更多。食火鸟大约在一年成熟，青春期前后的食火鸟从来没有显示出性特异性表型差异。和驼鸟类似，在过去的几年里美国的食火鸟种群也经历了急剧增长的时期。在美国，1994年食火鸟总数大约在150,000只(包括15,000对繁殖期的食火鸟)。预计1995年食火鸟总数将进一步增加到500,000至750,000只，其中估计有45,000对繁殖期的食火鸟。
在一些国家对平胸类产品的需求日益增长，这些国家包括澳大利亚、比利时、以色列、加拿大、荷兰、纳米比亚、南非和津巴布韦。因此，在过去的几年中，驼鸟、食火鸟以及程度较轻的rhea的国内市场急剧增长。在过去的5年中，在美国能繁殖的驼鸟对数量和鸵鸟总量分别增加了7.5和20倍。据估计在1995年包括20,000对能繁殖的鸵鸟在内，美国将有200,000只鸵鸟。饲养这些动物的巨大的利益在于成年鸟以及幼鸟的明显价值，尤其是能繁殖的鸵鸟的价格高达每对$75,000.OO或更多，能繁殖的食火鸟每对达$30,000.00或更多。三至四个月龄的幼年驼鸟的价格大约为$7,500.00，幼年的食火鸟的价格大约为$5,000.00。这些鸟的大多数是在三至六个月龄时被购买。
此外，把养殖平胸类作为替代传统形式的畜牧业有很大利益。一些与平胸类有关的因素使养殖平胸类优先成为替代一些传统形式的畜牧业(即养殖肉牛、猪和羊)的方式。这些因素包括较高的食物转化率、更大的集中饲养的能力、大的体形，提高的繁殖能力和这些动物特殊的肉营养价值。
例如，和鸡肉或者火鸡内相比，类似牛肉的红色驼鸟肉包含极少的脂肪、卡路里和胆固醇。更具体地说，85克的驼鸟肉含有2克脂肪、58毫克的胆固醇和97卡的热量。相反，85克的火鸡肉含有3克脂肪、59毫克的胆固醇和135卡的热量。86克的鸡肉含有3克脂肪、73毫克的胆固醇和140卡的热量。85克的牛肉(牛排)含有15克脂肪、77毫克的胆固醇和240卡的热量。最后，85克的猪肉含有19克脂肪、84毫克的胆固醇和275卡的热量。(驼鸟肉的数值来自AMSI质量实验室报道#0800100。其它肉的数值来自U.S.D.A手册No.8，“食品的营养价值”)。和驼鸟相类似，食火鸟肉是一种低脂肪的红色肉。更具体地说，100克的食火鸟肉含有1.7克脂肪、57.5毫克的胆固醇和109卡的热量(食火鸟肉的数值来自得克萨斯公司的Silliker实验室)。
而且，如鸵鸟等的平胸类在12月龄时能提供大约100磅肉，因此在一段较短的时间内提供了相当多的肉。
平胸类何以是优于传统形式的畜牧业的替代物的例证是下列鸵鸟和牛的比较。首先，驼鸟有42天的妊娠或孵化期，而牛需要280天。第二，平均每只驼鸟每年生产20多个后代，而牛每年生产一个后代。第三，驼鸟的食物转化率不到2∶1，而母牛的食物转化率是5∶1。第四，鸵鸟从受孕到屠宰的天数为大约407天，而牛为645天。最后，鸵鸟除了肉和皮革之外，它们还有羽毛，而牛不能生产除了肉和皮革之外的产品。
考虑这些属性以及世界人口对肉类需求的日益增长(肉具有营养价值且脂肪和胆固醇含量低，并且可以以对环境的最小负面影响有效地生产肉类)，平胸类工业未来的增长有很高的潜力。
目前对平胸类的需求远远大于供给。然而，在大多数育龄雌性平胸类中，平胸类生产者受到不理想的蛋生产的限制。依据不同的物种，目前大多数平胸类的生产能力为每年10-20个蛋，而认为它们产蛋的遗传潜力每年超过60个。例如，野生的高产鸵鸟在繁殖时期大约每48小时产一个蛋，野生的高产食火鸟在繁殖时期大约每72小时产一个蛋。相比之下，鸵鸟的产蛋能力通称是5-10天产一个蛋，食火鸟通常4至8天产一个蛋。
只有每年产生足够数量的平胸类子代，平胸类的屠宰市场才能发展。按照某些预测，为了保持屠宰市场的供给，每年必须至少有250,000个鸟。因此，提高生产能力的方法将大大促进屠宰市场的发展。因此，需要提高鸟类(特别是平胸类，如鸵鸟和食火鸟)生产能力的组合物和方法。
除了最近出现的平胸类工业外，也存在许多涉及已经发展得很好的家禽物种的工业，主要是蛋鸡(单冠白来亨鸡(Single Comb White Leghorn))、肉鸡(适合烤焙的鸡)、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑。世界范围内对家禽肉和蛋产品的需求是巨大的，并且在过去的10年里，一直在稳定地增长。
以下试图描述美国家禽肉工业(除了平胸类生产)的规模和复杂程度。为了便于讨论，应该知道目前的人口数字(美国人口普查，1990数据)表明美国大约有250百万居民。此外，到2000年美国的人口计划为大约275百万，这个数字代表从1990年到1995年的25百万人口的增长(使用U.S.D.A1995年计划数字)。每人消耗的适合烤焙的鸡肉和火鸡肉平均分别为76.7和18.1磅(参见，未署名的，家禽加工参考手册，肉类加工，Vol.33(9)22-25.(1994)和Bowman，M.，牛肉和猪肉食品产值的竞争，肉类加工，Vol.33(12)16-25，(1994))。在过去的5年里折算成每人平均消耗的家禽肉为94.8磅。
另外，据报道家禽肉消费呈稳定增长趋势。例如，每人消费的鸡已增加了大约28磅(从1985年55.6磅到1995年83.5磅)。同样，每人消费的火鸡已增加了大约2.5磅(从1989年15.9磅到1995年18.4磅)。预计这种鸡和火鸡肉产品消费趋势的增加将随着人类人口的预期增长(参见上文引用的数字)而增加。如果这两个预测正确，那么至2000年，只在这个国家每年将消耗大约16.6百万吨鸡和火鸡肉。这种家禽消费增加的趋势与下列事实直接相关，即认为家禽肉是对＂心脏有益的＂食品(动物脂肪含量低)，并且由于其便宜的价格(pricewise)，其在与更贵的红色肉(如牛肉、猪肉和小羊)竞争上具有优势。
由于对产品的需求日益增长，因此提高鸡和火鸡生育母鸡的生产能力对目前快速增长的工业具有重要的经济价值。满足消费者需求和保持肉价格的竞争优势，鸡和火鸡的生育者的任务是继续生产尽可能多的种蛋。因此，任何能够增加蛋生产(甚至是小量的增加)的方法都将产生重要的经济效益。
例如，在一个生产周期(大约为1年)另外产15个蛋的单一生育鸡的母鸡(以饲养一个母鸡为基础)的方案如下。以目前市场鸡的价格($0.16/鸡)出售这些额外孵化的鸡，将获得$2.00的收入，继续饲养这些鸡，出售鸡肉将获得$10-12.00的收入(是考虑到饲料成本和固定成本的合适推断)。因为估计到在美国生育鸡的母鸡超过60百万只母鸡，所以经济收益为大约$750+百万。保守地估计来自家禽(包括所有其肉类消费增加的家禽，不包括平胸类)工业肉方面(meat-side)的全部收入在$1-2十亿之间(包括可以由火鸡生育者(以及母鸡，包括鸦、鹅和鹌鹑的专业化家禽业务和上文讨论的鸡肉在内的雌鸟)生产能力提高而预测的收入)。
应该注意到，家禽业在这个国家主要作为食用蛋业首先发展的。接下来当为提高家禽的体重(肉鸡肉)而进行选择时，这种遗传选择对蛋生产率是有害的。换句话说，蛋生产与选择增加的体重后所发现的遗传变化呈负相关。因此，通过内分泌操纵(本发明考虑了这一点)提高鸡和火鸡的雌禽(肉型禽)的生产能力的潜力在肉型禽中大于单冠白来亨鸡(自19世纪20年代末为加强蛋生产选育的禽)。另一方面，如下所述，在美国产蛋禽比生育鸡的禽多出3至4倍。因此，当考虑到可能影响的鸟群的大小，甚至产蛋鸟生产能力很小的改进都是巨大的。
下面讨论食用蛋业在这个国家的规模和重要性。人均蛋消费自1989至1992年保持在相当稳定的水平，其变化范围为30.0至30.4磅(参见表653主要食品的人均消费，美国1984-92；农业统计表，1993，U.S.D.A.国家农业统计表，U.S.Govt.印刷办公室，华盛顿特区，p.457；1993和1994的数据没有)。食用蛋消费增长速率在美国一直停滞可能主要与公众担心消费过多的胆固醇含量很高的蛋黄有关。
尽管人均蛋消费率呈稳定趋势，但产蛋禽的数量却稳定地增长，从1990年的228.8百万只雌禽到1994年的240.7百万只(参见Bell，D.D.，加利福尼亚大学统计报告月刊，表28产蛋禽本月农场中的数量，1980-93，UC Riverside)。产蛋雌禽的数量不断增加的趋势简单地反应了对蛋需求的增加，以满足人口的增加、蛋和蛋产品出口的增加或者还有其它不确定的因素。无论什么理由，由于世界上几乎80％的蛋生产不在美国，这表明在美国食用蛋市场上任何可认识到的积极影响可能扩大5倍，以达到其对世界范围经济的影响。然而，如果把这种计算只限定在美国，以人均消费量稳定在大约30.2磅和在下一个5年中美国人口将增加到275百万为基础，这样到2000年，只在这个国家每年将生产4.2百万吨鸡蛋。
由于许多影响决策的来亨鸡生产周期的复杂特性(如通过换羽更新小母鸡的成本、换羽对换羽后生产性能的不良影响、换羽期间蛋销售额的损失等等)的存在，提高产蛋禽的蛋生产性能很难获得经济效益。然而，以仅为上述讨论的规模一半的每个雌禽为基础，断定蛋鸡产蛋的增加就意味着几百万经济效益是不合理的。
本领域一般技术人员应将词组＂提高生产能力＂理解为使雌禽在下面的一个或多个方面得到增加促进产蛋的开始；促进最大蛋生产期的开始；延长产蛋期；增加产蛋强度；或者增加一生的总产蛋。此词组还包括改进饲料转化率；提高蛋壳质量；或者改进其对不利产蛋条件(如热胁迫、过分拥挤、营养不良和噪音)的抗性。此词组意味着使雄禽在下面一个或多个方面有所增加加速青春期的开始或者精子的产生；促进最大精子生产期的开始；延长精子的生产；增加精子的产生强度(精子数)；增加射精体积；提高精子的生存能力；增加睾丸激素的产生；或者增加性欲。
最近，已经研究了激素抑制素可以作为增加哺乳动物排卵的潜在手段。抑制素是主要由生殖腺产生的肽激素，具体地说是由正在生长的卵泡和睾丸产生。在哺乳动物中，它的功能是作为脑垂体的促卵泡激素(＂FSH＂)分泌的抑制性反馈调节物。尽管60多年以前，首先提出了抑制素的存在，但只是在最近才完成了其化学分离。
哺乳动物的抑制素是由α-亚基(分子量18,000)和β-亚基(分子量14,000)组成的二聚体蛋白质激素。α-亚基对抑制素来说是唯一的，而β-亚基二聚体形成活化素(一种自脑垂体腺中释放的FSH)。β-亚基以两种形式(βA和βB)存在，这两种形式不同但非常相似。因此，根据相关的β-亚基，抑制素有抑制素-A或者抑制素-B。当α-亚基和β亚基以二硫键连接时，其生物活性是抑制促卵泡激素(＂FSH＂)自脑垂体的分泌。抑制素α-亚基的氨基酸序列在猪、牛、人类、鼠和家养的鸡物种中显示出大约80-90％的相似性。有关抑制素的分离、产生、测定和生物学作用可以在Risbridger等的“现代抑制素生物学”，内分泌学学报(Copenh)，122673-682，(1990)；和Rivier，C.等的“抑制素激素家族的研究”综述，激素研究28104-118(1987)中获知，其全部内容本文一并参考。
在哺乳动物和禽类中，FSH对卵泡的生长和发育具有作用，而促黄体激素(＂LH＂)被认为能诱导排卵。几种脑和生殖腺因子(肽和类固醇激素)相互作用控制促性腺激素的释放。在这些因子中，促性腺素释放激素(＂GnRH＂)和抑制素对哺乳动物脑垂体FSH的分泌具有相反的控制作用。促性腺素释放激素是脑十肽，其作用是刺激FSH和LH的分泌；而抑制素是生殖腺蛋白，其明显的作用是选择性地抑制哺乳动物FSH的分泌。
理解抑制素在禽类排卵内分泌控制中的作用需要了解鸟类排卵过程的基础知识。在家养雌禽功能成熟的卵巢中，正在生长的卵泡以不同大小的组织存在。典型的卵巢包含4至6个大的，直径为2-4厘米，充满卵黄的卵泡(F1至F4，F6)；还有大量较小的，2-10毫米，黄色的卵泡以及众多的非常小的白卵泡。最大的预排卵的卵泡(F1)在第二天排卵，第二大的卵泡(F2)在再下一天(大约26小时后)排卵，等等。对这层组织中卵泡的募集和发育的控制理解得很少。已经证明了脑垂体促性腺激素的介入，然而抑制素在控制鸟类促性腺激素的分泌和控制排卵中的作用还不清楚。
诱导哺乳动物物种的过分排卵的最新策略已经发展成为与中和内原抑制素活性有关的方法。例如，已经研究了哺乳动物对各种包含抑制素的化合物的活性免疫。在小母牛、绵羊、小母猪和大鼠中抑制素的免疫中和与增加的排卵率有关。
接种抗原抑制素制剂后，在哺乳动物中所发现的排卵率的增加被认为是增加的血浆FSH水平(促进卵巢卵泡的发育)的结果。研究中使用各种抗原作为疫苗，证明了哺乳动物排卵率的增加。在哺乳动物中试验的一些抗原包括来源于抑制素α-亚基片段的重组DNA(Wrathall等，抑制素α-亚基的合成肽序列的活性免疫对母羊血浆促性腺激素的浓度、排卵率和生小羊的速率的影响，繁殖生育力杂志，95175-182，1992；和Meyer等，抑制素α-链肽的抗血清中和绵羊的抑制素的生物活性并增加排卵率，明尼苏达农业实验站科学杂志系列，论文编号17，103，1991)；与卵清蛋白结合的牛抑制素α-亚基的N端序列的合成肽复制品(Glencross等，小母牛针对抑制素的活性免疫对血浆FSH的浓度、卵巢卵泡的发育和排卵率的影响，内分泌学杂志，134，11-18，1992)；与人类血清白蛋白结合的牛抑制素α-亚基的合成肽序列(Morris等，牛抑制素α-亚基的合成肽序列的免疫对小母牛的排卵率和生育双胞胎率的影响，繁殖生育力杂志97255-261，1993)；自牛卵泡液体部分纯化的抑制素(Morris等，用自牛卵泡液体部分纯化的抑制素免疫青春期前的具有低和高排卵率基因型的小羊的作用，Theriogenology，Vol.35 No.2，1991)。
在所有研究的周期性哺乳动物中，尽管与在排卵周期中FSH水平如何波动的数据相矛盾，但是不管所使用的抗原或所攻击的哺乳动物的物种，内原抑制素的免疫中和持续促进了卵巢卵泡的发育和排卵率。
如上所述，在鸟类物种中抑制素与生殖功能调节的关系还不清楚。到目前为止，发表的论文集中在抑制素对家养家禽的生殖功能上。大量的文献支持这样的理论，即抑制素在家禽中表现出的生理作用与文献报道的在哺乳动物中表现出的生理作用相当在雌禽中，抑制素可能是卵泡募集和/或者发育的调节物。然而，在禽类中抑制素可能是或者不是通过抑制脑垂体FSH的分泌来与排卵率的控制相关的。例如，虽然发现低产蛋的雌禽较高产蛋雌禽，在血浆和预排卵卵泡的粒膜细胞层中含有更高水平的抑制素，但发现在血浆FSH水平与产蛋率的相关性方面没有差异。Wang等，家养雌禽卵巢中α-抑制素基因表达和血浆免疫反应性抑制素水平的增加与排卵率的降低相关，普通和比较内分泌学，91，52-58，(1993)。因此，此参考文献表明在雌禽中，抑制素α-亚基基因表达和血浆免疫反应性抑制素水平与排卵率相关的变化不能直接通过调节血浆FSH的水平来影响排卵率。此外，Johnson，P.A.(雌禽中的抑制素，家禽科学72955-958，(1993))认为使用牛抑制素RIA系统能成功地评价雌禽血浆的免疫反应性抑制素，然而，尽管LH对预排卵的推动，但在整个排卵周期中没有检测到明显的免疫反应性抑制素的峰。因此，抑制素在禽类卵泡产生中的作用仍不清楚。
最近，成功地克隆和测序了鸡抑制素的α-亚基。Wang和Johnson，鸡卵巢粒膜细胞抑制素的α-亚基的互补脱氧核糖核酸克隆和序列分析，生殖生物学，49，1-6，(1993)，其全部内容本文一并参考。鸟类抑制素序列与已知的哺乳动物抑制素α-亚基序列相比，显示出86-89％同源性。使用两个分离探针(cINA6和cINA12)的Northern亚基分析表明所说的抑制素α-亚基在鸡卵巢粒膜细胞中表达，而在鸡脑、肾、肝脏或者脾组织中不表达。
因此，禽类中的抑制素生物学还了解得很少，还没有试图或者检测禽类对抗原抑制素攻击的反应。这样，由于平胸类市场实质上是由许多驼鸟、食火鸟和rhea的不理想的生产能力所限制，所以需要一种提高这些禽类生产能力的组合物和方法。
此外，需要改进所有家禽的生产能力，以便增加所生产的用于消费的家禽的数量，提高这种生产的效率或者是饲料转化率。因此，仍然需要一种提高或改进所有家禽(其中包括鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鹅)生产能力的组合物和方法。
另外，也需要一种改进外来鸟(如鹦鹉目)生产能力的组合物和方法。鹦鹉目包括鹦鹉，其是鸟类中的单科目，具有并趾和有力的钩状鸟嘴。将鹦鹉定义为鸟家族鹦鹉科(Psittacidae)(是鹦鹉目唯一的科)的任何成员，其特征是短、结实有力的钩状嘴。
对提高生产能力的组合物与方法的需要不限于鸟类。在许多动物中也需要有效的组合物与方法来改进其生产能力。例如，在大多数农业饲养的动物(如猪、牛和羊)上一直需要改进其生产能力。也一直需要改进毛被动物(貂、狐狸、水獭、雪貂和浣熊)和用作宠物和实验研究对象的啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙土鼠和仓鼠)的生产能力，对兽皮用于装饰目的其它动物的生产能力提高的需求也在增加。
另外，需要改进生产能力的组合物和方法，以便增加许多动物(如外来的和濒危物种)的种群，避免它们的绝种。一直需要改进用于竞赛、娱乐或者表演(竞赛)的动物(如马、狗、猫、动物园动物和马戏团动物)的生产能力。如对治疗人类不育需要的增加所表明的那样，也需要改进人类的生产能力。因此，在许多动物中还需要改进生产能力的组合物和方法。
发明概述一般来说，本发明涉及通过向所说的动物施用包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的异源蛋白来改进这些动物生产能力的方法。本发明也涉及通过向所说的动物施用融合基因产物来改进这些动物生产能力的方法，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。向动物施用有效量的异源蛋白或者融合基因产物，以便在此动物中产生抗此异源蛋白的免疫应答。也应该理解本发明的方法促进产生抑制素的动物的生产能力。优选的是，所说的动物是禽。更优选的是，所说的禽是鸡。另一种优选的禽是平胸类(如食火鸟、鸵鸟、rhea或者食火鸡)。
本发明还涉及上述的异源蛋白和融合基因产物，以及产生它们的方法。更具体地说，本发明直接针对于产生异源蛋白的组合物和方法，所说的异源蛋白包含抑制素或其片段和载体蛋白。抑制素蛋白或其片段可以是鸟类抑制素、哺乳动物抑制素、鱼类抑制素或者爬虫类抑制素。载体蛋白包括但不限于麦芽糖结合蛋白、甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白或者牛血清白蛋白。优选的载体蛋白是麦芽糖结合蛋白。
异源蛋白可以是与所说的载体蛋白结合的抑制素，也可以是融合到所说的载体蛋白中的抑制素。产生这种融合异源蛋白的方法包括将编码抑制素或其片段表达的cDNA插入到含有产生载体蛋白的编码信息的载体中。在将所说的载体插入到表达系统后，所说的融合异源蛋白经此系统表达。优选的是，所说的异源蛋白包括平胸类抑制素(如驼鸟抑制素、食火鸟抑制素和rhea抑制素)。另一个优选的异源蛋白包括鸡抑制素。
本发明也直接针对于通过施用本发明的异源蛋白来改进动物的生产能力的方法，所说的异源蛋白包含抑制素蛋白或者其片段和载体蛋白。在一个实施方案中，所说的方法包括向雌性动物施用有效量的这种蛋白质。在另一个实施方案中，所说的方法包括向雄性动物施用有效量的这种蛋白质。理想的是，在这些动物中产生直接抗这些异源蛋白的免疫反应。更理想的是，在此动物中产生的免疫反应也是直接抗此动物产生的抑制素蛋白(内原抑制素)的。
本发明也直接针对于一种融合基因产物，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码所说的载体蛋白表达的基因。此编码抑制素蛋白或其片段表达的基因可以编码表达鸟类抑制素、哺乳动物抑制素、鱼类抑制素或者爬虫类抑制素。编码所说的载体蛋白表达的基因可以编码表达其中的麦芽糖结合蛋白或者牛血清白蛋白。优选的编码载体蛋白表达的基因编码麦芽糖结合蛋白的表达。
本发明也涉及通过向所说的动物施用融合基因产物来改进这些动物生产能力的方法，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。更具体地说，本发明还与基因治疗方法有关，即将编码抑制素或其片段和载体蛋白的DNA序列导入到动物中。本发明的融合基因产物可以直接施用给所说的动物，或者可以经载体或含有载体的细胞(因此此细胞含有所说的融合基因产物)施用给所说的动物。
本发明的方法提高产生抑制素的雌性动物(如哺乳动物、爬虫、鱼和鸟)的生产能力。更具体地说，这种方法提高雌性鹑鸡目和平胸类的生产能力。更具体地说，这种方法提高鸡、火鸡、驼鸟、食火鸟和rhea的生产能力。这种方法也提高海龟(包括濒危的海龟物种)的生产能力。出乎意料的是，本发明的方法促进了动物青春期或产蛋的开始。另外，本发明的方法意外地促进了动物最大产蛋期的开始。此外，本发明的方法增加了动物产蛋的强度。还有令人惊奇的是，本发明的方法延长了动物的最大产蛋期。另外，本发明的方法意外地增加了动物一生的总产蛋。在鸟类中，本发明的方法也改进鸟的饲料转化率。另外，本发明的方法意外地减少或消除了不利的产蛋条件对暴露在这种不利的条件下的动物产蛋率的影响。这种不利的条件包括提高的温度、拥挤、营养缺乏和噪音。
令人惊奇的是，本发明的方法也提高了产生抑制素的雄性动物(如哺乳动物、爬虫和鸟)的生产能力。更具体地说，本发明的方法增加了雄性动物的睾丸激素的水平。类似的是，本发明的方法增加了雄性动物青春期或者精子产生的开始。另外，本发明的方法促进了雄性动物最大精子产生期的开始。此外，本发明的方法意外地增加了雄性动物精子产生的强度(精子数)。还有，本发明的方法延长了动物的最大精子产生期。另外，本发明的方法提高了动物精子的生存力。另外，本发明的方法意外地减少或消除了不利的条件对暴露在这种不利的条件下的动物精子产生的影响。这种不利的条件包括升高的温度、过分拥挤、营养缺乏和噪音。另外令人惊奇的是，本发明的方法增加了性欲，因此增加了雄性鸟类的生殖潜力。
如上所述，使用本发明的方法能提高任何产生抑制素的动物(包括但不限于农业上饲养的大多数动物，如猪、母牛、绵羊、火鸡、鹌鹑、鸭、鹅、鸡和鱼)；毛被动物(貂、狐狸、水獭、雪貂、兔和浣熊)；实验动物(如大鼠、小鼠、沙土鼠和豚鼠)；兽皮可用于装饰的动物(如产于美洲的鳄鱼和蛇)；外来的或濒于绝种的物种；用于竞赛、娱乐或表演(竞赛)的动物(如马、狗、猫、动物园动物和马戏团动物)；和人类的生产能力。另外，本发明的方法能够提高其生产能力的鸟类还包括平胸类、鹦鹉目、piciformes，strigiformes，passeriformes，coraciformes，ralliformes，cuculiformes，columbiformes，galliformes，anseriformes和herodiones。更具体地说，本发明的方法可以用于提高驼鸟、食火鸟、rhea、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、无翼鹧鸪鸟(partridge kiwi)、食火鸡、鹦鹉(parrot)、鹦鹉(parakeet)、makaw、猎鹰、鹰(eagle)、鹰(hawk)、鸽子、美冠鹦鹉、鸣禽、jay鸟、山鸟类、雀类、啭鸟、金丝雀、巨嘴鸟、八哥或者麻雀的生产能力。
因此，本发明的目的是提供抑制素组合物，这种组合物能在对动物给药之后诱导动物的免疫应答。
本发明的另一个目的是提供包含抑制素蛋白或者其片段和载体蛋白的异源蛋白。
本发明的另一个目的是提供包含融合异源蛋白的组合物，所说的异源蛋白包含抑制素或者其片段。
本发明的另一个目的是提供产生融合异源蛋白(包含抑制素蛋白或者其片段和载体蛋白)的方法。
本发明的另一个目的是提供融合基因产物，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。
本发明的另一个目的是通过将所说的融合基因产物注射到动物中而产生抗本发明异源蛋白的免疫反应。
本发明的另一个目的是提供在调节抑制素水平的基因治疗中有用的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供提高动物生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高鸟类生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高平胸类生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高鸡生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高爬虫生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高哺乳动物生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高鱼类生产能力的方法。
本发明的另一个目的是提供提高人类生产能力的方法。
在阅读下列公开的实施方案和附加的权利要求的详细描述后，本发明的这些和其它目的、特征和优点将是显而易见的。
附图的简短描述

图1是SDS-PAGE凝胶，其中的A是驼鸟抗(鸡抑制素-麦芽糖结合蛋白)抗体，B是质粒pMALTM-c载体标准品，C是蛋白质分子量标准品，D是用于所说的融合异源蛋白制剂中的pMALTM-c载体，E是本发明的纯化的融合鸡抑制素-麦芽糖结合蛋白(异源蛋白)，F是未装有所说的异源蛋白的纯化过程的洗脱液。
图2具体说明了使用与cINA521编码的蛋白质融合的麦芽糖结合蛋白后，抑制素α-亚基免疫中和作用对雌禽日产蛋量(＂HDEP＂)的影响。更具体地说，图2是实施例8的数据的图表说明。
详细描述一般来说，本发明涉及通过向所说的动物施用包含抑制素蛋白或其片段载体蛋白的异源蛋白来改进这些动物生产能力的方法。本发明也涉及通过向所说的动物施用融合基因产物来改进这些动物生产能力的方法，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。
向动物施用有效量的异源蛋白或者融合基因产物，以便在此动物中产生抗此异源蛋白的免疫应答。也应该理解本发明的方法促进产生抑制素的动物的生产能力。优选的是，所说的动物是禽。更优选的是，所说的禽是鸡。另一种优选的禽是火鸡。另外优选的禽是平胸类(如食火鸟、鸵鸟、rhea或者食火鸡)。本发明还涉及上述的异源蛋白和融合基因产物，以及产生它们的方法。
在下列定义之后，将详尽地描述本发明的组合物，之后是本发明方法的详细描述。定义本文所用的术语＂禽＂或者＂家禽＂定义为鸟(Aves)纲动物的成员，其特征是温血、主要适于飞行的产蛋脊椎动物。本文所用的术语＂平胸类＂定义为一族不能飞行、大部分较大的行走禽类，包括下列几个目食火鸟、鸵鸟、无翼鸟和食火鸡。本文所用的术语＂鹦鹉目＂包括鹦鹉，并且是鸟类中的单科目，为并趾和有力的钩状鸟嘴。＂鹦鹉＂定义为鸟家族鹦鹉科(是鹦鹉目唯一的科)的任何成员，其特征是短、结实有力的钩状嘴。本文所用的＂鸡＂指用于产蛋的鸡(如单冠白来亨鸡)和用于消费而饲养的鸡或者适合烤焙的鸡。
本文将术语＂蛋＂定义为由禽类和爬虫产生的包裹在多孔含钙的或皮质的壳中的大雌性细胞。本文所用的＂鸟或者爬虫的蛋产生＂是产蛋鸟的行为，或者称为＂产卵＂。术语＂卵＂定义为雌配子，也称为蛋。因此，除鸟和爬虫外，本文所有的所用动物的蛋产生定义为卵巢产生和排出卵，或称为＂排卵＂。这样，应该理解本文所用的术语＂蛋＂在其由鸟或者爬虫产生时，应定义为包裹在多孔含钙或皮质壳中的大雌性细胞；而在其由所有其它动物产生时，定义为卵。
对于鸟类，文本可互换使用术语＂产蛋的开始＂、＂首次产蛋＂和＂青春期＂，其是指鸟产下第一个蛋。因此，本文所用的鸟类产蛋或青春期的＂加速开始＂指的是与通常鸟类的首次产蛋日期相比，诱导出更早的首次产蛋日期。类似的是，对于雄鸟可互换使用＂青春期＂和＂精子产生的开始＂。
可互换使用词组＂提高生产能力＂、＂改进生产能力＂和＂增加生产能力＂，其是指在下列一个或几个方面的改进加速青春期的开始(雌性的产蛋或者排卵，雄性的精子产生)；加速雌性的最大产蛋或排卵期的开始，或者加速雄性最大精子产生期的开始；增加雌性的产蛋强度或者雄性的精子产生强度；延长雌性的产蛋期或者雄性的精子产生期；增加雌性一生的总产蛋或排卵；提高饲料转化率；提高蛋壳质量；提高对不利条件(如升高的温度、过分拥挤、营养不良和噪音)的抗性；提高雄性精子的存活力；增加雄性睾丸激素的产生；增加精液体积；增加雄性性欲。
词组＂产蛋强度＂的意思对本领域的一般技术人员是已知的，其是指产蛋的频率。
鸟类＂一生的总产蛋＂定义为在鸟的整个一生中其产蛋的总数。本文所用的词组＂雌禽日产蛋＂或者＂HDEP＂定义为特定的一组雌禽每天产蛋的数目。
本文所用的词组＂促进最大产蛋期的开始＂或者＂促进最大蛋生产期的开始＂指从出生到动物以高峰产蛋率或排卵率的50％产蛋或排卵的时间比正常的从出生到最大产蛋期的时间短。
本文所用的蛋的＂胆固醇水平降低＂的方法指与同种的鸟孵出的蛋的平均胆固醇含量相比，诱导这种鸟孵出一个或多个具有较低的胆固醇含量的蛋的方法。
与术语禽或者家禽相比，本文所用的术语＂哺乳动物＂定义为哺乳动物纲的成员，这是很大的温血脊椎动物纲，此纲动物的特征在于乳腺、身体被毛、中耳的三个骨膜(oscicles)、将胸腔和腹腔分开的肌膈、没有细胞核的红血细胞、位于尿囊和羊膜中的胚胎发育。
本文所用的术语＂爬虫＂定义为爬行纲Reptilia的任何一员，此纲是陆生的脊椎动物纲，其特征是没有毛、羽毛和乳腺，他们的皮肤上覆盖着鳞片，有三室心脏，它们的胸膜腔和腹膜腔是相通的。
本文所用的异源蛋白定义为包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的蛋白质。应该理解在异源蛋白组合物、产生异源蛋白的方法和使用本发明的异源蛋白的方法中可以互换使用术语＂抑制素＂和＂抑制素片段＂。
也应该理解本文所用的“cINA521”指521个碱基对序列(SEQ ID NO1)。cINA521编码鸵鸟的α-抑制素亚基部分，如SEQ ID NO2所示。本文所用的＂MBP-cINA521＂是在将cINA521克隆到重组宿主细胞并表达了包含麦芽糖结合蛋白(＂MBP ＂)和cINA521编码的抑制素蛋白α-亚基片段的融合异源蛋白后，由重组宿主细胞表达的异源蛋白。优选的是，使用可以买到的载体pMALTM-c在克隆的cINA521表达后，在宿主大肠杆菌细胞中产生MBP-cINA521。因此，＂cINA521＂指核苷酸序列，而＂MBP-cINA521＂指融合的异源蛋白。
本文所用的融合异源蛋白指融合在一起的两种不同的蛋白质。例如，包含与载体蛋白融合的抑制素蛋白或者其片段的蛋白质。所说的融合异源蛋白由包含融合基因产物的表达系统表达，这种表达系统包含与编码载体蛋白表达的基因融合的编码抑制素蛋白或其片段表达的基因。本文所用的＂融合的基因产物＂定义为编码抑制素蛋白或其片段表达的基因与编码载体蛋白表达的基因融合的产物。
本文所用的结合的异源蛋白定义为包含与载体蛋白结合的抑制素蛋白或其片段的蛋白质。结合的异源蛋白经化学反应产生，此化学反应通过共价键将所说的抑制素蛋白与载体蛋白连接起来。
本文所用的动物对施用给其的物质的免疫反应定义为动物的细胞介导的和/或体液反应，此反应特异地抗所说的物质。
本文所用的术语＂选择性相互作用＂定义为两个物质通过共价键、非共价键、氢键、静电、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用或者通过其它的结合或吸附手段相互结合。这种结合的选择性在于两个物质以特定的方式、特定的位置或专一性地彼此相互作用。抑制素组合物一般来说，本发明涉及在提高动物(包括鸟类)生产能力的方法中使用的组合物。所说的组合物由包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的异源蛋白组成。所说的抑制素可以是产生抑制素的任何动物物种的抑制素。这些抑制素包括但不限于鸟抑制素、哺乳动物抑制素、爬虫抑制素、两栖动物抑制素或者鱼抑制素。更具体地说，哺乳动物抑制素包括但不限于牛抑制素、人类抑制素、马抑制素、猫抑制素、狗抑制素、兔抑制素、绵羊抑制素、貂抑制素、狐狸抑制素、水獭抑制素、雪貂抑制素、浣熊抑制素、驴抑制素、大鼠抑制素、小鼠抑制素、仓鼠抑制素和猪抑制素。鸟抑制素包括但不限于驼鸟抑制素、食火鸟抑制素、rhea抑制素、食火鸡抑制素、无翼鸟抑制素、火鸡抑制素、鹌鹑抑制素、鸡抑制素、鸭抑制素、鹅抑制素和鹦鹉目成员的抑制素。
优选的抑制素是鸟(avian)或者鸟(bird)的抑制素。更优选的抑制素是平胸类抑制素，如驼鸟、食火鸟或者rhea抑制素。特别优选的抑制素是驼鸟抑制素。另一个优选的抑制素是鸡抑制素。最优选的是本发明的异源蛋白包括α-亚基抑制素蛋白或其片段和载体蛋白。
所说的抑制素或其片段可以从动物体液中分离，由表达系统中的基因工程细胞表达，或者经一系列化学反应合成产生。更具体地说，抑制素的片段包括但不限于下列组分α-亚基抑制素；β-亚基抑制素；衍生于α-亚基抑制素或者β-亚基抑制素片段的重组DNA；α-亚基抑制素或者β-亚基抑制素片段的合成肽复制品；α-亚基抑制素或者β-亚基抑制素的N-末端序列的合成肽复制品；从卵泡液体中部分纯化的抑制素的片段；内源α-亚基抑制素或者β-亚基抑制素的片段；外源α-亚基抑制素或者β-亚基抑制素的片段。如上所述，最优选的抑制素片段是α-亚基抑制素或其片段。就抑制素来说，本领域的一般技术人员应该理解其包含带有氨基酸取代的抑制素，这种抑制素可以在受体上提供更多的免疫原性或者更多的活性。
异源蛋白中的抑制素与下面所述的载体蛋白或者融合或者结合。当所说的抑制素与载体蛋白质融合，这种异源蛋白就是＂融合异源蛋白＂。当所说的抑制素与载体蛋白质结合，这种异源蛋白就是＂结合异源蛋白＂。优选的异源蛋白是融合异源蛋白。
异源蛋白中的载体蛋白的同一性不是本发明的关键方面。在所说的异源蛋白中可以使用本领域任何已知的载体蛋白。用于本发明的载体蛋白包括，但不限于麦芽糖结合蛋白质＂MBP＂；牛血清白蛋白＂BSA＂；匙孔血蓝蛋白＂KLH＂；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；有性生殖细胞；含有Ia抗原的有性生殖细胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。优选的载体蛋白是MBP。如果异源蛋白不施用给牛或马，另一个优选的载体蛋白是BSA。如果异源蛋白不施用给鸟，另一个优选的载体蛋白是卵清蛋白。最优选的载体蛋白是MBP。优选的是所说的载体蛋白对将施用的动物是免疫原性的。
本发明也涉及产生本发明的结合异源蛋白的方法。产生结合蛋白的方法在本领域是公知的。在抗体-实验手册(Harlow和David Lane编辑，冷泉港实验室(1988))中充分地描述了蛋白与蛋白的结合方法，其内容本文一并参考。在神经内分泌的肽方法学(P.Michael Conn编辑，学院出版社，纽约，1989，其内容本文一并参考)的第38章(605-618页)和第42章(665-678)，第4节“抗体的制备”中详细描述了另外的产生结合异源蛋白的方法(包括结合试剂，如双醛、碳化二亚胺、双重氮联苯胺和其它；载体蛋白和免疫过程)。
尽管在本发明的方法中可以使用结合蛋白，但融合蛋白是优选的。更具体地说，融合的异源蛋白产生同源产物，其中所说的此蛋白的不同部分总是融合在相同的位置，并且融合的蛋白片段的数量相同。另外，可以一致地，便宜地，大量地产生融合异源蛋白。相反，结合异源蛋白不象融合蛋白那样一致。例如，根据所结合的蛋白，结合反应可以产生具有一种或几种结合的蛋白、在不同的位置发生结合的蛋白或者仍没有结合的蛋白的混合物。此外，一些结合可以在空间上阻碍所说的异源蛋白的将使用的用途(例如，在空间上阻碍了此蛋白的免疫原部分)。另外，结合反应条件和试剂可以降解所产生的蛋白。例如，戊二醛通常用于结合反应中，其能改变蛋白的构象。并且，与融合蛋白相比，大量产生结合蛋白更昂贵。
本发明也针对于融合基因产物，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。此编码抑制素蛋白或其片段表达的基因可以编码表达鸟类抑制素、哺乳动物抑制素、鱼类抑制素或者爬虫类抑制素。编码所说的载体蛋白表达的基因可以编码表达其中的麦芽糖结合蛋白或者牛血清白蛋白。优选的编码载体蛋白表达的基因编码麦芽糖结合蛋白的表达。下文将更充分地描述所说的融合基因产物和产生这种融合基因产物的方法。
简言之，产生本发明融合异源蛋白的方法包括下列步骤将融合基因产物插入到质粒编码区，用所说的质粒转化宿主细胞，通过本领域公知的方法由所说的宿主细胞表达融合异源蛋白。更具体地说，产生所说的融合异源蛋白的方法包括将编码抑制素或其片段表达的cDNA插入到含有产生载体蛋白的编码信息的载体中。在将所说的载体插入到表达系统后，经此系统表达所说的融合异源蛋白。
许多产生融合异源蛋白的方法在本领域是公知的。因此，可以使用本领域任何已知的方法产生本发明的融合异源蛋白。可以使用许多商业上可以买到的载体试剂盒和表达系统制备本发明的融合异源蛋白。这种商业上可以买到的载体试剂盒和表达系统的例子是新英格兰生物实验室(Beverly马萨诸塞)的pMALTM-c。在pMALTM-c系统中能够发生所说的融合异源蛋白的细胞质表达。下文实施例1和2充分描述了经pMALTM-c试剂盒产生本发明的融合异源蛋白的方法。可以用来产生本发明的融合异源蛋白的载体试剂盒和表达系统的其它来源包括但不限于Piscataway的Pharmacia生物技术公司(新泽西)；Palo Alto的Clonetech公司(加利福尼亚)。
本发明还涉及融合基因产物，所说的融合基因产物包含编码抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。所说的抑制素基因可以来自于任何产生抑制素的动物物种。这种抑制素基因可以是鸟抑制素基因、哺乳动物抑制素基因、爬虫抑制素基因、两栖动物抑制素基因、或者鱼类基因。更具体地说，哺乳动物抑制素基因包括但不限于牛抑制素基因、人类抑制素基因、马抑制素基因、猫抑制素基因、狗抑制素基因、绵羊抑制素基因、貂抑制素基因、狐狸抑制素基因、水獭抑制素基因、雪貂抑制素基因、浣熊抑制素基因、大鼠抑制素基因、小鼠抑制素基因、仓鼠抑制素基因、驴抑制素基因和猪抑制素基因。鸟抑制素基因包括，但不限于驼鸟抑制素基因、食火鸟抑制素基因、rhea基因、食火鸡抑制素基因、无翼鸟抑制素基因、火鸡抑制素基因、鹌鹑抑制素基因、鸡抑制素基因、来自鹦鹉目任何成员的抑制素基因、来自猎鹰目任何成员的抑制素基因、来自piciformes任何成员的抑制素基因、来自strigiformes任何成员的抑制素基因、来自coraciformes任何成员的抑制素基因、来自ralliformes任何成员的抑制素基因、来自passeriformes任何成员的抑制素基因、来自cuculiformes任何成员的抑制素基因、来自columbiformes任何成员的抑制素基因、来自galliformes(家养家禽)任何成员的抑制素基因、来自anseriformes(鹅、鸭和其它水生家禽)任何成员的抑制素基因、来自herodiones任何成员的抑制素基因、来自任何一种下列鸟的抑制素基因猎鹰、鹰(eagle)、鹰(hawk)、鸽子、鹦鹉(parakeet)、美冠鹦鹉、makaw、鹦鹉(parrot)、金丝雀、八哥、巨嘴鸟、和栖息鸟(如鸣禽、 鸟、山鸟类、雀类、啭鸟和麻雀)。
优选的抑制素基因是鸟抑制素基因。更加优选的抑制素基因是平胸类抑制素基因。特别优选的抑制素基因是驼鸟抑制素基因。另一个优选的抑制素基因是食火鸟抑制素基因。另外一个优选的抑制素基因是rhea抑制素基因。还有一个优选的抑制素基因是鸡抑制素基因。
插入到Bluescript(Stratagene，La Jolla，cA)的EcoR 1位点的鸡抑制素α-亚基eDNA克隆(cINA6；Wang和Johnson，鸡卵巢粒膜细胞抑制素的α-亚基的互补脱氧核糖核酸克隆和序列分析，生殖生物学，49453-458，1993，其全部内容本文一并参考)是P.A.Johnson(Cornell大学)赠送的。在Southern测定中cINA6克隆特异性地与鸵鸟基因组DNA杂交，表明这两个物种之间有明显的DNA同源性(chouljenko等，作为带有大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白的融合蛋白的鸡α-抑制素的表达和纯化，家禽科学，73(suppl.1)84，1994))。使用PstI消化从cINA6克隆中切除DNA片段(“cINA521”)。cINA521DNA片段包含成熟鸡抑制素α-亚基的大部分。尽管从Wang和Johnson报告的cINA6克隆中切除了cINA521，但所得的序列(SEQ ID NO1)仍不同于Wang和Johnson出版的DNA序列。
通过本领域公知的聚合酶链反应(PCR)方法获得了驼鸟抑制素α-亚基序列。更具体地说，以Wang所报道的序列为基础构建了下列引物，并用于带有驼鸟基因组DNA的PCR反应中5′-CTCAGCCTGCTGCAGCGCCC-3′；和5′-GTGTCGACCGCGCGACGCCGAC-3′。更具体地说，上述的引物分别相对于鸡抑制素α-亚基cDNA克隆，即Wang和Johnson报道的cINA6的778至798和1348至1326碥基对。用Pst1限制性核酸内切酶消化所得的PCR产物，并将其亚克隆到商业上能够买到的载体PUC19(新英格兰生物实验室)中。驼鸟Pst1片段抑制素基因的序列与鸡α-抑制素相应的部分相同。
如上所述，应该理解载体蛋白不是本发明的关键方面。因此，编码任何载体蛋白表达的基因都可以用于本发明中。所说的载体蛋白基因包括但不限于编码表达下列蛋白的基因麦芽糖结合蛋白质＂MBP＂；牛血清白蛋白＂BSA＂；匙孔血蓝蛋白＂KLH＂；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；有性生殖细胞；含有Ia抗原的有性生殖细胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。优选的载体蛋白基因是编码表达MBP的基因。如果所得的异源蛋白不施用给牛或马，另一个优选的载体蛋白基因是BSA基因。如果所得的异源蛋白不施用给鸟，另一个优选的载体蛋白基因是卵清蛋白基因。最优选的载体蛋白基因是编码表达MBP的基因或其衍生物。优选的载体蛋白基因编码的蛋白将增加所说的宿主对这种抑制素蛋白免疫反应的强度和时间。
本发明还涉及产生融合基因产物的方法，这种方法包括将编码抑制素蛋白或其片段表达的基因与编码载体蛋白表达的基因融合。简言之，产生本发明融合基因的方法包括下列步骤分离所需要的抑制素互补DNA(cDNA)，产生双链抑制素DNA，获得双链载体蛋白DNA，以这样一种方式将双链抑制素DNA与双链载体蛋白DNA融合，即融合的DNA能够表达包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的融合异源蛋白。
许多分离基因和产生融合基因产物的方法在本领域是已知的。例如参见Sambrook，Fritsch和Maniatis的分子克隆，实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989，I，II，III卷。因此，可以使用本领域任何已知的方法产生本发明的融合基因产物。可以使用许多商业上可以买到的载体试剂盒制备本发明的融合基因产物。这种商业上可以买到的载体试剂盒的例子是新英格兰生物实验室(Beverly马萨诸塞)的pMALTM-c。下文实施例1充分描述了由pMALTM-c试剂盒产生本发明的融合基因产物的方法。可以用来产生本发明的融合基因产物的载体试剂盒的其它来源包括但不限于Piscataway的Pharmacia生物技术公司(新泽西)；Palo Alto的Clonetech公司(加利福尼亚)。
如上所述，插入到Bluescript的EcoR 1位点的鸡抑制素α-亚基cDNA克隆(cINA6)是P.A.Johnson(Cornell大学)赠送的。使用PstI消化从cINA6克隆中切除DNA片段(＂cINA521＂)。将此片段(cINA521)符合读框地克隆到带有麦芽糖结合蛋白(＂MBP＂)的质粒p-MALTM-c中，在IPTG(异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导和SDS-PAGE后，检测到了合适大小的融合蛋白(图1的E道)。将所得的蛋白缀合物(＂MBP-cINA521＂)用作抗原以免疫抗循环抑制素水平的青春期前的雌性日本鹌鹑(Coturnix caturnix japonica)，这一点在实施例8中充分描述了。提高生产能力的方法意外地发现本发明的组合物能提高动物的生产能力，特别是禽类生产能力。因此，本发明也直接针对于通过施用本发明的异源蛋白提高动物的生产能力的方法。在一个实施方案中，此方法包括向雌性动物施用有效量的这种蛋白质，以便提高这种动物的生产能力。在另一个实施方案中，此方法包括向雄性动物施用有效量的这种蛋白质，以便提高这种动物的生产能力。优选地，在所说的动物中发生直接抗这种蛋白的免疫反应。更优选地，在此动物中发生的免疫反应也直接抗此动物产生的抑制素蛋白(内源抑制素)。
更具体地说，本发明的方法包括向动物施用有效量的本发明异源蛋白(包含抑制素或其片段和载体蛋白)，以便此动物的生产能力得到提高。优选地，所说的动物是鸟。应该理解＂处理的＂鸟是指已经施用了本发明的异源蛋白的鸟。
可以使用本发明的方法来提高任何产生抑制素的雌性鸟物种的生产能力。雌性鸟包括，但不限于平胸类、鹦鹉目、猎鹰目、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、ralliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes(家养家禽)、anseriformes(鹅、鸭和其它水家禽)和herodiones。更具体地说，雌性鸟包括但不限于驼鸟、食火鸟、rhea、无翼鸟、食火鸡、火鸡、鹌鹑、鸡、猎鹰、鹰(eagle)、鹰(hawk)、鸽子、鹦鹉(parakeet)、美冠鹦鹉、makaw、鹦鹉(parrot)、栖息鸟(如鸣禽、
鸟、山鸟类、雀类、啭鸟和麻雀)和鹦鹉目的任何成员。优选的鸟是平胸类。更优选的鸟是驼鸟。另一个优选的平胸类是食火鸟。还有一个优选的平胸类是rhea。另一个优选的鸟是鹦鹉目的任何成员。另一个优选的鸟是鸡。另外，另一个优选的鸟是鹌鹑。可以使用本发明的方法来加速濒危鸟类物种产蛋的开始。这些濒危物种包括但不限于鹰(eagle)、鹰(hawk)、秃鹰和猫头鹰。
本发明的异源蛋白组合物中抑制素和载体蛋白可以随此组合物所施用的鸟类物种的变化而变化。当此组合物施用给鸟类时，使用鸟类抑制素和麦芽糖结合蛋白是优选的。当此组合物施用给平胸类时，优选的抑制素是家养鸡或平胸类抑制素。更优选的是，当此组合物施用给鸵鸟或平胸类时，优选的抑制素是家养鸡或鸵鸟抑制素。当此组合物施用给鸡时，另一种优选的抑制素是家养鸡或鸵鸟抑制素。应该理解，异源蛋白的抑制素不必是来源于其将要施用的同一物种。例如，施用给驼鸟的异源蛋白可以由鸡抑制素和载体蛋白组成。
也应该理解所说的组合物还包括佐剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂和其它已知并用于现有技术疫苗中的组分。本领域任何已知的佐剂系统可用于本发明的组合物。这些佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、多相分散的β-1，4连接的乙酰化甘露聚糖(＂Acemannan＂)、Titermax(CytRx公司的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物佐剂)、Chiron公司的改良的脂类佐剂、剑桥生物技术公司的皂甙衍生物佐剂(用于消灭百日咳杆菌)、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、大聚合阴离子(如葡聚糖硫酸酯)、无机凝胶(如明矾、氢氧化铝、磷酸铝)。优选的佐剂系统是弗氏不完全佐剂。另一个优选的佐剂系统是弗氏完全佐剂。
可以通过本领域任何已知的方法将本发明的异源蛋白组合物施用给鸟类。例如，可以通过皮下、腹膜内、皮内或者肌肉内施用所说的组合物。优选地，组合物通过皮下注射。可以以一种或多种剂量向鸟施用此组合物。优选地，向鸟类以多种剂量施用此组合物，这样在初次免疫后可进行加强免疫。
可以在动物由于疾病或年龄停止排卵或者产生精子之前的任何时间向其施用所说的组合物。向动物施用本发明的组合物的理想年龄依据相关动物的物种、动物交配季节(如果有)和施用此组合物的目的而定。
例如，如果施用此组合物是为了加速产蛋或者精子产生，应该在鸟产蛋或者青春期之前向其施用本发明的组合物。如上所述，向动物首次施用本发明的组合物的理想年龄依据相关动物的物种、动物交配季节(如果有)、鸟的大小和此组合物中各组分(抑制素和载体蛋白)的同一性而定。
另一个例子，当施用此组合物是为了提高正处于繁殖时期的农业动物的生产能力时，施用此组合物的理想时间是在繁殖时期开始之前。相反，向产蛋率和精子产生率受到抑制的成熟动物施用此组合物时，应该在这种抑制作用确定之前就施用此组合物。
关于处于繁殖时期的动物，尽管可以向鸟类(如任何年龄的平胸类)施用本发明的异源蛋白，但在此鸟的首次繁殖时期之前的6个月内免疫该鸟是理想的。本领域的普通技术人员应该理解一般雌性鸟在首次繁殖时期开始产蛋。在所说的鸟首次繁殖时期前大约6个月对其进行免疫，然后在其首次繁殖时期前以一个月为间隔进行加强免疫是更优选的。在所说的鸟首次繁殖时期前大约6个月对其进行免疫，然后在这6个月期间以一个月为间隔进行加强免疫是优选的。
例如，增加雌性驼鸟蛋的产生的最好结果是在其首次繁殖时期前大约6个月对其进行首次免疫，然后在这6个月期间每隔一个月进行加强免疫。首次免疫的量为大约0.5-4.5mg本发明的异源蛋白。加强免疫的量为大约0.30-3.0mg本发明的异源蛋白。优选的是，首次免疫的量为大约1.5-3.0mg本发明的异源蛋白，加强免疫的量为大约0.75-1.5mg本发明的异源蛋白。在首次免疫中将异源蛋白在弗氏完全佐剂(Sigma化学公司St.Louis MO)中乳化，在加强免疫中将所说的异源蛋白在弗氏不完全佐剂(Sigma)中乳化也是优选的。更优选的是，皮下注射所说的异源蛋白组合物。最优选的是，在驼鸟上面大腿区的三个位置上皮下注射所说的异源蛋白组合物。
向鸟施用的本发明异源蛋白的量依据鸟的物种、鸟的年龄和体重而变化，施用此蛋白的时间与繁殖时期(如果此鸟有繁殖时期)、施用此蛋白的次数有关。另外，施用计划(或处理计划)的开始依据鸟的物种、鸟物种平均青春期年龄、该鸟的家族史(与青春期年龄的家族史有关)、该鸟在一年中何时孵化、该鸟的营养状况(高营养的鸟的青春期较营养不足的鸟来得早)、在给药开始时鸟的整体健康状况、鸟的免疫能力、鸟的长期健康史、极端天气条件的存在(延长的过分严酷的天气，如雨、高温或此鸟不适应的风)、居住条件(过分拥挤)和活动的缺乏而变化。
由于本发明的说明，本领域的普通技术人员能够通过常规的实验确定多少异源蛋白对引起此鸟对此蛋白的免疫反应是必需的。
提高生产能力的方法的另一个例子如下。向哺乳动物施用免疫有效量的结合异源蛋白组合物，以便此动物产生直接抗所说的异源蛋白的免疫反应。所说的异源蛋白优选包括与麦芽糖结合蛋白结合的哺乳动物抑制素。另一个优选的结合异源蛋白包含鸟类或者爬虫抑制素和麦芽糖结合蛋白。
例如，下面是对在实施例8中详细讨论的本发明的提高日本鹌鹑生产能力的方法的简要概述。未进行处理的鹌鹑的平均青春期年龄为大约六至八周。下面是体重大约为0.1至0.25磅的日本鹌鹑的处理计划在其第25天日龄时首次(第一次)注射0.75mg本发明的异源蛋白；在第32，39，46，53，60和90天日龄时进行0.375mg的加强免疫，之后每隔35天进行一次加强免疫，共进行3次(即在95，130和165日龄时)。
更具体地说，在25日龄时，将50只雌性鹌鹑如下随机均等地分成两个注射组(每组25只)(1)MBP-cINA521的弗氏佐剂溶液(＂MBP-cINA521/FRN＂)，或者(2)弗氏佐剂(佐剂对照；＂FRN＂)。对抗抑制素免疫的鸟(1组)每只注射大约0.75mg MBP-cINA521(溶解在合适的对照载体中)。对第2组进行相同载体体积(0.2ml)的注射。所有的注射都是使用配有25号针头的结核菌素注射器在皮下进行的。如上所述，对每只鸟皮下进行大约0.375mg MBP-cINA521的加强抑制素免疫或者注射合适的对照，并观察总共20周。
从41日龄(认为是产蛋周期的第一天)开始，连续20周记录雌鸟的日产蛋量(＂HDEP＂)和死亡率(＂MORT＂)。此外，对每一个处理组计算第一次产蛋的平均年龄(＂FIRST＂)和此鸟产蛋达到50％的年龄(＂FIFTY＂)。实施例8详细讨论了这些，并对HDEP，MORT，FIRST和FIFTY数据进行了方差分析。
抑制素的免疫中和明显地加速了雌鹌鹑的青春期。如表2所示，抑制素处理的雌鸟第一次产蛋的平均年龄降低(P＜.0088)接近6天。同样，如表3所示，抑制素处理的雌鸟50％(FIFTY)产蛋年龄显著降低(12天；P＜.01)。
如图2所示，抑制素处理对产蛋强度的正面影响也存在，在活动周期的开始和结束最明显。例如，和FRN对照比较，观察到MBP-cINA521/FRN处理的雌鸟在第1周(16.5vs 2.6％)，第2周(50.0vs 28.6％)，第4周(96.6vs79.7％)HDEP率平均值明显地增加，在第15周(98.8vs 86.9％)，第16周(96.9vs 86.3％)，第18周(85.7vs 66.1％)，第20周(96.8％vs 73.8％)又观察到明显的增加(P＜.05)。在整个产蛋的20周，抑制素处理的雌鸟的总HDEP率为83.5％，对照为75.4％(P＜.14)。
除加速青春期、延长产蛋期和提高总产蛋强度外，抑制素处理降低达到高峰产蛋所需的时间约3周。参考图2，比较MBP-cINA521/FRN(其在第4周时HDEP为96.6％)和FRN(其第7周时HDEP为96.6％)。尽管未在统计学上评价HDEP峰值的差异，但雌鸟达到50％HDEP水平(FIFTY)时平均年龄的差异反应了不同的峰值。
因为只有8只鸟死亡(3个对照，5个处理)，所以死亡率不是此研究中的因素。16％的死亡率对于已达到180日龄的鹌鹑来说是在预料之中的。
研究了这种处理对大多数定时生物反应的开始、程度和延续时间的影响。本文所列出的数据大部分是日本鹌鹑整个产蛋期(即青春期或产蛋期后的20周)的数据。因此，下面有关抑制素免疫中和作用对此物种产蛋的开始、程度和持续时间的影响是得到证实的。
这些数据支持这样一个结论，即抑制素免疫中和的组青春期的开始得到了加速。在FIRST和FIFTY两个变量中所见到的明显处理差异和在最初几周的HDEP数据中所见到的差异都证明了这一点。
与抑制素处理的鸟的产蛋期的延长相关联的青春期的加速导致标记的总HDEP的增加(8.1％)。例如，以单个雌鸟为基础，抑制素处理实质上是在雌鸟具有生育能力(即能够产蛋)的产蛋期间的每一天，每日获得大约0.081个蛋。这就是说，在检验的20周期间，由所饲养的每一个雌鸟可以多获得11个蛋(0.081个蛋/母鸡×140天的产蛋期＝每个雌鸟每个产蛋期为11.34个蛋)。
在鸡和火鸡中发现的与在Coturnix中发现的结果相类似的结果与家禽工业具有重要的战略关系。应该注意针对产蛋强度选择日本鹌鹑，并且认为Coturnix的产蛋潜力远远大于商业上饲养的只是为了提供食用蛋的雌性鸡(单冠白来亨鸡)的产蛋潜力。因此，在选择的用来进行肉生产(如所饲养的用于消费其肉的适于烤焙的鸡种鸡)而不是用来进行蛋生产的鸡中，经抑制素接种而导致的产蛋强度的增加可能更大。
因此，上述数据表明由于本发明的抑制素组合物加速了日本鹌鹑青春期的开始，增加了产蛋强度，加速了最大产蛋期开始，所以提高了其生产能力。因为对于鸡的繁殖系统，日本鹌鹑是可以接收的动物模型，所以上述数据表明本发明的方法也将加速鸡产蛋的开始。因此，本发明的方法将导致产蛋者在较低的饲养成本下能够产生更多的蛋。
上述数据也显示因为本发明的抑制素组合物能使提高的温度对日本鹌鹑产蛋率的不利影响降至最小，所以其能提高其生产能力。更具体地说，在实施例8所描述的研究的第18周，这种鹌鹑暴露在提高的温度下，没有发生不利影响。如图2所示，第1组鸟(用MBP-cINA521/FRN处理)的产蛋率下降大约5％。相反，第2组鸟(对照FRN)的产蛋率下降大约26％。因此，本发明的提高生产能力的方法能改善不利的产蛋条件对产蛋率的副作用。因为，家禽经常在开放的无控制环境中饲养，所以本发明的这一方面是具有重要意义的。这样，种禽经常暴露在不利的条件(如高温和其它它们不能适应的极端天气条件)下，就降低了家禽工业的产蛋率。
下面是对在实施例9中讨论的本发明的提高鸵鸟生产能力的方法的简要概述。未进行处理的鸵鸟的平均青春期年龄为大约28至32个月。下面是体重大约为150至300磅的鸵鸟的处理计划在其26月龄时首次(第一次)注射5.0mg本发明的异源蛋白；在第27，28，30，32，34，和36月龄时进行2.5mg的加强免疫。
下面是对在实施例10中讨论的本发明的提高食火鸟生产能力的方法的简要概述。未进行处理的食火鸟的平均青春期年龄为大约20个月。下面是体重大约为50至90磅的食火鸟的处理计划在其18月龄时首次(第一次)注射3.0mg本发明的异源蛋白；在第19，20，22，24，26和30月龄时进行1.5mg的加强免疫。
下面是对在实施例11中讨论的本发明的提高鸡生产能力的方法的简要概述。未进行处理的鸡的平均青春期年龄为大约20周。下面是体重大约为2.0至3.5磅的鸡的处理计划在其15周龄时首次(第一次)注射1.5mg本发明的异源蛋白；在第17，20，24，30，40和50周龄时进行0.75mg的加强免疫。
下面是对在实施例12中详细讨论的本发明的提高火鸡生产能力的方法的简要概述。未进行处理的火鸡的平均青春期年龄为大约30周。下面是体重大约为9.0至12磅的火鸡的处理计划在其28周龄时首次(第一次)注射2.0mg本发明的异源蛋白；在第29，30，34，38，46和54月龄时进行1.0mg的加强免疫。
下面是对在实施例13中讨论的本发明的提高鹦鹉生产能力的方法的简要概述。未进行处理的鹦鹉的平均青春期年龄为大约30个月。下面是体重大约为0.5至1.25磅的鹦鹉的处理计划在其28月龄时首次(第一次)注射0.75mg本发明的异源蛋白；在第29，30，32，34，36和38月龄时进行0.375mg的加强免疫。
如上所述，本发明的方法通过加速其所施用的动物的青春期的开始提高了其生产能力。有关产蛋开始的术语＂加速＂指处理过的鸟产蛋开始较未处理的鸟产蛋通常开始的时间早至少大约3％。优选的是产蛋早开始至少大约5％，更优选的是产蛋早开始至少大约7％。甚至更优选的是产蛋早开始至少大约10％，最优选的是产蛋较未处理的鸟产蛋开始的时间早至少大约13％。
另外，如上所述，本发明的方法通过增加动物蛋产生或精子产生的强度提高了其生产能力。有关蛋产生的术语＂增加＂指与未处理的鸟蛋产生量相比，处理过的鸟的产蛋量增加至少大约3％。优选的是产蛋量增加至少大约7％，更优选的是产蛋量增加至少大约12％。
此外，如上所述，本发明的方法通过加速最大产蛋期的开始提高了其生产能力。有关最大产蛋期开始的术语＂加速＂指处理过的鸟最大产蛋期开始较未处理的鸟产蛋通常开始的时间早至少大约3％。优选的是最大产蛋期早开始至少大约5％，更优选的是早开始至少大约7％。甚至更优选的是早开始至少大约10％，最优选的是较未处理的鸟通常最大产蛋期开始的时间早至少大约13％。
令人惊奇的是，本发明的组合物也可以用来增加鸟类一生的总产蛋量。有关一生总产蛋量的术语＂增加＂指处理过的鸟一生总产蛋量较未处理的鸟的一生总产蛋量增加至少大约3％。优选的是一生总产蛋量增加至少大约7％，更优选的是一生总产蛋量增加至少大约12％。最优选的是一生总产蛋量增加至少大约13％。
出乎意料的是，本发明的组合物也可以用来减少或消除雌鸟换羽的需要，如通过提供第二次产蛋周期延长产蛋期。更具体地说，如果连续地向雌鸟施用上述的组合物(如上述方法公开的那样)，与未用本发明的组合物处理的鸟相比，这些鸟的产蛋率将保持足够高以致于其不需要换羽来提高其产蛋率。当雌鸟(如母鸡(单冠白来亨鸡，食用蛋生产者))的产蛋量下降以致于维持雌鸟产蛋的经济成本超过了其产生的蛋的经济收益，此时本领域一般使雌鸟换羽。给母鸡＂换羽＂，即让雌鸟经历大约4-14天的禁食期，直到其开始换羽(如失去羽毛)。在换羽期间，这些鸟停止产蛋。在这些鸟恢复到正常的饲养水平后一段时期，开始产蛋。从禁食到下一个产蛋周期，整个换羽期大约为两个月。实际上，鸟的产蛋率得到恢复。然而，在鸡换羽后，其在下一个周期的产蛋率与在第一个(换羽前)产蛋周期的产蛋率不同。M.North和D.Bell.商用鸡的生产手册，第4版，第19章，纽约的Van Norstrand Reinhold出版。
例如，鸡在大约20周时开始产蛋，经济效益明显的产蛋期为大约40至50周。在产蛋高峰，鸡每10天产8-9个蛋。然而，在产蛋大约50周后，产蛋率降至产蛋高峰的大约60％。此时，饲养鸡的成本高于其所产蛋的价值。通常的作法是此时使鸡换羽，以便鸡重新产蛋时，产蛋率增加。在这些鸟中鸡和鹌鹑的＂产蛋期的延长＂，即延长产蛋期大约1-4周。
因此，由于与没有用本发明的组合物处理的鸟相比，此组合物能保持更高水平的产蛋率，所以其能减少或消除使鸟换羽的要求。减少或不需要换羽是一种大大的节约。更具体地说，在鸟换羽期间或之前，这些鸟不能生产出它的饲养成本直到其换羽完成，然后在饲喂开始后的一段时间其也不能生产出其饲养的成本。因此将产蛋率保持在增加的水平能消除或减少鸟这些不生产的时期，从而降低生产者成本，增加生产者的利润。因为如上所述换羽后的产蛋率不等于第一个产蛋周期的产蛋率，所以将产蛋率保持在增加的水平还能增加蛋生产者的利润。
简言之，通过施用有效量的本发明的异源蛋白诱导鸟发生免疫反应来增加鸟的产蛋率，因此不再需要使鸟换羽，并且之后再施用异源蛋白(加强免疫)，以便保持更高水平的产蛋率。
因此，本发明的方法提高产生抑制素的雌性动物(如哺乳动物、爬虫和鸟(如平胸类))的生产能力。更具体地说，此方法提高雌性平胸类(如驼鸟、食火鸟和rhea)和鸡的生产能力。出乎意料的是，本发明的方法促进了动物青春期或者首次产蛋的开始。另外，本发明的方法加速了动物最大产蛋期的开始。此外，本发明的方法增加了动物的产蛋数量。并且，本发明的方法延长了动物的最大产蛋期。还有，此方法增加了动物一生的总产蛋。对于鸟类，本发明的方法也改进了鸟的饲料转化率。另外，本发明的方法出乎意料地减少或者消除了不利的产蛋的条件对暴露在这种条件下的动物的产蛋率的影响。这些不利条件包括升高的温度、过分拥挤、营养缺乏和噪音。
尽管不想被下列内容限制，但理论上本发明提高生产能力的方法在没有为蛋的多产而进行过遗传选择的物种中能提供更高的产蛋量。对于某些鸟类这是特别正确的。例如，自19世纪20年代晚期，对蛋鸡的最大生产能力进行了遗传选择(例如参见，Jull，M.A，1932，家禽育种，John Wiley和Sons)。鉴于鸡的生活周期短，从大约1928年到现在进行了此性状的大量选择。相反，平胸类和鹦鹉、大多数其它外来鸟和在较少程度上的肉鸡(适于烤焙的鸡)没有进行过蛋的多产的遗传选择。另外，濒危的鸟也没有进行过蛋的多产的遗传选择。因此，蛋鸡已是遗传上优良的产蛋者，与遗传上产蛋差至中等的鸟相比，其以本发明的方法处理所见到的增加的量是有限的。因此，用本发明的方法处理遗传上没有对蛋的多产性进行过选择的鸟(如平胸类、鹦鹉目、其它外来的鸟、濒危鸟类、火鸡和肉鸡)，其生产能力增加的量更大。
以本发明的异源蛋白免疫动物能诱导该动物产生选择性地抗此异源蛋白的抗体。优选地，免疫也诱导此动物产生选择性地抗内源抑制素的抗体。鸟产生的这种抗体能减少青春期或者产蛋的开始。动物产生的这种抗体也增加动物的产蛋能力或者精子的产生能力，因为所说的抗体中和了动物血液中的抑制素的生物活性。
尽管不想被下列理论限制，但认为抑制素的α-亚基与FSH受体结合，因此竞争性地抑制了FSH与这种受体位点的结合。降低可以结合受体位点的抑制素的水平，由于FSH受体位点竞争的降低，所以增加了动物中FSH的生物作用。一般认为这些抗体通过与循环抑制素相互作用而中和这些抑制素，因此在空间上(stearically)干扰了相互作用的抑制素结合到FSH受体位点上。
出乎意料地，本发明的方法也改进了产生抑制素的雄性动物(如哺乳动物、爬虫和鸟)的生产能力。更具体地说，本发明的方法增加雄性动物的睾丸激素水平。类似的是，本发明的方法增加雄性动物青春期或者精子产生的开始。另外，本发明的方法促进了雄性动物最大精子产生期的开始。此外，本发明的方法增加了雄性动物精子产生的强度(精子数)。还有，本发明的方法延长了动物的最大精子产生期。另外，本发明的方法增加了雄性动物的精液体积。并且，本发明的方法提高了动物精子的存活力。另外，本发明的方法意外地减少或消除了不利的条件对暴露在这种不利的条件下的动物精子产生的影响。这种不利的条件包括升高的温度、过分拥挤、营养缺乏和噪音。令人惊奇的是，本发明的方法增加了性欲，因此增加了雄性鸟类的生殖潜力。
本发明的另一个未预料到的和惊人的方面是与未处理的鸟产的蛋相比，本发明的组合物也产生更多的胆固醇含量较低的蛋。更具体地说，如果以上述的方法将上述的组合物施用给雌鸟，与未用本发明的组合物处理过的鸟相比，其在较长一段时间内产生胆固醇含量较低的蛋。因此，本发明的组合物增加或者产生更大量的低胆固醇蛋。
术语＂增加＂或者＂更大量的＂指与未处理的鸟产生的低胆固醇蛋的数量相比处理过的鸟产生的低胆固醇蛋的数量增加至少大约2％。优选地，所产生的低胆固醇蛋的数量增加至少大约5％，更优选的是增加至少大约10％。＂处理的＂鸟应该理解为已经施用了本发明的异源蛋白的鸟。术语＂更低的胆固醇＂或者＂低的胆固醇＂指蛋的胆固醇含量比此种鸟一生中所产的蛋的平均胆固醇含量低至少大约10％。优选的是低胆固醇蛋的胆固醇含量比此平均值低至少大约20％。更优选的是低胆固醇蛋的胆固醇含量比此平均值低至少大约30％。
已知在鸡中，在雌鸟(母鸡)达到青春期后首先产出的五至六个蛋较其后来产的蛋的胆固醇含量低。本发明的组合物诱导雌鸟在更长的一段时期内产生胆固醇含量较低的蛋。因为与血液中的高胆固醇水平相联系的健康状况的原因，仍然需要低胆固醇含量的蛋产品。因此本发明的组合物向蛋的生产者提供了很好的蛋鸡。使用所说的融合基因产物的基因治疗本发明也涉及通过向所说的动物施用融合基因产物来改进这些动物生产能力的方法，所说的融合基因产物包含编码α-亚基抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。可以将本发明的融合基因产物直接施用给所说的动物，或者可以以载体或者包含载体(其中具有融合基因产物)的细胞施用本发明的融合基因产物。
体内将基因转移到哺乳动物体细胞中(N.Yang，生物技术标准综述12(4)335-356(1992)，其内容本文一并参考)描述了为了基因产物蛋白质的表达，将DNA转移或者送递到细胞中的各种方法(也被称为基因治疗)。为了在来自体内或者体内的疗法中使用DNA序列，基因治疗包括将DNA序列加入到体细胞或者胚系细胞中。基因治疗的功能是代替基因，增加正常或者非正常的基因功能。
基因治疗的策略包括治疗策略，如鉴定缺陷基因，然后加入功能基因以便替代缺陷基因的功能或者稍微增加此基因的功能；或者预防策略，如加入所说的产物蛋白的基因。预防策略的例子为将编码抑制素或其片段和载体蛋白的融合基因产物置于动物中，由于所说的免疫反应继发性地降低动物的抑制素水平。
任何转移本发明的融合的基因产物的方案都作为本发明的一部分考虑了。启动子序列(而不是其它任何正常发现的与抑制素特异相关的启动子序列)或其它将降低抑制素蛋白生产的序列的转染也都被预见为基因治疗的方法。在马萨诸塞的剑桥转核疗法公司中有这一技术的例子，其是使用同源重组插入在细胞中证明是红细胞生成素基因的“基因开关”。参见基因工程报导，1994年4月15日。
用于基因治疗的转基因方法包括三大类物理方法(如电穿孔、直接基因转移和粒子轰击)、化学方法(以类脂为基础的载体或者其它非病毒载体)和生物学方法(病毒衍生的载体和受体摄取)。例如，可以使用包含涂上一层DNA的脂质体的非病毒载体。可以将这种脂质体/DNA复合物直接静脉内注射到动物体内。一般认为脂质体/DNA复合物是在将所说的DNA送递到巨噬细胞和星形细胞的肝脏中完成的。这些细胞寿命长，这样可以使送递的DNA长期表达。另外，可以直接将载体或者“裸露”的DNA基因注射到所需要的器官、组织或者肿瘤，以便完成治疗DNA的目标送递。
也可以以送递位点描述基因治疗的方法。基本的送递基因的方法包括来自体内的基因转移、体内基因转移和体外基因转移。在来自体内的基因转移中，从所说的动物获得细胞并将其在细胞培养物中培养。用所说的DNA转染这些细胞，将转染的细胞扩增到一定数量，然后重新植入到该动物中。在体外基因转移中，转化的细胞是生长在培养物中的细胞，如组织培养细胞，不是特定动物的特定细胞。转染这些“实验细胞”，选择并扩增这些转染的细胞以便用于植入到动物体内或者其它用途。
体内基因转移涉及到将所说的DNA导入到动物细胞(当细胞在动物体内时)中。其方法包括使用病毒介导的基因转移，即使用非感染病毒将所说的基因送递到动物中，或者将裸露的DNA注射到动物的某一部位中，并由部分表达基因产物蛋白的细胞摄取这些DNA。另外，可以使用本文描述的其它方法(如使用“基因枪”)用于体外插入抑制素DNA或者抑制素调节序列。
基因治疗的化学方法包括以类脂为基础的化合物(未必是脂质体)使所说的DNA通过细胞膜。脂质转染剂或细胞转染剂，以类脂为基础的与带负电的DNA结合的正离子形成能穿过细胞膜的复合物，并在细胞的内侧提供DNA。另一个化学方法使用以受体为基础的胞吞，其涉及将特异的配体与细胞表面的受体结合、将其包膜并运过细胞膜。所说的配体与所说的DNA结合，并将整个复合物转运到细胞中。将所说的配体基因复合物注射到血液中，然后具有所说的受体的靶细胞特异性地与配体结合，并将这种配体-DNA复合物转运到这种细胞中。
许多基因治疗方法使用病毒载体把基因插入到细胞中。例如，已经在来自体内的方法中使用了改变的逆转录病毒载体，以便将基因导入到外围和肿瘤浸润淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞或者其它体细胞中。然后将这些改变的细胞引入到动物体内，以便由插入的DNA提供所说的基因产物。
病毒载体也用来经体内方案将基因插入到细胞中。为了指导外来基因的组织特异性表达，可以使用已知对组织特异性的顺式作用调节元件或启动子。另外，可以通过将DNA或病毒载体原位送递到体内特异性构造的位点上来实现。例如，通过体外在选择的动脉壁位点上植入转导的内皮细胞来体内完成基因到血管的转移。此病毒能够感染也表达此基因产物的周围细胞。例如可以通过导管将病毒载体直接送递到体内的位点，这样使只有特定的位点由此病毒感染，并提供长期的位点特异性的基因表达。通过将改变的病毒注射到血管并到达器官，也已经在乳房组织和肝组织中实现了使用逆转录病毒载体的体内基因转移。
已用于基因治疗方案的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、其它RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒或者新培斯病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、SV 40、牛痘和其它DNA病毒。复制缺陷鼠逆转录病毒载体是最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒是由复合有核心蛋白和聚合酶(pol)的单链RNA组成，其由蛋白核心(gag)包住并由确定宿主范围的糖蛋白包膜(env)包围。逆转录病毒的基因组结构包括gag，pol和env基因，附带有5′和3′的长末端重复序列(LTR)。逆转录病毒载体系统的使用是基于这样的事实，即如果在包装细胞系中跨膜(in trans)提供病毒结构蛋白，包含5′和3′LTRs和包装信号的基本载体足以使载体包装、感染并整合到靶细胞中。逆转录病毒载体用于基因转移的根本好处包括有效的感染和在大多数细胞类型中的基因表达、精确的单拷贝载体在靶细胞染色体DNA上的整合和逆转录病毒基因组操作的容易性。
腺病毒是由复合有核心蛋白并由病毒衣壳蛋白包围的线性双链的DNA组成。分子病毒学的进展使得能够利用这些有机体的生物学以便创造能够将新基因序列体内转导到靶细胞中的载体。以腺病毒为基础的载体将以高水平表达基因产物肽。腺病毒载体甚至以低滴度的病毒也具有高效的感染性。此外，这些病毒作为非细胞的病毒颗粒是完全感染的，这样不必注射生产者细胞系。腺病毒载体的另一个潜在优点是能够体内完成异源基因的长期表达。
DNA送递的机械方法包括融合类脂泡(如脂质体或者用于膜融合的其它泡)、结合阳离子类脂的DNA类脂颗粒(如脂质转染剂)、多聚赖氨酸介导的DNA转移、DNA直接注射(如将DNA微注射到胚性或者体细胞中)、由空气作用送递的涂上一层DNA的颗粒(如用于“基因枪”的金颗粒)和无机的化学方法(如磷酸钙转染)。另一种配体介导的基因治疗方法涉及将所说的DNA与特异的配体复合以形成配体-DNA缀合物，将所说的DNA导入到特定的细胞或者组织中。
已经发现将质粒DNA注射到肌肉细胞中能产生很高比例的转染的细胞，这些细胞并能完成标记基因的表达。所说的质粒DNA可以或不整合到这些细胞的基因组上。非整合的转染DNA将使最终分化的非增殖性的组织更长时间地转染和表达基因产物蛋白，而不担心细胞或线粒体基因组发生突变性的插入、缺失或者改变。将治疗基因长期(但未必永久)转移到特异性的细胞中可以使遗传疾病得到治疗或者用于预防用途。可以定期地重新注射所说的DNA以便保证在受体细胞的基因组中的基因产物没有发生突变。非整合的外源DNAs允许在一个细胞中可以存在几种不同的外源DNA构建体，这样所有的构建体都表达不同的基因产物。
颗粒介导的基因转移方法首先用于转化植物组织中。使用粒子轰击装置或＂基因枪＂，可以产生将涂上一层DNA的高密度颗粒(如金或者钨)加速到很高速度的动力，这种速度使之穿透靶器官、组织或者细胞。粒子轰击可以用于体外系统或者与来自体内或者体内技术一起使用以将DNA导入到细胞、组织或者器官中。
基因转移的电穿孔方法使用电流以便使细胞或组织对电穿孔介导的基因转移敏感。使用带有给定场强的短时电脉冲增加膜的渗透性，这样DNA分子可以渗透到所说的细胞。这一技术可以用于体外系统或者与来自体内或者体内技术一起使用以将DNA导入到细胞、组织或者器官中。
可以使用体内载体介导的基因转移将外源DNA转染到细胞中。通常将载体-DNA复合物导入到体液或血液，然后特异性地定点导入到体内的靶器官或者组织中。可以使用脂质体和聚阳离子(如多聚赖氨酸、脂质转染剂和细胞转染剂)。可以产生细胞特异性或者器官特异性的脂质体，这样脂质体携带的外源DNA将由靶细胞摄取。针对某些细胞的特异性受体的免疫脂质体的注射可以用作将所说的DNA插入到含有所说的受体的细胞中的常规方法。另一种使用的载体系统是用于体内基因转移的将DNA携带到肝细胞中的脱唾液酸糖蛋白/多聚赖氨酸缀合物系统。
转染的DNA也可以与其它各种载体复合，这样将所说的DNA运送到受体细胞中，然后定居在细胞质或者核质中。DNA可以在特异的工程泡复合物中与载体细胞核蛋白结合，并直接运送到细胞核中。
通过施用与抑制素基因、或者与抑制素基因相关的控制区、或者它的相应的RNA转录区相结合的化合物以改变转录或翻译的速率可以实现抑制素的基因调节。另外，可以向动物施用由编码抑制素或其片段和载体蛋白的DNA序列转染的细胞，以便体内提供本发明的异源蛋白的来源。例如，可以用包含编码抑制素或其片段和载体蛋白的本发明融合基因产物的载体转染细胞。
本文所用的术语＂载体＂是包含或与特异性核酸序列相关的载体，其功能是将特异性的核酸序列转运到细胞中。载体的例子包括质粒和感染性的微生物，如病毒或非病毒载体(如配体-DNA缀合物、脂质体、类脂-DNA复合物)。将包含本发明的融合基因产物的重组DNA分子可操作性地连接到表达控制序列上以形成能够表达本发明的异源蛋白的表达载体。所说的转染的细胞可以是来自于动物正常组织的细胞和动物患病组织的细胞，或者可以是非动物细胞。
例如，用能够表达本发明异源蛋白的载体转染从动物获得的细胞，并将其重新导入到所说的动物中。转染的细胞然后产生本发明的异源蛋白，这样就诱导了抗所说的抑制素的免疫反应。也可以通过非载体或者本领域已知的物理或者化学方法(如电穿孔、离子穿孔(ionoporation))或者通过＂基因枪＂转染细胞。另外，可以在没有载体辅助的情况下，直接将本发明的融合基因产物注射到动物中。尤其是，本发明的融合基因产物可以注射到皮肤、肌肉或者血液中。
将抑制素或其片段转染到动物中的基因治疗方案可以是经融合的基因产物整合到所说的细胞的基因组(即小染色体)中，或者在这些细胞的细胞质或核质中作为独立复制或非复制的DNA构建体。异源蛋白的表达能持续较长一段时间，或者可以定期重新注射本发明的融合基因产物以便在这些细胞、组织或器官、或确定的血液中保持需要水平的异源蛋白。
可以经本领域任何已知的方法向鸟类施用本发明的融合基因产物。例如，可以经皮下、腹膜内、皮内、血管内或肌肉内施用所说的组合物。优选地，经皮下注射所说的组合物。另一种理想的施用方法是在理想的治疗位点附近进行血管内输注。可以以一种或几种剂量向鸟类施用此组合物。优选地，以几种剂量向鸟类施用此组合物，这样在首次免疫后可进行加强免疫。施用融合基因产物的优选量为每千克体重50-300微克。优选地，以载体的方式(如缓冲液或者弗氏佐剂)施用所说的融合基因产物。
本发明的提高鸟类生产能力的方法将大大促进平胸类(如驼鸟和食火鸟)的群体生长，因此满足了市场需要，这是因为本发明的方法将提高这些鸟的不理想的产蛋率。本发明的方法也将满足不断增长的对家禽(如家养鸡)和它们的蛋的需要。
使用本发明的方法提高生产能力不只限于提高鸟类的生产能力。可以在许多动物中使用本发明的提高生产能力的方法。如上所述，本发明的方法可以用于提高任何产生抑制素的动物的生产能力，这些动物包括但不限于农业上饲养的大多数动物(如猪、母牛、绵羊、火鸡、鹌鹑、鸭、鹅、海龟、鱼和鸡)；被毛动物(如貂、狐狸、水獭、雪貂、兔和浣熊)；实验用的啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠，豚鼠和沙土鼠)；皮用于装饰目的的动物(如产于美洲的鳄鱼和蛇)；外来的或者濒危物种；用于竞赛、娱乐和表演(竞赛)的动物(如马、狗、猫和动物园动物)；马戏团动物和人类。本发明的方法能提高其生产能力的其它鸟类包括平胸类、鹦鹉目、猎鹰目、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、ralliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes、anseriformes和herodiones。更具体地说，本发明的方法可以用于提高下列动物的生产能力驼鸟、食火鸟、rhea、无翼鸟、食火鸡、鹦鹉(parrot)、鹦鹉(parakeet)、makaw、猎鹰、鹰(eagle)、鹰(hawk)、鸽子、美冠鹦鹉、鸣禽、
鸟、山鸟类、雀类、啭鸟、金丝雀、巨嘴鸟、八哥或者麻雀。本发明的定性或定量方法本发明的另一个方面是产生抗本发明的异源蛋白的抗体。一般来说，产生抗本发明的异源蛋白的抗体的方法包括下列步骤向动物施用有效量的包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的本发明的异源蛋白，这样在此动物中可以发生抗这种异源蛋白的免疫反应；从此动物中获得血液样品；然后从血液样品的血清中分离抗抑制素的任何抗体。优选的是，通过使血清经过含有有效量的所说的载体蛋白的柱以便从血清中分离抗体来从所说的血液样品的血清中分离所说的抗体。另外，此柱包含本发明的异源蛋白。在另一种技术中，首先使所说的血清通过含有所说的载体蛋白的柱，然后再通过含有本发明的异源蛋白的柱来分离所说的抗体。用于产生和纯化抗本发明的异源蛋白的抗体的技术是本领域普通技术人员公知的。
应该理解根据所需要的抗体类型，可以向任何动物施用本发明的异源蛋白。并且，也应该理解所说的抑制素可以是外源或内源的。因此，本发明的异源蛋白中的抑制素类型和施用此组合物的动物物种由所需要的抗体类型确定。例如，包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的异源蛋白可以施用给鸵鸟，以便产生驼鸟抗鸡抑制素抗体。另外，包含驼鸟抑制素和麦芽糖结合蛋白的异源蛋白可以施用给鸵鸟以便产生驼鸟抗驼鸟抑制素抗体。
本发明也直接针对于快速，简单，可靠，廉价地确定动物是否是激素预处理的高水平或低水平的产蛋者的方法。更具体地说，本发明也涉及确定动物产生的抑制素的量的方法，因此能够确定动物的产蛋能力。简言之，确定动物血液中抑制素量的方法包括下列步骤抽取动物的血液样品；在允许抗体选择性地与存在于所说的样品中的任何抑制素相互作用的条件下，使血液样品与特异性地抗动物内源抑制素的抗抑制素抗体相接触；从相互作用的抗体中除去任何没有发生相互作用的抗体；确定发生相互作用的抗体的量。
本领域普通的技术人员将理解可以用于上述方法的免疫测定技术在本领域是公知的。因此，本领域已知的任何免疫测定技术、标记和可视化方法都可以用于上述的方法中，这些方法包括ELISA和放射免疫测定(RIA)。优选的免疫测定是ELISA(＂酶联免疫吸附测定＂)。优选的标记是辣根过氧化物酶。另一个优选的标记是彩色胶乳小珠。彩色胶乳小珠可以是可视化所需要的任何颜色。优选地，胶乳小珠是黄、红、蓝或者绿色。彩色胶乳小珠可以是空的或实心的，但优选的是空的以使其重量最小。胶乳小珠的大小根据其将用于的免疫测定而变化。本领域普通的技术人员将能够通过常规的实验确定可见的但不在空间上干扰免疫测定反应的最大珠的大小。优选地，胶乳小珠的直径小于0.5μ，最优选的是其直径小于0.2μ。
例如，可以使用夹层ELISA技术确定鸟血液中的循环抑制素浓度。首先，将直接针对部分抑制素或其片段的抗抑制素抗体与微量滴定板的孔结合。洗涤和封阻平板后，然后加入一定量的从待测的鸟获得的血浆。使样品中的任何抑制素(如果存在)选择性地与固定化的抗抑制素抗体相互作用后，将所说的样品从平板孔中洗出。接下来，向孔中加入标记的抗抑制素抗体，这些抗体直接抗不同部分的抑制素或其片段，而不是孔中固定的抗体。可以用本领域任何已知的标记标记抗体，如辣根过氧化物酶。在使标记的抗抑制素抗体选择性地与任何固定的抑制素相互作用后，通过洗涤除去任何没有相互作用的标记的抗抑制素抗体。通过使用在ELISA的标记中所用的合适的可视化方法以定量在孔中固定的标记的抗抑制素抗体，来确定存在于血浆样品中的抑制素的量。在相邻的平板孔中，同时进行标准的阳性和阴性对照。
应该理解任何产生抑制素的动物的繁殖潜力都可以通过上述的方法确定。本发明的方法可以用于确定任何产生抑制素的物种的雌性动物产生的抑制素的量。其中所说的动物可以是鸟、哺乳动物、鱼或者爬虫。更具体地，哺乳动物包括但不限于牛、人类、马、猫、狗、绵羊、貂、狐狸、水獭、雪貂、浣熊和猪。鸟包括但不限于驼鸟、食火鸟和鸡。优选的动物是鸟。更优选的动物是平胸类。尤其优选的动物是驼鸟。另一种优选的动物是食火鸟。还有另一种优选的动物是鸡。
抑制素水平高的动物具有较低的繁殖潜力，并依据相关的物种和它们是否为农业目的饲养，可以将这种产蛋较低的动物屠宰，而不用于繁殖目的。相反，那些抑制素量较低的农用饲养动物则是较高水平的蛋生产者，一般用于繁殖目的而不将其屠宰。
动物的抑制素水平随其年龄、物种和与繁殖期(如果有)有关的一年中的某个时间而变化。因此，动物的产蛋潜力的确定与这些因素有关，并且比较同一物种动物、大约相同年龄、在一年的同一时间(如果该动物有繁殖期)的平均抑制素水平，动物抑制素水平的测量是最有价值的。
由于鸟产生的抑制素的量随上述因素变化，下表中列出了不同年龄鸟的抑制素的相对量。表1是依据平胸类(如食火鸟和鸵鸟)是差或良好的蛋生产者及平胸类的年龄，平胸类抑制素生产的变异。
表1年龄(月) 抑制素水平繁殖潜力6-12 ＞5 差6-12 2-5 中等6-120-1.5 好24+ ＞7 差24+ 3-7中等24+0-2.5好在上表中，抑制素水平与雌性平胸类的标准库值1相关，每个繁殖期产蛋为平均50-60个，其繁殖潜力好；没有产蛋功能的雌性平胸类的库值为7，每个繁殖期产蛋不到5个，其繁殖潜力差。
本发明的另一个方面是产生抗另一种动物的一类抗体(如IgG)的动物抗体的方法。简言之，在动物中产生抗另一种动物的IgG的抗体的方法包括下列步骤向第二种动物施用有效量的第一种动物的抗体(如通过上述的方法产生的抗体)，这样在第二种动物体内发生抗第一种动物抗体的免疫反应；从第二种动物体内抽取血液样品；如上所述从血液样品的血清中分离第二种动物的抗体。优选的是，第二种动物不同于第一种动物。
本发明也直接针对快速、简单、可靠和廉价地确定动物是否对抑制素组合物的攻击发生免疫反应的方法。如上所述此方法使用了第二种动物的抗第一种动物的一类抗体的抗体。简言之，此方法包括使本发明的抑制素或者异源蛋白与固相结合；使固定的抑制素与待测的动物的血液样品接触。在使所说的抑制素选择性地与样品中的任何抗抑制素抗体相互作用的条件下，使此样品与固定的抑制素接触。从样品中除去没有相互作用的抗体并洗涤后，加入一定量的第二种动物的标记的抗体(其抗第一种动物的一类抗体)。抗此动物抗体的标记的抗体将选择性地与结合到固定的抑制素上的抗体相互作用。除去没有发生相互作用的标记抗体后，通过使这些标记物可视化来确定相互作用的标记抗体的存在或量。这样，此方法检测了抗此动物抑制素的抗体的存在，因此确定了此动物对施用包含抑制素的组合物是否发生免疫反应。
应该理解确定动物对施用包含抑制素的组合物是否发生免疫反应的方法可以在任何物种的雌性动物身上进行。其中所说的动物可以是鸟、哺乳动物、鱼或者爬虫。更具体地，哺乳动物包括但不限于牛、人类、马、猫、狗、绵羊、貂、狐狸、水獭、雪貂、浣熊和猪。鸟包括但不限于驼鸟、食火鸟、rhea和鸡。优选的动物是鸟。更优选的动物是平胸类。尤其优选的动物是驼鸟。另一种优选的动物食火鸟。还有另一种优选的动物是rhea。
本领域普通的技术人员应该理解用于上述方法的免疫测定技术是本领域公知的。因此，本领域已知的任何免疫测定技术、标记和可视化方法都可以用于上述的方法中。优选的免疫测定是ELISA。优选的标记是辣根过氧化物酶。另一个优选的标记是彩色胶乳小珠。彩色胶乳小珠可以是可视化所需要的任何颜色。优选地，胶乳小珠是黄、红、蓝或者绿色。彩色胶乳小珠可以是空的或实心的，但优选的是空的以使其重量最小。胶乳小珠的大小根据其将用于的免疫测定而变化。本领域普通的技术人员将能够通过常规的实验确定可见的但不在空间上干扰免疫测定反应的最大珠的大小。优选地，胶乳小珠的直径小于0.5μ，最优选的是其直径小于0.2μ。
本发明的另一个实施方案是直接针对于上述测定动物是否对施用包含抑制素的组合物发生免疫反应的方法，其中所说的方法做了如下修改。简言之，此方法包括从动物中获得血液样品；使其与标记的动物抑制素或其片段接触。在标记的动物抑制素选择性地与所说的样品中的任何抗抑制素抗体相互作用的条件下，将样品与所说的动物抑制素接触。在从样品中除去没有发生相互作用的标记抑制素后，通过可视化标记物来确定相互作用的标记抑制素的存在或量。用于此方法的抑制素选自但不限于下列物质本发明的融合异源抑制素蛋白；内源抑制素或其片段；和外源抑制素或其片段。优选地，标记的抑制素是内源抑制素。
通过下列实施例进一步说明本发明，这些实施例不以任何方式构成对本发明范围的限制。相反，应该十分清楚可以采取各种其它的实施方案、改良方案和等同方案，在阅读完本说明书后本领域技术人员将清楚这些方案没有背离本发明的实质和/或附属的权利要求的范围。
实施例1产生包含编码表达鸡抑制素基因和编码表达麦芽糖结合蛋白基因的融合基因产物下面是用于产生融合基因产物(该融合基因产物包含编码表达α-亚基鸡抑制素片段(SEQ ID NO2)的基因(cINA521)和编码表达麦芽糖结合蛋白的基因)的方法。本发明的融合基因产物制自pMALTM-C载体试剂盒(得自新英格兰生物实验室，Beverly，马萨诸塞)。
pMALTM载体提供用于产生一种蛋白质的方法，该蛋白质由在读框中克隆的基因表达。把克隆的基因插入雄性基因的下游，所述雄性基因编码麦芽糖结合蛋白(“MBP”)并导致MBP融合蛋白(“MBP-cINA521”)的表达。该方法利用MBP对麦芽糖的亲和性产生了克隆序列高水平的表达以及用于融合蛋白MBP-cINA521的一步纯化。
下面是把抑制素基因cINA521连接进pMALTM-C载体的方法1.用限制性核酸内切酶Pstl消化在20μl中的0.5μg pMALTM-c质粒DNA。
2.用相同的酶Pstl消化5μg包含鸡抑制素基因的cINA6质粒DNA。
3.通过在0.8％琼脂糖凝胶上进行4μl的pMALTM反应和4μl的cINA6反应检查完全消化。然后运行制备型琼脂糖凝胶并通过prep-A-基因纯化试剂盒纯化Pstl cINA521片段。
4.把0.05单位的小牛肠碱性磷酸酶(NEB#290)添加至载体DNA消化。在37℃下培养1小时。
5.把相等体积的1∶1酚/三氯甲烷混合物添加至载体限制性消化物并混合，在离心后，除去含水(顶端)相并放置在新鲜的试管中。仅以三氯甲烷重复。
6.把10μg糖原或tRNA作为载体添加至载体消化物中，添加1/10体积的3M醋酸钠并混合，然后添加两体积的乙醇。在-20℃下培养30分钟。
7.微离心15分钟。倒出上清液，用70％乙醇冲洗沉淀，然后进行干燥。
8.把每种样品重新悬浮在20μl水中。
9.混合0.2μg载体消化物与0.5μg插入消化物；添加水至18μl，然后添加2μl10×连接酶缓冲液；0.5μl NEB T4连接酶(#202；～200单位)；在16℃下培养2小时至过夜。
10.在65℃下加热5分钟；在冰上冷却。
11.把5μl的连接混合物与100μl感受态DH5α(或任何lacZα-补体菌株)混合并在冰上培养15-30分钟。加热至42℃并保持2分钟。
12.添加1ml LB并在37℃下培养60分钟。涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。在37℃下培养过夜。以无菌牙签在LB amp主平板上和包含80μg/ml Xgal和0.1mM IPTG的LB amp平板上挑选菌落。在37℃下培养8至16小时。在Xgal平板上给Lac表型评分，并从主平板回收“白”克隆。
13.以下列方法的一种或两种筛选插入物的存在A.制备微制剂DNA。用适当的限制性核酸内切酶消化以确定插入物的存在和方向。
B.i)在LB amp肉汤中培养5ml培养物至大约2×108/ml。
ii)取1ml样品。微离心2分钟，弃去上清液并把细胞重新悬浮在50μl蛋白质凝胶SDS-PAGE样品缓冲液中。
iii)把IPTG添加至余下的培养物中至0.3mM，例如15μl 0.1M的母液。在良好的通气下于37℃下培养2小时。
iv)取0.5ml样品。微离心2分钟，弃去上清液并把细胞重新悬浮在100μl SDS-PAGE样品缓冲液中。
v)煮沸样品5分钟。在10％SDS-PAGE凝胶上与一组蛋白质MW标准品和提供的在SDS-PAGE样品缓冲液中的MBP一起电泳15μl的每种样品。以考马斯亮蓝染色凝胶。在对应于融合蛋白分子量的位置容易见到诱导带。仅MBP的分子量是42,000道尔顿。
实施例2产生包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的融合异源蛋白“MBP-cINA521”下面是产生包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的融合异源蛋白“MBP-cINA521”的方法。实施例1的融合基因产物表达融合的异源麦芽糖结合蛋白-抑制素蛋白“MBP-cINA521”，如下1.向80ml浓肉汤+葡萄糖和氨苄青霉素(见下面的培养基和溶液)接种0.8ml包含实施例1的融合质粒的过夜培养的细胞。
2.在37℃及良好的通气下培养至2×108个细胞/ml(A600～0.5)。取1ml样品并微离心2分钟(非诱导细胞)，弃去上清液并把细胞重新悬浮在50μlSDS-PAGE样品缓冲液中。涡流并置于冰上。
3.向余下的培养物添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至0.3mM的最终浓度，例如在H2O中的0.24ml 0.1M母液(参见培养基和溶液)。在37℃下继续培养2小时。取0.5ml样品并微离心2分钟(诱导细胞)，弃去上清液并把细胞重新悬浮在100μl SDS-PAGE样品缓冲液中。涡流至重新悬浮细胞并置于冰上。
4.把培养物分成两个等分试样。通过在4000×g下离心10分钟收获细胞。弃去上清液并把1份沉淀(样品A)重新悬浮在5ml裂解缓冲液中(参见培养基和溶液)。再把另1份沉淀(样品B)重新悬浮在10ml 30mM Tris-Cl、20％蔗糖、pH8.0(每0.1g细胞湿重8ml)中。
5.在干冰-乙醇浴中冻结样品(或在-28℃下过夜)。在冷水中解冻(20℃比70℃更有效，但是花费的时间较长)。
6.声处理并通过使用Bradford测定或在A260下核酸的释放测定蛋白质的释放监测细胞破裂，直到其达到最大值。添加0.6ml 5M NaCl。
7.在9,000×g下离心20分钟。倒出上清液(粗提取物1)并在冰上保存。在5ml裂解缓冲液中重新悬浮沉淀。这是不溶性物质的悬浮液(粗提取物2)。
如上产生的异源融合麦芽糖结合蛋白-抑制素蛋白质“MBP-cINA521”的柱纯化如下1.在250ml的过滤培养瓶中于50ml柱缓冲液中(参见培养基和溶液)膨胀直链淀粉树脂(1.5g)30分钟。用吸气器除去气体。倒入2.5×10cm柱中。以3柱体积的相同缓冲液+0.25％Tween20洗涤柱。
所需的树脂的量取决于所产生的融合蛋白的量。树脂结合大约3mg/ml的床体积，因此大约15ml的柱体积对于多达45mg融合蛋白/升培养物的产量是足够的。以硅烷化的玻璃绒塞住的50ml注射器可用于替代2.5cm柱。柱高度与直径的比应小于或等于4。
2.用柱缓冲液+0.25％Tween20稀释粗提取物1∶5。以[10×(柱直径cm)2]ml/小时装载稀释的粗提取物。对于2.5cm柱这是大约1ml/分钟。
粗提取物的稀释的目标是将蛋白质浓度降低至大约2.5mg/ml。如果粗提取物的浓度较低，不要过度稀释。一项单凭经验的好方法是1g湿重细胞产生大约120mg蛋白质。
3.用2柱体积柱缓冲液+0.25％Tween20洗涤。
4.用无Tween20的3柱体积柱缓冲液洗涤。
5.用柱缓冲液+10mM麦芽糖+0.1％SDS(可有可无的10mMβ-巯基乙醇、1mM EGTA)洗脱融合蛋白“MBP-cINA521”。收集10-20份3ml的级分。通过例如，Bradford测定或A260°测定级分中的蛋白质；包含融合蛋白的级分具有容易检测的蛋白质。在柱的空体积后很快洗脱出融合蛋白。培养基和溶液*浓培养基+葡萄糖和氨苄青霉素＝每升10g胰蛋白胨、5g酵母膏、5g NaCl、2g葡萄糖。高压灭菌添加无菌氨苄青霉素至100μg/ml。
*0.1M IPTG母液＝1.41g IPTG(异丙基-β-o-硫代半乳糖苷)；加H2O至50ml。过滤并灭菌。
*0.5M磷酸钠缓冲液，pH7.2(母液)＝(A)69.0g NaH2PO4H2O添加至1升H2O中。
(B)70.9g Na2HPO4添加至1升H2O中。
把117ml(A)与383ml(B)混合。这种母液的pH应该为～7.2。以柱缓冲液稀释至10mM，pH应是7.0。裂解缓冲液每升 最终浓度20ml 0.5M Na2HPO410mM磷酸盐1.75g NaCl30mM NaCl10ml 25％Tween 20 0.25％Tween j200.7mlβ-巯基乙醇 10mM β-ME(“β-ME”)(可有可无)20ml 0.5M EDTA(pH 8) 10mM EDTA10ml 1M EGTA(pH 7)10mM EGTA以HCl或NaOH将pH调整至7.0柱缓冲液每升 最终浓度20ml 0.5M磷酸钠pH 7.2 10mM磷酸盐29.2g NaCl0.5M NaCl1ml1M叠氮化钠 1mM叠氮化物0.7mM β-ME(可有可无) 10mMβ-ME1ml 1M EGTA(pH 7.0) 1mM EGTA(可有可无)如果必要，调整至pH7.0低盐柱缓冲液每升最终浓度20ml 0.5M磷酸钠pH 7.2 10mM磷酸盐1.75g NaCl 30mM NaCl1ml1M叠氮化钠 1mM叠氮化物0.7mMβ-巯基乙醇(可有可无) 10mMβ-ME1ml 1M EGTA(pH 7) 1mM EGTA(可有可无)如果必要，调整至pH 7.0融合的鸡抑制素-MBP异源蛋白“MBP-cINA521”通过柱之后的纯度在图1柱“E”中说明。标号为“F”的柱是当没有异源蛋白装载在柱上时从柱中的洗脱液(阴性对照)。标号为“B”的柱代表质粒pMALTM-C载体标准品。标号为“C”的柱是分子量标准品。标号为“D”的柱是实际的pMALTM-C载体(该载体在插入如实施例2所述的抑制素基因前用于制备融合的鸡-抑制素-MBP异源蛋白“MBP-cINA521”。上述蛋白质在SDS-PAGE样品缓冲液中于SDS-PAGE凝胶上电泳，以考马斯亮蓝染色。
实施例3免疫抗抑制素的驼鸟下面是用于免疫抗抑制素的驼鸟的方法。在鸵鸟第一个繁殖季节之前大约六个月对驼鸟进行初次免疫，然后以一个月的间隔对鸵鸟加强免疫六个月。因此，优选的是当鸵鸟在大约18至24月龄之间时对其施用初次免疫。初次免疫包含大约1.5至3.0mg之间的融合异源蛋白质，该蛋白质包含通过实施例1和2的方法产生的鸡抑制素(α亚基片段)和麦芽糖结合蛋白。加强免疫包含大约0.75至1.5mg之间的融合异源蛋白。在初次免疫中，融合异源蛋白在弗氏完全佐剂(Sigma化学公司，St.Louis，MO)中乳化，在加强免疫中，融合异源蛋白在弗氏不完全佐剂(Sigma)中乳化。在三个位点沿驼鸟的上腿区皮下注射融合异源蛋白组合物。
实施例4产生选择性地抗抑制素的驼鸟抗体下列是产生驼鸟抗体(“驼鸟抗鸡抑制素抗体”)的方法，该抗体选择性地抗包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的本发明的异源蛋白。更具体地说，驼鸟抗体是IgG抗体。所利用的异源蛋白是通过实施例1和实施例2中所述的方法产生的包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白。为了产生该抗体，按照实施例3描述的方法以鸡抑制素-MBP异源蛋白免疫驼鸟。施用给驼鸟的量必须足以引发驼鸟抗异源蛋白的免疫反应。从驼鸟中抽取大约5ml血液，然后从其余部分的血液样品中分离抗抑制素的抗体。在本领域中已知的任何分离方法都可用于分离抗体。优选地，使用标准的ELISA技术结合亲和与HPLC柱。
实施例5产生选择性地抗鸵鸟抗体的山羊抗体下列是产生选择性地抗一组驼鸟抗体(包括在实施例4中产生的抗体，更具体地说是IgG驼鸟抗体)的山羊抗体的方法。按这种方法，山羊以0.5至3.0mg的驼鸟IgG免疫，这样，免疫反应发生于抗驼鸟IgG的山羊之中。驼鸟IgG从得自不同驼鸟的血清库获得。血液从山羊获得。然后，利用本领域已知的标准技术从样品中分离山羊抗驼鸟IgG。
利用标准方法纯化血清库，该方法包括利用50％硫酸铵沉淀，随后使用蛋白质琼脂糖凝胶柱分级分离。优选地，IgG沉淀如下进行。将包含IgG的12ml血清用50mM-Tris(pH8.0)以1∶1稀释。其次，随搅拌缓慢添加24ml的饱和硫酸铵(均在4℃下)，搅拌混合物大约2小时。在10,000rpm下离心混合物10分钟以收集沉淀。把沉淀重新悬浮在50mM-Tris盐水中(至12ml)，于4℃下相对于2L 50mM-Tris透析过夜，最终体积是20ml。
优选地，随后利用蛋白质-A琼脂糖凝胶柱的分级分离如下。柱包含蛋白质A-琼脂糖凝胶CL-4B(Pharmacia生物技术公司，Piscataway，NJ)。柱装载大约5ml的硫酸铵/血清沉淀。使样品结合蛋白质A-琼脂糖凝胶大约30分钟。其次，柱用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤，吸收的IgG以0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱。最后，通过添加几滴1M Tris-HCl(pH9)中和洗脱的级分。在施用于山羊之前，纯化的驼鸟IgG的质量在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过视觉测试。
利用的免疫方法和佐剂对本发明不是关键性的，这样，可以利用本领域已知的任何方法，可以使用本领域已知的任何佐剂系统。优选地，把纯化的驼鸟IgG皮下注射进山羊。以四周的间隔利用弗氏不完全佐剂进行加强注射也是优选的。优选地，纯化的IgG与弗氏完全佐剂或Hunter′sTitermax(Sigma化学公司，St.Louis，密苏里)施用。在三至四次注射后，山羊产生了令人满意的免疫反应。
其次，从山羊中抽取5-10ml的血液，从血液样品分离抗驼鸟IgG的山羊抗体。任何本领域已知的方法都可用于从血液样品分离山羊抗体。从样品分离山羊抗体优选的方法是使血液样品通过驼鸟IgG柱。然后通过用甘氨酸缓冲液-pH 8.0洗涤柱从柱收集山羊抗体。
实施例6在用融合异源蛋白接种鸵鸟后监控其免疫反应下面是用融合异源蛋白(由通过实施例1和2的方法产生的鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白质组成)接种鸵鸟后监控其免疫反应的方法，其中所说的免疫反应通过利用在实施例5中产生的山羊抗体监测。为了确定驼鸟是否与融合的抑制素-MBP异源蛋白产生免疫反应，首先把异源蛋白结合到固相上。其次，从用异源蛋白免疫的鸵鸟中抽取5-10ml血液并从血液中分离血清。在下述条件下使固化的异源蛋白与血清接触，在所说的条件下异源蛋白选择性地与在血清中的任何抗抑制素抗体相互作用。在洗涤后，添加在实施例5中产生的、以HRP标记的山羊抗体。然后标记的山羊抗体与结合到固定化的异源蛋白上的驼鸟抗体选择性地相互作用。在除去未发生相互作用的标记的抗体后，通过标记的可视化确定相互作用的HRP标记的山羊抗体的存在或数量。优选地，标记通过添加硝基蓝四唑鎓(“NBT”)(HRP的底物)来可视化。
本领域的普通技术人员可以理解用于上述方法的免疫测定技术在本领域中是熟知的。因此，任何免疫测定技术、标记和可视化方法都可以用于上述方法。优选的免疫测定是ELISA，优选的标记是辣根过氧化物酶。另一个优选的标记是彩色的胶乳小珠。
实施例7测定驼鸟的生殖潜力下面是通过定量测定驼鸟血液中抑制素的量测定驼鸟生殖潜力的方法。在驼鸟血液中循环的抑制素浓度可以利用放射免疫测定(RIA)或标准的夹层ELISA技术测定。首先，把在实施例4中产生的抗抑制素抗体结合到微滴定板的孔上。在洗涤并封闭平板后，然后把从鸵鸟获得的一定量的血浆或血清添加到微滴定板的孔中。在使样品中的任何抑制素(如果存在)与固定化的抗抑制素抗体选择性地相互作用后，从平板的孔中洗去样品。其次，把不同的抗抑制素抗体(而非在实施例4中产生的抗体，其与辣根过氧化物酶缀合)添加至孔中。HRP缀合的抗抑制素抗体不同于固定化的抗抑制素抗体，其中它们选择性地抗抑制素的不同部分。在使标记的抗抑制素抗体与任何固定化的抑制素选择性地相互作用之后，通过洗涤除去任何未相互作用的标记的抗抑制素抗体。存在于血浆样品中的抑制素的量通过把NBT添加至孔中并在孔中可视化固定化的标记的抗抑制素抗体量测定。标准的阳性和阴性对照在相邻的平板孔中同时进行。许多免疫测定技术、标记和可视化方法在本领域是已知的。因此，任何免疫测定方法、标记和可视化技术都可以用于本发明。
实施例8在鹌鹑中提高蛋产量如上所述，插入到Bluescript的EcoR 1位点中的鸡抑制素α-亚基cDNA克隆(cINA6)为P.A.Johnson(Cornell大学)所赠。利用PstI消化从cINA6克隆切除DNA片段(“cINA521”)。cINA521DNA片段包括大多数成熟鸡抑制素α-亚基。把该片段(cINA521)符合读框地克隆进具有麦芽糖结合蛋白质(“MBP”)的载体p-MALTM-C中，适当大小的融合蛋白(泳道E；图1)在IPTG(异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导和SDS-PAGE后检测。形成的蛋白质缀合物(“MBP-cINA521”)用作抗原以免疫抗循环抑制素水平的青春期前的雌性日本鹌鹑，描述如下。
把孵化的鹌鹑在改进的用于鹌鹑的2S-D Petersime型孵卵器电池中孵化。初始的孵化温度是大约37.8℃，每周下降大约2.8℃直到达到室温。在生长期间(即直到大约6周龄)，开始给鹌鹑定量配给食物(28％CP，2,800Kcal ME/kg 饲料)，提供足量的水。使用持续暗淡的光(221x)，14小时光(280至3001x)10小时黑暗。在25日龄时，把50只鹌鹑随机分成两个相等的注射组(每组25只鸟)如下(1)在弗氏佐剂中的MBP-cINA521(＂MBP-cINA521/FRN″)，或(2)弗氏(佐剂对照；“FRN”)。在适当的对照载体中，使之免疫而抗抑制素的鸟(第1组)每只鸟大约施用0.75mgMBP-cINA521。把相当的作为媒介的注射体积(0.2ml)的FRN施用于第2组。所有注射利用带有25号针头的结核菌素注射器皮下注射。在初始注射后，在关进产蛋笼(单个)前，固定鹌鹑的翅膀以通过处理鉴别它们。每周每只鸟皮下施用大约0.375mg MBP-cINA521的加强抑制素免疫，或适当的对照免疫刺激，连续五周(即在32，39，46，53和60日龄时)，其后每35天进行三次附加的免疫刺激(即在95，130和165日龄时)。鹌鹑饲养定量配给食物(21％CP，2,750Kcal ME/kg饲料)，提供足量的水。
在41日龄时开始(所考虑的产蛋周期的第一天)，记录每日雌鹌鹑日蛋产量(“HDEP”)和死亡率(“MORT”)测定，连续20周。此外，计算每一处理组的首次产蛋(“FIRST”)的平均日龄和雌鹌鹑达到50％产蛋量(“FIFTY”)的日龄或如上所述的最大产蛋量。
对雌鹌鹑日蛋产量数据进行方差分析(ANOVA)，其中使用具有处理裂区排列的完全随机设计。主要区由两个注射处理组成(MBP-cINA521/FRN，或FRN)，20个7天的产蛋期，每一个包括split。
在雌鹌鹑中，抑制素免疫中和明显地加速了青春期。在抑制素处理的雌鹌鹑中，FIRST产蛋平均日龄降低(P＜.0088)近六天(表2)。在抑制素处理的雌鹌鹑中，达到FIFTY产蛋量的日龄也显著地减少(12天P＜.01)(表3)。
抑制素处理对雌鹌鹑的日蛋产量(HDEP)的促进效果也存在，在产蛋周期的开始和结束最显著(图2)。例如，当与PRN对照相比时，在利用MBP-cINA521/FRN处理的雌鹌鹑中观察到了显著大(P＜.05)的平均HDEP率，第1周为(16.5对2.6％)，第2周为(50.0对28.6％)，第4周为(96.6对79.7％)，在第15周时又为(98.8对86.9％)，第16周为(96.9对86.3％)，第18周为(85.7对66.1％)，第20周为(96.8％对73.8％)。抑制素-处理的雌鹌鹑的总HDEP率(包括所有20周的产蛋)是83.5％，相比之下，对照组为75.4％。
除加速青春期、延长产蛋期并提高全面的产蛋强度之外，抑制素处理降低了达到产蛋高峰所需要的时间(大约3周)(图2；比较第4周时MBP-cINA521/FRN＝96.6％HDEP对第7周时FRN＝96.6％HDEP)。虽然高峰HDEP值的区别没有进行统计学评价，处理在平均日龄(此时雌鹌鹑达到50％HDEP水平(FIFTY))的差异反映了高峰能力。
在本研究中，死亡率不是一个因素，因为仅有八只鸟死亡(三只对照，五只处理)。对于达到180日龄的鹌鹑来说这样的MORT(16％)在预期的限度之内。
表2在日本鹌鹑的第一产蛋量中，抑制素免疫中和对平均(±SE)日龄的效果处理 第一产蛋日龄(天)FRN156.15＝1.82aMBP-cINA521/FRN250.38＝1.08b1＝弗氏佐剂对照。
2＝MBP-cINA521/FRN＝在弗氏佐剂中的麦芽糖结合蛋白-鸡α515-抑制素融合蛋白。
a，b(P＜.0088)。
表3在日本鹌鹑的50％产蛋量中，抑制素免疫中和对平均(±SE)日龄的效果处理50％产蛋日龄(天)FRN173.04＝3.78aMBP-cINA521/FRN261.00＝2.70b1＝弗氏佐剂对照。
2＝MBP-cINA521/FRN＝在弗氏佐剂中的麦芽糖结合蛋白-鸡α515-抑制素融合蛋白。
a，b(P＜.01)。
无壳与薄壳蛋的发生率在对照鸟(而非抑制素免疫的鸟)中发生的频率更大，特别是在产蛋周期的后期。这表明更大数量的缺陷蛋(即不适于消费或在消费前蛋很有可能破碎，或不能作为孵化蛋)与对照处理相关。
实施例9提高驼鸟的产蛋能力蛋白质缀合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母驼鸟使之抗循环抑制素水平，由此在处理的驼鸟中加速产蛋开始。按照实施例8中所描述的方法进行，例外如下用于未处理驼鸟的青春期的平均年龄在大约28至32个月之间。下面是处理具有大约150至300磅的近似体重范围的驼鸟的处理进度表在其第26个月的年龄初次(第一次)注射5.0mg本发明的异源蛋白；在第27、28、30、32、34、36月的年龄时注射2.5mg加强免疫。
实施例10提高食火鸟的产蛋能力蛋白质缀合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母食火鸟使之抗循环抑制素水平，由此在处理的食火鸟中加速产蛋开始。按照实施例8中所描述的方法进行，例外如下用于未处理食火鸟的青春期的平均年龄是大约20个月。下面是处理具有大约50至90磅的近似体重范围的食火鸟的处理进度表在其第18个月的年龄初次(第一次)注射3.0mg本发明的异源蛋白；在第19、20、22、24、26、30月的年龄时注射2.5mg加强免疫。
实施例10提高鸡的产蛋能力蛋白质缀合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母鸡使之抗循环抑制素水平，由此在处理的鸡中加速产蛋开始。按照实施例8中所描述的方法进行，例外如下用于未处理鸡的青春期的平均年龄是大约20周。下面是处理具有大约2.0至3.5磅的近似体重范围的鸡的处理进度表在其第15周的年龄初次(第一次)注射1.5mg本发明的异源蛋白；在第17、20、24、30、40与50周龄时注射0.75mg加强免疫。
实施例11提高火鸡的产蛋能力蛋白质缀合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母火鸡使之抗循环抑制素水平，由此在处理的火鸡中加速产蛋开始。按照实施例8中所描述的方法进行，例外如下用于未处理火鸡的青春期的平均年龄是大约30周。下面是处理具有大约9.0至12磅的近似体重范围的火鸡的处理进度表在其第28周的年龄初次(第一次)注射2.0mg本发明的异源蛋白；在第29、30、34、38、46与54周龄时注射1.0mg加强免疫。
实施例13提高鹦鹉的产蛋能力蛋白质缀合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母鹦鹉使之抗循环抑制素水平，由此在处理的鹦鹉中加速产蛋开始。按照实施例8中所描述的方法进行，例外如下用于未处理鹦鹉的青春期的平均年龄是大约30周。下面是处理具有大约0.5至1.25磅的近似体重范围的鹦鹉的处理进度表在其第28月的年龄初次(第一次)注射0.75mg本发明的异源蛋白；在第29、30、32、34、36与38月龄时注射0.375mg加强免疫。
当然，应该理解前面仅涉及本发明的优选的实施方案，在不背离所附的权利要求中提出的精神和范围时，本文可以做出无数的改进或变化。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名农业技术有限公司(B)街道Jones和Askew，Peachtree街道191，Ste.3700(C)城市亚特兰大(D)州佐治亚(E)国家美利坚合众国(F)邮编代码(ZIP)30303(G)电话(404)818-3700(H)传真(404)818-3799(A)姓名路易斯安那州立大学A&M管理董事会(B)街道Jones和Askew，Peachtree街道191，Ste.3700(C)城市亚特兰大(D)州佐治亚(E)国家美利坚合众国(F)邮编代码(ZIP)30303(G)电话(404)818-3700(H)传真(404)818-3799(ii)发明名称抑制素组合物和提高生产能力的方法(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#1.0，版本号#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度521个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设结构否(iv)反义链没有(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..303(xi)序列描述SEQ ID NO1CTG CAG CGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG48 LeuGln Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg5 10 15GCG TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC95 AlaSer Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile2025 30GTG CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC 144 ValHis Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala3540 45GAA GGC CAC GGG CTG AGC CAC CGG CTG GGG GTG CAG CTG TGC TGC GCC 192 GluGly His Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gln Leu Cys Cys Ala5055 60GCG CTG CCC GGC ACC ATG CGC TCA CTG CGT GTC CGC ACC ACC TCT GAT 240 AlaLeu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp6570 75 80GGT GGC TAC TCC TTC AAG TAC GAG ACG GTG CCC AAC ATC CTG GCG CAG 288 GlyGly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gln85 90 95GAC TGC ACC TGT GTC TAGCAGCTGG CATGCACGGC CAGACCCGCG TGGATCTCCC 343 AspCys Thr Cys Val 100CGTTGCCTCT GGACTGCCCC AGTGCCAGAT GATGAGCCCA TCCCAGGGAT GGAGGAGTCA 403CTCACACGGG CACTGCGCAG CCCGGAGCAG GGAGAGGGAC CCAGGTGGAA GTTTTGGTGG 463TGCCACCCTC CCTTTGACTG CCAGGGTTTC ATGGTTTCAG GTTGCGTGGG TGCTGCAG 521(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度101个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu Gln Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg5 10 15Ala Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile20 25 30Val His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala 3540 45Glu Gly His Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gln Leu Cys Cys Ala 5055 60Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp 6570 75 80Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gln85 90 95Asp Cys Thr Cys Val100
权利要求
1.一种提高鸟类生产能力的方法，这种方法包括向鸟类施用一种有效量的包含α-亚基鸟类抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的异源蛋白来提高鸟类生产能力。
2.权利要求1的方法，其中所说的鸟选自由平胸类(ratite)、鹦鹉目(psitaciforme)、猎鹰目(falconiforme)、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、falliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes、anseriformes和herodiones组成的组。
3.权利要求2的方法，其中所说的平胸类是驼鸟、食火鸟、rhea、无翼鸟、食火鸡。
4.权利要求2的方法，其中所说的鸟是鸡、火鸡、鹦鹉(parrot)、鹦鹉(parakeet)、makaw、猎鹰、鹰(eagle)、鹌鹑、鹰(hawk)、鸽子、美冠鹦鹉(cockatoo)、鸣禽、
鸟、山鸟类、雀类、啭鸟、鹅、鸭、金丝雀、八哥、巨嘴鸟或者是麻雀。
5.权利要求1的方法，其中所说的抑制素蛋白具有或者包含实质上与SEQ ID NO1相同的序列。
6.权利要求1的方法，其中所说的载体蛋白是麦芽糖结合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、有性生殖细胞、含有Ia抗原的有性生殖细胞或者氨基酸的聚合物。
7.权利要求1的方法，其中所说的鸟是雌性鸟。
8.权利要求l的方法，其中所说的鸟是雄性鸟。
9.一种融合的异源蛋白，这种蛋白包含融合到载体蛋白上的α-亚基抑制素蛋白或者其片段。
10.权利要求9的融合的异源蛋白，其中所说的抑制素蛋白具有或者包含实质上与SEQ ID NO2相同的序列。
11.权利要求9的融合的异源蛋白，其中所说的载体蛋白是麦芽糖结合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、甲状腺球蛋白、有性生殖细胞、含有Ia抗原的有性生殖细胞或者氨基酸的聚合物。
12.一种产生融合的异源蛋白的方法，这种方法包括下列步骤(a)提供编码α-亚基抑制素或其片段的双链cDNA；(b)提供具有产生载体蛋白的编码信息的载体；(c)将所说的抑制素cDNA连接到此载体上；(d)将连接的载体插入到一种表达系统中；(e)表达包含抑制素蛋白或其片段和此载体蛋白的融合异源蛋白。
13.权利要求12的方法，其中所说的抑制素cDNA具有或者包含实质上与SEQ ID NO1相同的序列。
14.权利要求12的方法，其中所说的表达的融合异源蛋白中的抑制素蛋白或其片段具有或者包含实质上与SEQ ID NO2相同的序列。
15.权利要求12的方法，其中所说的载体蛋白是麦芽糖结合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔戚血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、有性生殖细胞、含有Ia抗原的有性生殖细胞或者氨基酸的聚合物。
16.一种融合的基因产物，这种基因产物包含融合到编码载体蛋白表达的基因中的编码α-亚基鸟类抑制素蛋白或其片段表达的基因。
17.权利要求16的融合基因产物，其中所说的编码α-亚基鸟类抑制素蛋白表达的基因编码具有或包含实质上与SEQ ID NO2相同之序列的蛋白的表达。
18.权利要求16的融合基因产物，其中所说的编码α-亚基鸟类抑制素蛋白表达的基因实质上与SEQ ID NO1的序列相同。
19.权利要求16的融合基因产物，其中所说的编码载体蛋白表达的基因编码麦芽糖结合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、甲状腺球蛋白、γ-球蛋白、有性生殖细胞、含有Ia抗原的有性生殖细胞或者氨基酸的聚合物。
20.一种组合物，这种组合物包含含有载体的细胞，其中所说的载体包含编码抑制素或其片段和载体蛋白的DNA序列，并且其中所说的载体当其存在于此细胞中时，能够表达融合到此载体蛋白上的抑制素或其片段。
21.权利要求20的组合物，其中所说的编码抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
22.一种包含载体的组合物，其中所说的载体包含编码抑制素或其片段和载体蛋白的DNA序列，并且其中所说的载体当其存在于此细胞中时，能够表达融合到此载体蛋白上的抑制素或其片段。
23.权利要求22的组合物，其中所说的编码抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
24.一种提高鸟类生产能力的方法，这种方法包括向鸟类施用一种有效量的融合基因产物来提高鸟类生产能力，这种基因产物包含编码α-亚基鸟类抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。
25.一种方法，这种方法包括植入到包含载体的动物细胞中，其中所说的载体包含编码抑制素或其片段和载体蛋白的DNA序列，并且其中所说的载体当其存在于此细胞中时，能够表达融合到此载体蛋白上的抑制素或其片段。
26.权利要求25的方法，其中所说的编码抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
全文摘要
一般来说,本发明涉及通过向鸟类施用一种包含抑制素蛋白或其片段和载体蛋白的异源蛋白来提高鸟类生产能力的方法。本发明也涉及通过向鸟类施用一种融合基因产物来提高鸟类生产能力的方法,这种基因产物包含编码α－亚基鸟类抑制素蛋白或其片段表达的基因和编码载体蛋白表达的基因。向动物施用有效量的所说的异源蛋白或融合基因产物,以便在动物体内发生抗此异源蛋白的免疫反应。本发明还涉及上述的异源蛋白和融合基因产物以及产生这些产物的方法。
文档编号A61K39/00GK1192692SQ96195839
公开日1998年9月9日 申请日期1996年6月6日 优先权日1995年6月7日
发明者W·C·菲尔莱提, K·科索拉司, D·G·塞特里 申请人:农业技术公司, 路易斯安那州立大学及农业和机械学院, 管理委员会