专利名称：人MP52 Arg蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人MP52 Arg化合物和一种特别可促进软骨及骨的形态形成的含有人MP52 Arg的医药组合物。特别是，这种医药组合物可用于治疗象骨质疏松症等由异常骨代谢造成的骨疾病，并用于治疗骨折、矫形再建、骨移植、整容外科以及牙科的治疗。而且，它在软骨疾病的治疗中也很有用。
包括维生素D3、降钙素、雌激素及二膦酸衍生物的药物组合物已被用于治疗骨疾病的临床实践，然而，它们的治疗效果却不完全令人满意，因此，人们渴望一种更佳的药物组合物。
已报道生长因子的TGF-β家族包括BMP、TGF及抑制素相关蛋白，它们在伤口的愈合及组织修复过程中起作用。其中一些蛋白的骨形态形成活性也已为人所知。PCT专利申请WO93/16099及WO95/04819揭示了编码人TGF-β样蛋白及作为一种优选蛋白的人MP52的DNA序列。
E.E.Storm等在《自然》(Nature)1994，368期，639-643页中报道了TGF-β超家族中的一个新成员小鼠生长/分化因子5(GDF5)的突变会导致小鼠短足。小鼠GDF5与人MP52预测的成熟形式的氨基酸序列上除一个氨基酸外完全相同。然而，在这篇文章中没有将这些蛋白用于治疗骨病的建议。
因此，本发明的目的是提供一种可作为骨及软骨形成刺激剂的又一生长因子。此发明的一个实施方案就是人MP52 Arg蛋白，其包括序列1中的氨基酸1-121。
事实上，在此发明中惊奇地发现，一些细胞系在表达一种合适的DNA序列时可形成人MP52 Arg或人MP52和人MP52 Arg的混合物。本发明首次成功地提供了具有骨形态形成活性及可用于预防和/或治疗骨病的人MP52 Arg。
我们进一步证实，人MP52 Arg可诱导未分化的间叶细胞形成软骨及刺激成骨细胞的分化和成熟。因此，人MP52 Arg可有效地预防和/或治疗象似骨质疏松症那样的由于异常骨代谢导致的骨病。它还可以加速骨折的愈合。还有，鉴于它的促进骨形态形成活性，它还可以应用于矫形再建、骨移植以及牙科的治疗。此外，人MP52 Arg对于预防和/或治疗由异常软骨代谢引起的软骨疾病也有效。
本发明的另一个目的是一种生产人MP52 Arg的方法，其中将至少一部分如序列1所示的DNA序列在有利于该DNA序列表达和蛋白形成的条件下引入一种适当的宿主细胞，随后将所述蛋白与所述宿主细胞所产生的其它蛋白分离。
在本发明的框架中，序列1所描述的DNA序列可用来生产人MP52Arg，但用较短的一部分仍编码人MP52 Arg的DNA片段在合适的载体/宿主细胞中获得表达仍是可能的。合适的表达系统对于本领域的熟练技术人员来说是清楚的，而且所需序列1中所述的DNA片段的最小长度可以轻易地通过常规试验确定。
在蛋白形成之后，用本身知道的方法从宿主细胞中获取蛋白并最终从中分离人MP52 Arg。特别是，可用本领域中熟练技术人员所已知的精确区分的分离方法将序列上只差一个氨基酸的人MP52和人MP52 Arg分离。一个实例就是按照Davis(Ann.NY Acad.Sci.，121，404-427，1964)的方法，对其进行类似加入0.1％Nonidet P-40及6M尿素这种小的改进的基础上进行MP52 Arg的电泳分离。电泳结束后，将被分开的MP52 Arg从凝胶片上在相同的缓冲液中电洗脱下来。
本发明的另一个目的是一种含有人MP52 Arg的药物组合物。视情况所需，这种组合物还可以包括载体物质、辅料、稀释剂和/或填充物。本发明的这种药物组合物可用于促进骨形态形成、治疗或预防骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘液膜、上皮或牙的损伤；用于牙科的植入以及创伤的愈合及组织的再生过程中。
对于治疗由异常骨代谢所导致的骨病，MP52 Arg可通过全身注射给药，如静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射，也可通过口服或如栓剂这种非口服方式以及其它任何形式的常规方法给药。
对于治疗骨折，可通过注射、口服及非口服的方式全身或局部给药。还可以优选地将含有人MP52 Arg的基质种植到骨折骨的附近。合适的基质是天然的聚合物如胶原和纤维蛋白凝块、人工的可在活体内降解的聚合物如聚乳酸聚乙二醇酸(polylactated glycolic acid)。
在应用于矫形再建、整容外科、骨移植及牙种植时，举例说MP52 Arg可通过胶原糊、纤维蛋白原胶及其他粘着物包被在待种植的骨或牙的表面。也可以将其施用在移植骨和牙周围的组织、骨或牙槽骨上。在骨移植中它既可以用于天然骨又可用于人工骨。在人工骨和牙的材料上，通常所用的如金属、陶瓷、玻璃及其他天然的或人工的无机物都可利用。羟磷灰石是一种优选的人工材料。人工骨可通过内部为紧密的物质另一侧为多孔的物质组成。例如，可提及紧密的钢包裹的多孔的钢。多孔的羟磷灰石是用作生产人工骨的材料之一，当利用这种物质时，可将人MP52 Arg渗透到其中。也可将人工骨的表面处理得粗糙些，以便使MP52 Arg附于其表面上。
将人MP52 Arg用于去除了癌变的骨组织的部位也是有益的，它可以加速骨的重建。
所用人MP52 Arg的剂量取决于应用的方法和目的。一般来说，全身应用时，剂量为1μg-100μg/kg。当用于种植时，优选的剂量为30μg-30mg每个部位。
纯化的人MP52 Arg可配成任何一种常规形式，如注射液、丸剂、胶囊和栓剂。局部用药，可将人MP52 Arg掺在如胶原、纤维蛋白胶及聚乳酸聚乙二醇酸的基质内。若用于种植及移植，则将其附于骨和牙的表面或其多孔的部位。
本发明将以实施例进一步阐明。实施例1MP52 Arg表达载体的构建pSK52s质粒(WO95/04819)用Hind III消化，将含有全长编码MP52的cDNA的DNA片段从0.8％的低熔点的琼脂糖凝胶中提取出来，并将其连接到由Behringwerke AG的Gerd Zettlmeiβl博士提供的pABstop载体的Hind III位点上。所得的MP52的表达质粒pMSS99通过DNA测序及限制性内切酶谱证实。pMSS99的遗传学元件在
图1中列出。pMSS99中的MP52序列包括序列号1中的576-2279核苷酸。实施例2产MP52 Arg的CHO克隆的建立Dhfr缺乏的CHO细胞CHO-DUKX-B11(Urlaub，G.和Chasin，L.A.(1980)《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，77，4216-4220)用MP52的表达质粒(pMSS99)及pSVOAdhfr(Zettlmeiβl，G.等，(1987)《生物/技术》(Bio/Technology)5，720-725)以磷酸钙介导的DNA转染的方法进行共转染。之后，利用氨甲喋呤(MTX)介导的基因扩增方法建立MP52高产克隆。
简言之，将10μg的pMSS99及2μg的pSVOAdhfr溶于1ml的25mMHEPES-140mM NaCl-0.75mM Na2HPO4(pH 7.05)中，然后与50μl的2.5M的CaCl2混合。将此沉淀剂覆于CHO-DUKX-B11细胞上并在室温下孵育30分钟。然后将含有核糖核苷及脱氧核糖核苷的MEMα培养液(MEMα+)和10％胎牛血清(FBS)的混合物加到细胞层上，在二氧化碳孵箱中孵育4-6小时。用含10％FBS的MEMα+中的10％甘油在室温下处理3分钟后，将细胞在含10％FBS的MEMα+培养液中培养2天，然后将细胞置于含有10％透析过的FBS的不含核糖核苷及脱氧核糖核苷的MEMα培养液(MEMα-)中来筛选转化的细胞。分离转化克隆，利用下一节所描述的蛋白质印迹分析方法检测MP52的表达。
利用氨甲喋呤(MTX)介导的基因扩增方法建立MP52高产克隆。用逐渐增加MTX浓度的方法进一步筛选产MP52 Arg克隆从而使MP52基因随pSVOAdhfr基因一起得到同步扩增。获得了一些在MTX浓度为400nM时，产1-3μg成熟MP52 Arg/106细胞/24小时的克隆。实施例3检测培养上清中的MP52 Arg克隆通过下面所述的蛋白质印迹分析方法来检测MP52 Arg的表达在还原条件下，将培养上清(1-15μl)加到SDS-PAGE(15％-25％聚丙烯酰胺梯度凝胶，Daiichi Pure Chemicals)上，之后将此蛋白质转移到PVDF膜(Clear Blot Membrane-P，ATTO)上。将膜用Block Ace(Dai-Nihon Seiyaku)封闭1小时，用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤后，用10μg/ml的鸡MP52 Arg抗体在10倍稀释的Block Ace中孵育过夜。用含0.1％Tween 20的TBS(TTBS)将膜冲洗后，用ALP连接的兔抗鸡IgG(Sigma A 9171)在10倍稀释的Block Ace中将膜处理1小时。将膜用TTBS冲洗之后与碱性磷酸酶偶联物底物试剂(BIO-RAD)反应以产生MP52 Arg的可见带。实施例4产MP52 Arg的CHO细胞系的细胞培养MP52 Arg和MP52最高产率的CHO细胞系-MC-2细胞(No.FERMBP-5142，于1995年6月21日保存于日本国家生物科学和人类技术研究所)于含有10％FBS、400nM MTX、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEMα-培养液中在摇瓶中生长。当MC-2细胞长满时，用不含血清的MEMα-n冲洗，并在加有10mM HEPES(pH 7.3)、10 KIE/ml抑酶肽、1mM丁酸钠、6μg/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、18μg/ml乙醇胺、9μg/ml胰岛素、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的不含血清的DME/F12培养液中培养。每天收集条件培养液一次，共一周。实施例5纯化1升的培养上清中混入0.1体积的0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.0)并加入POROS HS柱上(10ml，PerSeptive Biosystems)。用0.3-2M的NaCl线性梯度洗脱。将含有MP52 Arg的洗脱液加入到反相柱子中(RESOURSE RPC，Pharmacia)。用含有0.05％TFA的线性乙腈梯度洗脱。在乙腈浓度大约为35％时，MP52 Arg被洗出。利用脉冲式液气相序列分析仪(Applied Biosystems model 476)对纯化的MP52 Arg进行N-末端氨基酸序列分析。结果见表1。结果提示MP52 Arg从它的前体进行蛋白水解加工的位点为Arg(380)-Arg(381)(在序列1中氨基酸位置-1和+1)。然而，该前体也可从Arg(381)-Ala(382)(序列1中的氨基酸位置+1和+2)处进行加工。表1 CHO细胞表达的MP52的N-末端氨基酸序列分析循环氨基酸(pmol) MP52的氨基酸序列#1 Arg(32.7)，Ala(37.2) Arg#2 Ala(41.1)，Pro(19.0) Ala#3 Pro(30.7)，Leu(24.2) Pro#4 Leu(34.6)，Ala(19.8) Leu#5 Ala(34.0)，Thr(9.1)Ala#6 Thr(12.3)，Arg(13.7) Thr#7 Arg(24.5)，Gln(10.1) Arg#8 Gln(17.8)，Gly(15.4) Gln#9 Gly(24.7)，Lys(14.8) Gly#10Lys(25.9)，Arg(16.1) Lys#11Arg(23.2)，Pro(13.1) Arg#12Pro(20.0)，Ser(3.2)Pro#13Ser(4.9)，Lys(11.2)Ser#14Lys(16.6)，Asn(7.2)Lys#15Asn(12.1)，Leu(8.7)Asn#16Leu(18.3)，Lys(14.7) Leu#17Lys(20.9)，Ala(10.8) Lys#18Ala(15.5)，Arg(10.9) Ala#19 Arg(15.4) Arg#20 Ser(2.6)Cys#21 Ser(3.26)，Arg(10.8) Ser#22 Arg(18.4)，Lys(7.0) Arg#23 Lys(10.8)，Ala(7.2) Lys#24 Ala(13.0)，Leu(10.3) Ala#25 Leu(14.5)，His(3.2) Leu#26 His(6.8)，Val(9.1)His#27 Va1(14.2)，Asn(8.0) Val#28 Asn(8.7)，Phe(9.5)Asn#29 Phe(9.9)，Lys(8.3)Phe#30Lys (1.0) Lys实施例6生物活性将成骨祖细胞样ROB-C26细胞(Calcif.Tissue Int.vol.49，221-225，1991)按1.5×104/孔的浓度铺在48孔板(Coaster)上，在含10％胎牛血清(FBS)的MEMα-培养液中预孵育3天。去掉培养液后，加入含10％FBS的新鲜MEMα-及已用10mM HCl(2μg/ml)系列稀释过的MP52 Arg并孵育6天，并在第3天更换培养液和添加物。用PBS冲洗细胞层，并用含1mM MgCl2下的0.2％Nonidet提取。碱性磷酸酶(ALP)活性按Takuwa等的方法(美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)257期，E797-E803，1989)进行测定。如表2所示，用MP52 Arg处理的每孔ROB-C26细胞的总ALP活性浓度依赖性地提高。表2CHO细胞来源的MP52 Arg对ROB-C26细胞系的ALP活性的影响MP52 Arg的浓度(ng/ml)ALP活性(nmol/分/孔)载体(10mM HCl)-处理的对照5.22±0.1935.79±0.6210 7.10±0.75*30 8.36±0.77*100 9.35±0.67*300 10.34±1.06*1000 16.09±1.26*所列数值为4个值的平均值±S.D.。*与载色剂处理的对照比较p＜0.01(Dunnett检验)
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischenEntwicklung von Pharmaka mhH(B)街道Czernyring 22(C)城市Heidelberg(E)国家德国(F)邮编(ZIP)69115(ii)发明题目新的人MP52 Arg蛋白(iii)序列数目2(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(v)本申请数据中请号EP 95112241.5(2)序列号1的信息(i)序列特征(A)长度2703碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线形(vi)最初来源(A)生物体Homo sapiens(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)定位640..2142(ix)特征(A)名称/关键sig_肽(B)定位640..720(ix)特征(A)名称/关键mat_肽(B)定位1780..2142(xi)序列描述序列号1CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG 60TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA 300TCCCTCAGCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCAGG AGAAAGGGGG 360CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC 420GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG 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权利要求
1.一种蛋白质，其包括序列表中序列1中的氨基酸1-121。
2.权利要求1的生物活性蛋白质的生产方法，其中将至少一部分如序列1所示的DNA序列在允许该DNA序列表达和蛋白形成的条件下引入一种合适的宿主细胞，然后将所述蛋白与所述宿主细胞产生的其他蛋白质分离。
3.含有权利要求1的蛋白质作为活性物质的药物组合物，如果需要还一起含有常规的载体物质、辅料、稀释剂和填充物。
4.权利要求3的药物组合物用于促进骨形态形成、治疗或预防骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘液膜、上皮或牙的损伤，用于牙种植、创伤愈合及组织再生过程的用途。
5.权利要求3的药物组合物治疗骨质疏松症或骨折的用途。
6.用于矫形重建、骨移植、整容外科或牙科种植的权利要求3的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及人MP52 Arg蛋白和一种可促进软骨及骨的形态形成的含有人MP52 Arg的医药组合物。特别是,这种医用组合物可用于治疗象骨质疏松症等由异常骨代谢造成的骨疾病,并用于治疗骨折、矫形再建、骨移植、整容外科以及牙病的治疗。而且,它在软骨疾病的治疗中也很有作用。
文档编号A61P1/00GK1192237SQ96195841
公开日1998年9月2日 申请日期1996年8月2日 优先权日1995年8月3日
发明者木村道夫, 松本智明, 高桥美树子, 河合伸治, 藤野幸夫 申请人:药物生物技术发展公司