一种针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备方法
【专利摘要】一种针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体。本发明是以多功能人Tudor-SN蛋白为研究对象，首先通过近红外双色激光成像及质谱分析方法确定在受到外界环境氧化应激时人Tudor-SN蛋白103位点苏氨酸发生磷酸化修饰；再根据二级结构预测结果，合成含T103磷酸化位点的半抗原多肽，并与载体蛋白（KLH）偶联形成完全抗原；然后与佐剂联合4次免疫SPF级新西兰大白兔，获取、纯化并鉴定T103特异性应激磷酸化多克隆抗体。本发明在实际应用中能够检测不同应激环境下Tudor-SN蛋白的表观遗传磷酸化修饰，探讨其与细胞应激肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供潜在作用靶点。
【专利说明】一种针对人Tudor-SN蛋白Tl 03位点的应激磷酸化抗体制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体制备【技术领域】，具体涉及一种针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体的制备。
【背景技术】
[0002]Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease),又称 plOO 蛋白、SNDl(staphylococcal nuclease domain containing 1)，是首次作为 EBNA2 (Epstein-Barrvirus nuclear protein 2,EB病毒细胞核抗原2)转录调控激活因子被发现的一种多功能蛋白。
[0003]人Tudor-SN蛋白由N端4个重复葡萄球菌核酸酶样(Staphylococcalnucleases-like, SN-1ike)的 SN (I?4)结构域及 C 端的 SN5a-Tudor-SN5b (TSN)结构域组成(图1)。SN (葡萄球菌核酸酶)，又称为耐热核酸酶，是一种Ca2+依赖酶，可水解单/双链DNA和RNA的5’-磷酸二酯键，生成3’-单核苷酸和多核苷酸。SN结构中含有可识别多种核苷酸的保守OB折叠结构(寡聚核苷/寡聚糖结合折叠)，这是Tudor-SN与多种核酸物质结合的机制之一。
[0004]H202氧化应激状态下的大鼠血管平滑肌细胞Tudor-SN基因表达上调；Tudor_SN蛋白可与含IU碱基对的1-dsRNA同时定位于细胞应激颗粒中。恶性疟原虫Tudor-SN蛋白的SN结构域可与冷休克DNA结合蛋白(cold-shock DNA binding protein)相互作用，提不Tudor-SN蛋白可能参与细胞冷休克应激。Micrarchus nov.sp.2昆种Tudor-SN mRNA在给予0°C冷休克刺激Ih后会发生表达上调，提示Tudor-SN可能是一种应激冷响应基因。Tudor-SN蛋白有助于提高植物应激耐受力(stress tolerance)并可稳定对应激敏感的mRNA水平，对于植物在高盐、高渗环境的生长和生存至关重要。Tudor-SN蛋白可与ADAR(Adenosine deaminases acting on RNA)蛋白直接结合参与应激颗粒构。Tudor-SN蛋白还可通过SN结构域与G3BP蛋白直接结合；给予细胞45°C热休克或亚砷酸盐应激处理后，Tudor-SN可在胞衆中形成应激颗粒；当下调内源性Tudor-SN蛋白表达水平时胞内应激颗粒的初始形成并未受到抑制，但从小到大的颗粒聚集过程受到影响，提示Tudor-SN蛋白可能并非应激颗粒形成的启动因子，但会影响颗粒聚集效率。
[0005]Tudor-SN蛋白可与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)的非结构蛋白(Non-structural protein I, nspl)结合参与调节病毒亚基因组mRNA的合成。Tudor-SN蛋白与传染性胃肠炎冠状病毒(transmissible gastroenteritis coronavirus, TGEV)基因组的3’端结合而影响病毒的复制过程。Tudor-SN蛋白可与革登热病毒(Dengue virus,DENV)基因的3’UTR结合，且对该病毒的复制过程至关重要。此外，Tudor-SN蛋白还可参与基因转录、剪接体加工、细胞增殖、RNA干扰、病毒感染等多种细胞生物学事件。多功能Tudor-SN蛋白具有较为广泛且重要的生物学作用，其中任一环节出现异常，都有可能引起一定的临床疾病。Tudor-SN蛋白与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等多种人类疾病相关。
【发明内容】
[0006]本发明目的是解决有效研究人Tudor-SN蛋白的表观遗传修饰问题，提供一种针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备方法。
[0007]本发明制备的应激磷酸化抗体有助于探讨Tudor-SN蛋白的表观遗传修饰在肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供潜在的作用靶点。Tudor-SN蛋白功能的多样性有赖于自身蛋白的翻译后修饰作用，比如磷酸化修饰。
[0008]本发明提供的针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体的制备方法，包括以下步骤:
第I步、首先确定Tudor-SN蛋白应激磷酸化位点
首先通过近红外双色激光成像发现受到外界环境氧化应激时人Tudor-SN蛋白(NP_055205.2)会发生磷酸化，然后通过质谱分析确定是在Tudor-SN蛋白103位点苏氨酸Thr发生转录后磷酸化修饰；
第2步、合成包括T103磷酸化位点的半抗原多肽
根据二级结构预测，T103周围分值较低，有可能在Native状态的蛋白中，不易露在分子表面。为尽量确保能够识别磷酸化位点，抗原多肽的长度设计为能够得到抗体的最小长度，即以T103为中心前后选择5个氨基酸。同时为了结合载体蛋白，多肽末端须连接半胱氨酸Cys。
[0009]第3步、进行抗原免疫动物及血清获取
将第2步合成的T103位点磷酸化半抗原多肽分别与载体蛋白KLH偶联为完全抗原，以完全抗原与佐剂联合4次免疫SPF级新西兰大白兔；分离免疫的新西兰大白兔全血、收集抗血清；
第4步、最后纯化并鉴定T103特异性应激磷酸化抗体
以ELISA测定第3步收集的抗血清针对目的多肽的效价，再以Dot blot和WesternBlot实验确定抗血清是否能够特异性识别HeLa细胞内源性磷酸化Tudor-SN蛋白；另外，同时合成相应的T103位点非磷酸化多肽抗原，用于纯化针对磷酸化多肽的特异性抗体；首先以交联有磷酸化多肽的亲和层析柱进行亲和纯化；以交联有非磷酸化多肽的亲和层析柱吸收，去除与相应非磷酸化多肽有交叉反应的抗体成分；然后以KLH交联的亲和层析柱吸收，去除其中针对载体蛋白的抗体成分；再用透析、浓缩等方法去除其中的非抗体蛋白成分，最终获得纯化的抗PT103磷酸化抗体(2.08mg/ml),以50% glycerol/PBS液保存；再次以ELISA检测纯化后磷酸化抗体效价以及针对磷酸化目的多肽、非磷酸化多肽的识别性，最后以Western Blot及免疫突光实验进行抗体鉴定。
[0010]本发明的优点及效果:
(I)本发明提供的应激磷酸化抗体在实际应用中能够检测不同应激环境下多功能人Tudor-SN蛋白的转录后磷酸化修饰情况。
[0011](2)本发明提供的应激磷酸化抗体在实际应用中便于探讨人Tudor-SN蛋白特定位点应激磷酸化与特定生物学事件如细胞应激、DNA拐伤、细胞周期等的相关性。
[0012](3)本发明是针对人Tudor-SN蛋白特定T103位点制备的磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生应激磷酸化的激酶作用，探讨参与Tudor-SN蛋白多种生物学功能的细胞信号转导通路及蛋白/核酸相互作用网络。
[0013](4)本发明提供的应激磷酸化抗体有助于探讨Tudor-SN蛋白的表观遗传修饰在肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供潜在的作用靶点。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1人类Tudor-SN蛋白结构示意图。
[0016]图2Tudor-SN蛋白总苏氨酸应激磷酸化分析。
[0017]图3Tudor-SN蛋白T103位点应激磷酸化质谱分析。
[0018]图4Tudor-SN蛋白含T103位点区抗原性分析。
[0019]图5抗pT103的未纯化抗血清Dot blot检测。
[0020]图6抗pT103的未纯化抗血清Western检测。
[0021]图7抗PT103的纯化前后抗体ELISA检测。
[0022]图8抗pT103的纯化后抗体Western blot检测。
[0023]图9抗PT103的纯化后抗体细胞免疫荧光检测。
【具体实施方式】
[0024]针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体的制备,下面结合具体实施例，进一步阐述本发明:
实施例1、首先确定Tudor-SN蛋白应激磷酸化位点
I)我们通过L1-COR Odyssey?近红外双色激光成像系统(图2)发现当给予HeLa细胞亚砷酸盐氧化应激、45°C热休克和4°C冷休克处理后，内源性Tudor-SN蛋白苏氨酸(Thr)磷酸化总体水平升高。
[0025]2)随后LC-MS/MS研究结果表明在给予HeLa细胞亚砷酸盐氧化应激时Tudor-SN蛋白SNl结构域中103位点的苏氨酸会发生磷酸化修饰(图3)。因此我们针对T103位点制备兔源多克隆磷酸化抗体。
[0026]实施例2合成包括T103磷酸化位点的半抗原多肽
(O首先我们针对含T103位点的Tudor-SN蛋白功能区域进行二级结构预测，包括疏水性(accessibility)、柔韧性(Flexibilty)、表面暴露(Surface probability)、抗原性(Antigenecity)、亲水性(Hydrophilicity)、极性(Dipole)等，分析 Tudor-SN 的抗原性。结果显示(图4)，T103周围分值较低，有可能在Native状态的蛋白中，不易露在分子表面。
[0027](2)根据二级结构预测，确定含T103磷酸化位点的多肽候选氨基酸序列。为尽量确保能够识别磷酸化位点，抗原多肽的长度设计为能够得到抗体的最小长度，即以T103为中心前后选择5个氨基酸。同时为了结合载体蛋白，多肽末端须连接半胱氨酸Cys。
[0028]确定的磷酸化多肽抗原序列为:pT103: TIENKpTPQGRC (98-107)。
[0029](3)针对Tudor-SN蛋白T103位点合成相应的磷酸化多肽/非磷酸化多肽,共两条，达30mg，纯度高，达免疫动物要求。
[0030]实施例3、进行抗原免疫动物及血清获取将合成的T103位点磷酸化半抗原多肽分别与载体蛋白(KLH)偶联为完全抗原。以完全抗原与佐剂联合4次免疫SPF级新西兰大白兔，共免疫2只新西兰大白兔。注意:免疫动物前每只兔子需分别取Iml免疫前血清作为阴性对照。第O天:初次免疫(完全福氏佐剂+抗原，60(T800ug/只)；第21天:第一次加强免疫(不完全福氏佐剂+抗原，40(T500ug/只)；第35天:第二次加强免疫(不完全福氏佐剂+抗原，40(T500ug/只)；第49天:第三加强免疫(不完全福氏佐剂+抗原，200ug/只);第56天采全血分离、收集约75ml抗血清。
[0031]实施例4、最后纯化并鉴定T103特异性应激磷酸化抗体
(I)首先分别包被人工合成的磷酸化多肽抗原，加入不同稀释比例的免疫前、后血清，孵育后洗涤，加入Ant1-Rabbit IgG Conj.POD孵育，洗涤后TMB显色，反应终止测定0D450。ELISA效价达到1:20,000以上的抗血清方可进行后续的纯化处理。
[0032](2)常规培养HeLa细胞，给予细胞0.5mM Arsenite应激处理lh，以未处理组为对照组，以不同稀释比例抗血清进行点和条带信号检测。如图5与图6所示，两支免疫前血清在应激前后均未检测到信号；而抗T103抗血清在应激后可检测到相对较强的点、条带信号。综合上述鉴定结果，选择抗PT103抗血清(#2)进行纯化处理。
[0033](3)首先以交联有磷酸化多肽的亲和层析柱进行亲和纯化；得到的抗体再以交联有非磷酸化多肽的亲和层析柱吸收，去除与相应非磷酸化多肽有交叉反应的抗体成分；然后以KLH交联的亲和层析柱吸收，去除其中针对载体蛋白的抗体成分；最后用透析、浓缩等方法去除其中的非抗体蛋白成分。最终获得纯化的抗PT103磷酸化抗体(2.08mg/ml)，以50% glycerol/PBS 液保存。
[0034](4)再次以ELISA检测纯化后磷酸化抗体效价以及针对磷酸化目的多肽、非磷酸化多肽的识别性。首先分别包被人工合成的磷酸化、非磷酸化多肽抗原，加入不同比例稀释的免疫前、纯化前、纯化后抗血清孵育，洗涤后加入Ant1-Rabbit IgG Conj.P0D，孵育后洗涤TMB显色，反应终止测定0D450。结果显示:免疫前血清不能识别所有的多肽抗原；与未纯化抗血清相比，纯化后的抗体对磷酸化PT103多肽抗原均有较高的特异性反应(图7A)，同时与相应的非磷酸化T103多肽抗原呈现较低的交叉反应(图7B)。
[0035](5)ffestern blot鉴定:常规培养HeLa细胞,给予细胞0.5mM Arsenite应激处理Ih,以未处理组为对照组，以纯化后抗PT103磷酸化抗体(1:2000)进行Western blot检测。如图8所示，
(6)免疫荧光鉴定:常规培养HeLa细胞，给予细胞0.5mM Arsenite应激处理lh，以纯化后抗PT103磷酸化抗体(1:150)进行细胞免疫突光分析。如图9所示,HeLa细胞受到氧化应激时，以抗PT103磷酸化抗体可以检测到与内源性Tudor-SN相同的应激颗粒信号，表明其对应激磷酸化Tudor-SN识别的特异性。另外，抗pT103磷酸化抗体还可检测到细胞核内非核仁区的点状信号。
【权利要求】
1.一种针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备方法，其特征包括以下步骤: 第I步、首先确定Tudor-SN蛋白应激磷酸化位点； 第2步、合成包括T103磷酸化位点的半抗原多肽； 第3步、进行抗原免疫动物及血清获取； 第4步、最后纯化并鉴定T103特异性应激磷酸化抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第I步Tudor-SN蛋白应激磷酸化位点的确定方法是: 首先通过近红外双色激光成像发现受到外界环境氧化应激时人Tudor-SN蛋白，会发生磷酸化，然后通过质谱分析确定是在Tudor-SN蛋白103位点苏氨酸Thr发生转录后磷酸化修饰；人Tudor-SN蛋白的NCBI序列编号为NP_055205.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第2步所述的半抗原多肽，根据二级结构预测，T103周围分值较低，有可能在Native状态的蛋白中，不易露在分子表面；为尽量确保能够识别磷酸化位点，抗原多肽的长度设计为能够得到抗体的最小长度，即以T103为中心前后选择5个氨基酸；同时为了结合载体蛋白，多肽末端须连接半胱氨酸Cys。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第3步所述的抗原免疫动物:将第2步合成的T103位点磷酸化半抗原多肽分别与载体蛋白KLH偶联为完全抗原，以完全抗原与佐剂联合4次免疫SPF级新西兰大白兔。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第4步所述的纯化并鉴定T103特异性应激磷酸化抗体:分离第3步免疫的新西兰大白兔全血、收集抗血清，以ELISA测定抗血清针对目的多肽的效价，再以Dot blot和Western Blot实验确定抗血清是否能够特异性识别HeLa细胞内源性磷酸化Tudor-SN蛋白； 另外，同时合成相应的T103位点非磷酸化多肽抗原，用于纯化针对磷酸化多肽的特异性抗体；首先以交联有磷酸化多肽的亲和层析柱进行亲和纯化；以交联有非磷酸化多肽的亲和层析柱吸收，去除与相应非磷酸化多肽有交叉反应的抗体成分；然后以KLH交联的亲和层析柱吸收，去除其中针对载体蛋白的抗体成分；再用透析、浓缩方法去除其中的非抗体蛋白成分，最终获得纯化的2.08mg/ml抗pT103磷酸化抗体，以50% glycerol/PBS液保存； 再次以ELISA检测纯化后磷酸化抗体效价以及针对磷酸化目的多肽、非磷酸化多肽的识别性，最后以Western Blot及免疫突光实验进行抗体鉴定。
【文档编号】C07K16/40GK104277109SQ201310285195
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月9日 优先权日:2013年7月9日
【发明者】杨洁, 高星杰, 苏超, 张毅, 付雪, 何津岩 申请人:天津医科大学