一种抗人血管内皮生长因子人源化抗体可变区编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗体可变区编码基因；基于该编码基因，靶抗体的表达水平显著提高。体外生物学功能评价结果显示，基于该抗体可变区编码基因获得的靶抗体可以特异性识别人VEGF抗原；该抗体可以显著抑制肿瘤组织新生血管形成，从而抑制肿瘤生长。本发明还公开了上述抗体的制备方法。
【专利说明】-种抗人血管内皮生长因子人源化抗体可变区编码基因及 其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗人血管内皮生长因子人源化抗体可变区编码基因及其应用。通 过优化密码子，获得了一种抗人血管内皮生长因子人源化抗体的可变区编码基因。应用分 子生物学技术全合成了基因；经过表达、纯化，应用免疫学以及细胞生物学等实验对靶抗体 的表达量及生物学功能进行了评价。
【背景技术】
[0002] 人血管内皮生长因子（VEGF)是正常和异常血管新生的重要调节因子，在生理和 病理性血管新生中起重要作用。其主要作用机制是作为一种促内皮细胞分裂素，促进血管 内皮细胞分裂、增殖以及血管生成。VEGF参与了肿瘤发生和发展整个过程，肿瘤组织快速生 长，导致营养供应不足，在缺氧状态下，肿瘤细胞表达VEGF显著增加，VEGF局部浓度的升高 可以促进新生血管的形成，促进肿瘤的发生发展。研究表明，抑制VEGF活性可以有效阻断 肿瘤组织内血管生成，抑制肿瘤生长，具有重要的临床治疗意义。
[0003] 抗人血管内皮生长因子（VEGF)人源化抗体一阿瓦斯汀（Avastin)，化学名"贝伐 单抗"，可以特异性抑制能够刺激新血管形成的"血管内皮生长因子（VEGF) "，致使肿瘤组织 无法获得所需的血液、氧和其他养分而最终"饿死"，达到抗癌功效。800多名肿瘤已发生转 移的结肠\直肠癌患者进行的临床试验发现，同时接受阿瓦斯丁和化疗治疗的患者，与只 接受化疗的患者相比平均存活期要长5个月左右。美国FDA于2004年2月26日批准阿瓦 斯汀上市。目前阿瓦斯丁已经应用于多种癌症，包括直结肠癌、肺癌、胶质瘤、肾癌、和卵巢 癌。
[0004] 抗体临床应用剂量较大，每个疗程的用量可以达到lg。目前世界上抗体的产能远 低于需求量，抗体表达水平严重制约了抗体的应用。抗体的产量除了受制于培养规模、生 产工艺以及纯化工艺等因素外，从很大程度上依赖于抗体基因在哺乳动物细胞内的表达水 平。
[0005] 本研究在Avastin抗体的基础上，通过计算机辅助分析以及分子生物学技术，设 计获得了一种新的抗体可变区编码基因，其编码的抗体可变区氨基酸序列与Avastin相 同，但目标抗体在哺乳动物细胞中的表达水平远高于Avastin;进一步免疫学以及细胞生 物学等实验结果显示，新基因编码的抗体序列具有良好的生物学活性。
【发明内容】
[0006] 本发明公布了一组新的抗体可变区编码基因，序列表中序列1所示基因序列为轻 链可变区编码基因；序列2所示基因序列为重链可变区编码基因。
[0007] 本发明公布的抗体可变区编码基因的一个特征在于，该抗体在哺乳动物细胞中的 表达水平要明显优于Avast in。
[0008] 本发明公布的抗体可变区编码基因的一个特征是，所编码抗体可以特异性识别结 合靶抗原VEGF。
[0009] 本发明公布的抗体可变区编码基因的一个特征是，所编码抗体可以有效地血管内 皮细胞生长。
[0010] 本发明公布的抗体可变区编码基因的一个特征是，所编码抗体可以有效地抑制肿 瘤组织血管生成。
[0011] 本发明公布的抗体可变区编码基因的一个特征是，所编码抗体可以抑制肿瘤生 长。
[0012] 本发明公布的抗体可变区编码基因可用于生产治疗肿瘤药物的应用前景。
[0013] 本发明还公布了该抗体可变区编码基因制备方法，具体实施过程如下：
[0014] 1)利用计算机辅助分析，获得新抗体基因；
[0015] 2)利用全合成PCR技术合成抗体基因；
[0016] 3)抗体的表达及鉴定；
[0017] 4)抗体生物学活性鉴定。
[0018] 下面参照上述步骤详细描述实施过程。设计及制备本发明的方法仅仅是说明相关 方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
[0019] 1)利用计算机辅助分析，获得新抗体基因
[0020] 根据抗体氨基酸序列，选择在哺乳动物细胞中常用的密码子进行反向翻译，通过 生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在哺乳动物细胞的表达水平，获得相应 的抗体基因。
[0021] 2)利用全合成PCR技术合成抗体基因；
[0022] 根据获得的抗体基因。利用基因全合成PCR技术，设计相应的引物，通过重叠 PCR 的方法获得全长基因；克隆入克隆载体，进行序列测定。
[0023] 3)抗体的表达及鉴定
[0024] a)抗体的表达：将抗体基因构建至真核表达载体中，通过脂质体转染、电转等方 法瞬时转染真核表达细胞，培养足够长时候后收获上清，其中含有表达的目的抗体。
[0025] b)双夹心酶联免疫吸附实验（ELISA):以合适的抗体包被后作为捕获抗体，经过 封闭后，加入待测样品以及标准样品进行捕获反应；随后利用合适的酶标二抗进行显色反 应，测定样品中目的蛋白的含量。
[0026] c)SDS_PAGE :依据目的蛋白的大小配制合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，根据实验需 要制备还原电泳样品或非还原电泳样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白；经过考马斯 亮蓝染色后，确定目的蛋白分子量。
[0027] 4)抗VEGF抗体生物学活性鉴定
[0028] a)抗体识别活性鉴定：以合适浓度的VEGF包被，经过封闭后，加入待测样品以及 标准样品进行结合反应；随后利用合适的酶标二抗显色；测定样品中目标抗体识别抗原能 力。
[0029] b)抗体体外抑制血管内皮细胞增殖：分离培养血管内皮细胞，加入待测抗体后， 观测血管内皮细胞增殖生长情况。
[0030] c)抗体抑制肿瘤生长：利用肿瘤细胞系在裸鼠体内建立荷瘤动物模型，定期给予 目标抗体进行治疗，观察肿瘤生长速度。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1抗体可变区基因的电泳分析。其中泳道1为核酸标准分子量DL2000 ;泳道2 为轻链可变区基因；泳道3为重链可变区基因。
[0032] 图2抗体平均表达量比较。
[0033] 图3SDS-PAGE分析靶抗体的分子量。泳道1为靶抗体；泳道2为Avastin ;泳道3 为人IgG ;M表示标准蛋白分子量Marker。
[0034] 图4靶抗体特异性识别抗原分析
[0035] 图5靶抗体体外抑制血管内皮细胞增殖
[0036] 图6靶抗体体内抑制肿瘤生长
[0037] 实施例一抗VEGF抗体MIL60合理设计及基因合成
[0038] 一、材料：
[0039] 引物设计软件为biosun软件，引物由上海英骏生物技术有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase 为 TAKARA 公司产品；dNTP 为 TAKARA 公司产品；pGEM-T Easy vector system为Invitrogen公司产品；T4DNA连接酶为NEB公司产品；基因测序由北京诺赛基因 组研究中心有限公司完成；其他相关试剂均为市购。
[0040] 二、方法结果
[0041] 1、抗体MIL60的基因获得
[0042] 根据Avastin抗体的氨基酸序列，选择在哺乳动物细胞中使用频率较高的密码 子，进行反向翻译，通过生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在哺乳动物细胞 的表达水平，获得抗体的轻链可变区基因序列（序列1)及重链可变区基因序列（序列2)。 根据实施例2中构建抗体真核表达载体需要，在抗体轻链可变区基因5'端及3'端分别引 入EcoR V和Xho I酶切位点；在抗体重链链可变区基因5'端及3'端分别引入Pvu II和 BstE II酶切位点。
[0043] 2、引物设计
[0044] 根据基因全合成的原理，利用计算机辅助设计软件，设计引物，考虑引物的二级结 构、GC含量等相关参数。每条基因设计10条引物，分别编号为PI、P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9及P10,用于基因全合成。
[0045] 3、全基因合成
[0046] 1)引物合成后以无菌水稀释，方法如下：
[0047] a)取引物管12000RPM离心2mins，引物按IOOuM的浓度稀释，-20°C保存；
[0048] b)取少量引物P2?P9混合成终浓度为IOuM作为使用液；
[0049] c)取少量引物Pl和PlO混合稀释成终浓度为IOuM作为使用液P1/P10 ;
[0050] 2)基因全合成，米用Pyrobest DNApolymerase，方法如下：
[0051] a)取IuL P2?P9混合引物作为模板,配制如下Overlap PCR体系：
[0052]
【权利要求】
1. 一种抗体可变区编码基因，其中轻链可变区编码基因是序列1，重链可变区编码基 因是序列2。
2. 权利要求1所述抗体可变区编码基因在抗体制备中的应用。
【文档编号】C07K16/22GK104278038SQ201310283898
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2013年7月8日
【发明者】杨静, 吕明, 李新颖, 耿树生, 郎小玲, 冯健男, 谢波, 叶培, 黎燕, 沈倍奋 申请人:北京天广实生物技术股份有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所