温 度和C02浓度控制方面），细胞生长的事实。"合适的介质"是指包含血清的适于禽细胞的 常规培养介质。
[0048] 术语"血清"是指清除了它的细胞和凝血蛋白的血液液体。它是血液离心后获得的 上清液，不含有任何凝血抑制因子。这种液体包含大量营养素（氨基酸、维生素……）、可溶 性蛋白（抗体、白蛋白、细胞因子、生长因子等）、以及各种离子（钠、氯等）。在本申请中， 术语"血清"是指常规用于细胞培养的胎牛血清，和鸡血清。可使用二者的组合以使各血清 的优势结合。根据总体积的百分比添加血清至培养介质，即在一升的总介质中约100mL的 血清，表述为"10%的血清"浓度。
[0049] "低血清浓度或含量"的表述是指低于5 %的血清的百分比，具体为0. 5 %、1 %、 L 5%、2%、2· 5%、3%、或 4%的血清。
[0050] 根据本发明，术语"基质"是指衍生自细胞的细胞外基质（matrice)复合物。例 如，根据本发明的基质可以根据CorauWCoraux等人，2013)所述的程序，从鸡皮肤的原代 细胞制备；应注意的是，在这个公开中这种基质用于将鼠胚胎干细胞分化为表皮组织。这 种基质还可以衍生自对禽病毒受纳的细胞（基质细胞衍生的诱导活性-SDIA-(Kawasaki等 人，2000))或者进一步来自对病毒非受纳的任何类型的细胞。后者中包括以下非穷尽的列 举：鼠胚胎原代成纤维细胞（MEF)，目前用作通过丝裂霉素或辐射的作用失活后的营养层， 鼠成纤维细胞所建立的系，如允许ES细胞的维持的STO细胞（ATCC CRL 1503)，3T3-J2细 胞（Panacchia等人，2010)，骨髓基质细胞如PA6细胞（也称为MC3T3G2)，其允许神经外 胚层（neurectodermique)的分化（Correia等人，2008)，骨髓基质细胞如0P9细胞（ATCC CRL2749) (Nakano等人，1994)，其允许诱导淋巴细胞增殖分化，或者人类的或动物的角化细 胞或者对本领域技术人员有利的任何细胞类型。在本发明的范围内，本领域技术人员将能 够使基质的类型与分化的类型相适应。
[0051] 已知六亚甲基二乙酰胺（HMBA-化学式CH3CONH(CH2) 6NHCOCh3)分化因子对鼠细 胞的红白血病（6rythroleuc6mique)系的细胞分化作用，其中分化与增殖能力的丧失相关 (Marks和Rifkind，1989)。在被疱疹病毒感染的情况中，通过HMBA所进行的诱导，既赋予 细胞提高的受纳性，允许某些缺陷病毒的复制（Preston和McFarlane，1998)，又提高了转 录因子ΡΒΧ/Η0Χ的表达以促进病毒复制（Storlie等人，2006)。目前，HMBA以1至IOmM的 剂量作为鸡胚皮肤原代细胞的分化诱导试剂而使用，鸡胚皮肤的原代细胞用作马立克氏病 毒的复制的基底（Denesvre等人，2007)。
[0052] 术语"代"是指细胞的培养到达它们的支持物最高的占用水平。通过酶或蛋白 酶的混合物（胰蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胶原蛋白酶）的快速作用，细胞从它 们的支持物上分离，使细胞彼此分离，并促进它们从细胞外基质分离（"胰蛋白酶消化 (trypsination) "作用），并且，在培养介质中稀释后，接种于新的支持物进行数日的新培 养。通常地，从它们的支持物分离的细胞进行计数，随后以一定的细胞/cm 2的比例接种于 培养皿，培养皿使用含0. 1%牛明胶溶液的磷酸盐缓冲液（PBS)预处理至少20分钟，目的在 于给转移的细胞提供细胞外基质以促进它们对塑料支持物的粘附。
[0053] 以需要的时间实施不同的步骤a)、b)、c)和d)。具体地，本领域技术人员将以显 微镜的方式观察跟踪细胞的分化、它们的生长和它们的活力，以及可确定步骤是否继续延 长超过示出的最低时间。
[0054] 存在基质时，培养步骤a)将实施至少2天，优选地至少3天，尤其是3天，更优选 地3至5天。
[0055] 在低血清浓度介质中的培养步骤b)将实施至少2天，优选地3天。
[0056] 在含HMBA的介质中的培养步骤c)将持续至少2天，优选地3天。
[0057] 在低血清浓度介质中的培养步骤d)将实施至少10天，优选地15天。
[0058] 优选地，在b)、c)和d)各步骤后，所述的方法进一步包括用于在合适的生长介质 中培养细胞的步骤，具体在含高于5%血清的介质中，以及优选地约10%血清。
[0059] 最后步骤e)相当于获得病毒的复制受纳的细胞系，根据情况，随后其可用于病毒 的复制，或者可根据本领域技术人员熟知的技术冷冻。
[0060] 所述的方法可详细地如下示出：
[0061] a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞4天；
[0062] b)在低血清浓度介质中培养细胞3天；
[0063] c)在含10%血清的介质中培养细胞10天；
[0064] d)在含1至IOmM的HMBA(六亚甲基二乙酰胺）的低血清浓度介质中培养细胞3 天；
[0065] e)在低血清浓度介质中培养细胞15天；
[0066] f)培养或冷冻允许禽病毒的复制的禽细胞系。
[0067] 以更为详细的方式，该方法可包括以下步骤：
[0068] a)存在基质时，培养禽胚胎干细胞4天；
[0069] b)在低血清浓度介质中培养细胞3天；
[0070] c)在含10%血清的介质中培养细胞10天，并通过胰蛋白酶消化传代；
[0071] d)在含1至IOmM的HMBA(六亚甲基二乙酰胺）的低血清浓度介质中培养细胞3 天；
[0072] e)通过胰蛋白酶消化将细胞在含10%血清的介质中传代3天；
[0073] f)在低血清浓度介质中培养细胞15天；
[0074] g)通过胰蛋白酶消化将细胞在含10%血清的介质中传代12天；
[0075] h)培养或冷冻禽细胞系，所述的细胞系在合适的培养介质中在至少60代具有稳 定的表型，且允许禽病毒的复制。
[0076] 如上所述的本发明的方法的全部步骤a)至d)、a)至f)和a)至h)可以任何顺序 实施，有利地，它们以从a)至d)、从a)至f)和从a)至h)的顺序实施。例如当步骤a)至 d)以这种顺序实施时，本发明的方法至少包括以下步骤：
[0077] A)存在基质时，培养禽胚胎干细胞至少3天；
[0078] B)在低血清浓度介质中培养来自步骤A)的细胞至少2天；
[0079] C)在含1至IOmM的六亚甲基二乙酰胺（HMBA)的低血清浓度介质中培养来自步骤 B)的细胞至少两天；
[0080] D)在低血清浓度介质中培养来自步骤C)的细胞至少10天；
[0081] E)培养来自步骤D)的细胞，或冷冻允许禽病毒的复制的禽细胞系。
[0082] 本方法的产物包含对禽病毒的复制受纳的细胞，所述的细胞在合适的培养介质 中，在至少60代保持相同的表型，并且不再表达ES细胞的特征性标志物cPOUV和NANOG。
[0083] 这些细胞命名为"ESCDL-1"，代表"胚胎干细胞衍生的系UEmbryonic Stem ￡ell Derived Line 丄）"。ESCDL-1 为成纤维细胞样（aspect fibroblastique)的贴壁细胞，BP与 原代成纤维细胞相比，更为分散（6tal6eS)且较不伸展的（6tir6 eS)。通过它们的形态学、 它们的生长特征、以及ES细胞的标志物的表达消失与ES细胞的系相区分。
[0084] 这个最后的特征还提供了将它们与现有技术的细胞相区分的可能性，例如EB66 细胞（见EP 2572 728)或者DF1、LMH、CEF和cES细胞（BP25)(见本申请的实施例2)，它 们保持了 ES细胞的标志物的表达。因此，本发明的ES⑶L - 1细胞不表达以下标志物的至 少一种：cP0UV/0CT4、NAN0G、SSEAl、EMAl、IXFl、KRT8 和 KRT19。更优选地，它们不表达这些 标志物中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或者至少六种。甚至更优选地，它们不 表达这些标志物中的任一个。
[0085] 此外，本发明的ES⑶L - 1细胞强表达0LFM3基因，以及与原代成纤维细胞中所观 察到的水平相当的WISP1、THBS2和EDN2基因。
[0086] 本发明的细胞与ES细胞相比，具有低端粒酶活性。ESCDLl细胞是未转化的细胞， 并且建立成系，所述的细胞增殖但不致瘤，与以化学方法或通过外源永生化试剂的作用所 建立的系不同。ESCDL-I细胞的增殖能力（20%的细胞在S期），高于鸡胚皮肤原代细胞 (CEPP) (3%的细胞在S期）。此外，值得注意的是ES⑶L-I细胞对凋亡诱导剂敏感，并且在 生长因子耗尽的或者存在自噬诱导剂的介质中，具有强诱导自噬过程的倾向。
[0087] 根据本发明的方法提供了获得对于多种禽病毒（尤其是疱疹病毒、痘病毒、冠状 病毒、双RNA病毒、呼肠弧病毒（R6o)和轮状病毒（Rotavirus)的复制受纳的细胞系的可能 性，以及尤其用于感染性黏液囊炎（IBDV)的中介的马立克氏病毒和双RNA病毒。
[0088] 根据本发明的一个优选的方面，起始或原始禽胚胎干细胞是鸡细胞。优选地，ES细 胞来自具有杂合子Cou-nu基因型（Na/na)的鸡。
[0089] 更优选地，原始禽胚胎干细胞是X期至XIV期的胚盘（blastoderme)分离细胞（根 据Eyal Giladi和Kovak，1976)。与现有技术中的某些细胞不同，根据本发明的细胞系来源 于胚胎，因其衍生于胚胎干细胞而未孵育，它们本身从这些未孵育胚盘细胞的培养获得。
[0090] 这些原始禽胚胎干细胞表达多种标志物基因，如在专利申请WO 2007/110343中 所示的那些，以及特别是标志物基因 cPOUV和NAN0G。
[0091] 根据本发明一个优选的方面，所获得的禽细胞系从它建立起，在至少60次连续的 传代具有稳定的表型，优选地至少70次传代，更优选地至少80次传代。
[0092] 优选地，根据本发明的禽细胞的表型特征更具体的为以下的：
[0093] 成纤维细胞/间叶细胞型的形态；
[0094] 表达⑶44、整合素 β 1、和胶原蛋白1 ;
[0095] 不表达ES细胞的标志物，尤其包括cPOUV和NAN0G、KRT19和KRT8,但强表达 0LFM3基因，以及以与原代成纤维细胞中所观察到的相当的水平持续表达WISP1、THBS2和 EDN2基因；以及
[0096] 对马立克氏病毒和禽双RNA病毒的复制的受纳性。
[0097] 间叶细胞成纤维细胞是指这样的一种细胞，其具有与结缔组织的未充分分化（peu diff6renci6es)细胞相似的形态，尤其具有长伸展（longs prolongements)和在细胞的中 央卵形的细胞核。
[0098] 根据本发明的另一方面，所获得的禽细胞系可被基因修饰以表达感兴趣的蛋白。 感兴趣的蛋白可以是"报告"蛋白（荧光蛋白；酶例如不同形式的荧光素酶或磷酸酶……）、 用于修饰基因组的酶（重组酶）、可作为某些基因已被删除的病毒的互补干预的自体的或 异源的病毒蛋白、或者过表达可对病毒的复制具有影响的其它细胞蛋白。
[0099] 如实施例中所示，即使如上述的基因修饰，根据本发明的禽细胞系保留了它对禽 病毒的受纳性。
[0100] 本发明还涉及可通过上述的方法获得的细胞系，即在体外允许禽病毒的复制的未 转化的细胞系，尤其是马立克氏病毒和双RNA病毒。
[0101] 具体地，该细胞系表达以下标志物：⑶44+、整合素 β 1以及胶原蛋白1。在另一 方面，它不再表达被抗体IXFl、MC-480 (SSEAl)和EM-I所识别的抗原，同时后者被原始胚 胎干细胞所表达。它们不再表达基因 cP0UV/0CT4、NAN0G、KRT19和KRT8,但是强表达基因 0LFM3,以及与原代成纤维细胞中所观察到的水平相当的基因 WISP1、THBS2和EDN2 (在图中 等于1)。在成纤维细胞DFl中，这些基因的水平低10至100倍（图5)。以同样的方法，肝 细胞LMH完全不具有这些标志物相同的表达谱。本发明还涉及上述的细胞系作为基底用于 禽病毒的体外生产的用途。
[0102] 本发明还涉及上述的细胞系用于禽病毒的滴定以及因此确定病毒感染的严重性 的用途。
[0103] 最后，本发明还涉及一种用于体外制备疫苗制剂的方法，其包括培养上述的系，以 及用至少一种禽病毒感染所述的系。也就是说，本发明涉及用于体外制备疫苗制剂的方法， 其至少包括以下步骤：
[0104] A)存