用于靶向o-连接的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶和促进伤口愈合的组合物和方法
【专利说明】用于靶向ο-连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和促进伤口 愈合的组合物和方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月11日提交的序列号为61/775, 937的美国临时专利申请 的优先权，其全部公开内容通过引用的方式并入本文。
[0003] 政府利益
[0004] 目前公开的主题是根据国立卫生研究院给予的ROl AI49427号基金在美国政府的 支持下进行的。美国政府具有下述发明的一定权利。
技术领域
[0005] 目前公开的主题涉及用于靶向UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β -N-乙酰氨基葡萄 糖转移酶（OGT)的化合物、组合物和方法。目前公开的主题还涉及用于促进伤口愈合的化 合物、组合物和方法。
【背景技术】
[0006] 慢性伤口是影响美国650万患者以及每年花费约250亿美元来治疗的重大患病根 源（1)。患有糖尿病的患者发展慢性不愈伤口的风险增加。各种因素可能导致糖尿病患者 易于发展慢性伤口，包括神经病变、血管病变以及引起血糖水平升高的潜在内分泌功能障 碍。
[0007] 如同磷酸化作用，胞内蛋白0-糖基化是调节胞内蛋白包括酶、转录因子、结构 蛋白和细胞粘着蛋白的常见动态翻译后修饰。丝氨酸和苏氨酸的N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc)修饰由酶UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（O-GIcNAc 转移酶，0GT)催化；而GlcNAc由O-GlcNAc-选择性N-乙酰基-β -D-氨基葡萄糖苷酶 (GlcNAc酶，0GA)除去（在⑵有评论）。
[0008] 高血糖，过量葡萄糖进入氨基葡萄糖途径，为OGT提供过量UDP-GlcNAc来修饰胞 内蛋白（3)。过量葡萄糖被转化为氨基葡萄糖，其最终被转化为UDP-N-乙酰氨基葡萄糖 (UDP-GlcNAc)，即用于胞内蛋白的OGT修饰的供体底物。因此，高血糖症与各种蛋白的0-糖 基化增加有关（3-7)。高血糖状态包括糖尿病中观察到的胞内蛋白的GIcNAc修饰增加被 认为有助于与糖尿病有关的一些病理。例如，（i)胰腺细胞具有高水平的0GT，且对细胞内 O-GIcNAc修饰中的改变有敏感性，以及（ii)肌肉和脂肪组织中OGT的超表达引起转基因 小鼠模型的糖尿病（8)。糖尿病组织包括人类糖尿病组织（9)和高血糖动物模型（4)中观 察到胞内蛋白的GIcNAc修饰增加。用于细胞内0-糖基化在糖尿病中的病理作用的其它支 持来自证明引起胞内蛋白0-糖基化增加的糖尿病和突变的遗传相关性的研究；导致编码 OGA的基因提前终止的突变与对墨西哥裔美国人口成年发病II型糖尿病的遗传易感性相 关（10)。OGA从胞内蛋白除去GlcNAc，且鉴别的OGA突变导致蛋白0-糖基化水平升高。
[0009] 伤口愈合期间，伤口周边处的角质细胞必须降低对后边缘处的相邻细胞的粘附， 以允许离开边缘并移动到伤口中（11)。来自组的之前数据证明增加的〇-糖基化部分通过 提高包括斑珠蛋白的细胞桥粒组分的翻译后稳定性来使细胞与细胞的粘附稳定（12)。
[0010] 发明概述
[0011] 简言之，本发明涉及用于靶向OGT和/或促进伤口愈合的化合物、组合物和方法。
[0012] 在本发明的某些实施方案中，提供了分离的反义OGT多核苷酸，其中多核苷酸的 长度为18-30个核苷酸，且进一步地，其中分离的反义OGT多核苷酸包含与OGT mRNA杂交的 序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸可具有如SEQ ID N0:3所示的序列或与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173所示的18-30核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，分离的 多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGT mRNA杂交。
[0013] 在一些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含（i)反义OGT多核苷酸和 (ii)药学上可接受的载体，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸且具有与OGT mRNA 杂交的序列。在一些实施方案中，反义OGT多核苷酸是第一伤口愈合剂和/或第一抗OGT 剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含第二伤口愈合剂和/或第二抗OGT剂。
[0014] 在一些实施方案中，药物组合物的多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGT mRNA 杂交。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是凝胶、藻酸盐、水凝胶或基于纤维素的载 体，基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维 素及其混合物。而且在某些实施方案中，药学上可接受的载体包含醇、聚乙二醇-聚丙二醇 共聚物、;Pluronie.⑩F-127和/或其混合物。
[0015] 在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173的编码区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。在一些实施方 案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸具有与SEQ ID NO: 173的调控区中示 出的18-30核苷酸序列互补的序列。而且在某些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物 组合物的多核苷酸具有与SEQ ID NO: 173的内含子区中示出的18-30核苷酸序列互补的序 列。
[0016] 在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:4-168中任一个的序列。
[0017] 在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列或与SEQ ID NO: 3的18-30 连续核苷酸片段对应的序列，其中该序列包含选自SEQ ID N0:4-168中任一个的序列。而 且在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含SEQ ID N0:4-168 中任一个的片段，还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQ ID N0:3 的18-30连续核苷酸片段或对应于与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173中示出的18-30核苷 酸序列互补的18-30核苷酸分子。
[0018] 在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于局部施用和/或局部注射。在某 些实施方案中，在伤口敷料中配制该药物组合物。而且在一些实施方案中，在胶态凝胶敷 料中配制该药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于缓释（sustained release)，用于缓慢释放（slow release)，用于延长释放（extended release)和/或用于 控释（controlled release)。而且在一些实施方案中，该药物组合物是液体、霜剂、软膏、乳 剂、洗剂、喷剂、药膏（salve)、泡沫剂和/或涂料（paint)。
[0019] 在一些实施方案中，对有伤口的个体施用分离的多核苷酸和/或药物组合物的多 核苷酸。在一些实施方案中，所述伤口未以期望的速度愈合。在某些实施方案中，个体的伤 口延迟，难以愈合，和/或是慢性的，而且仍然在其它实施方案中，伤口的特征至少部分是 OGT的表达增加。
[0020] 在一些实施方案中，个体是糖尿病患者。在某些实施方案中，个体有（i)l型糖尿 病，（ii) 2型糖尿病，（iii)高于正常血糖水平和/或（iv)胰岛素抗性受体。在一些实施方 案中，个体不是糖尿病患者。
[0021] 在目前公开的主题的一些实施方案中，提供了抑制细胞中OGT的方法，其包括对 细胞施用抗OGT剂，其中抗OGT剂选自（i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为 18-30个核苷酸且具有与OGT mRNA杂交的序列；（ii)抑制OGT表达的双链RNA分子；以及 (iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。在一些实施方案中，所述细胞包括胰岛素抗性受 体，在某些实施方案中，细胞在个体中。
[0022] 在目前公开的主题的某些实施方案中，提供了治疗有伤口的个体的方法，其包括 对个体施用抗OGT剂，其中该抗OGT剂选自（i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长 度为18-30个核苷酸且具有与OGT mRNA杂交的序列；（ii)抑制OGT表达的双链RNA分子； 以及（iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。
[0023] 在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGT mRNA杂交。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO: 3所示的序 列，在某些实施方案中，所述18-30个核苷酸的序列对应于SEQ ID N0:3的18-30连续核苷 酸片段，以及在某些实施方案中，反义OGT多核苷酸包含选自SEQ ID NO: 4-168中任一个的 序列。
[0024] 在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。
[0025] 在所公开方法的一些实施方案中，所述多核苷酸是反义OGT多核苷酸，且在某些 实施方案中，所述多核苷酸是寡脱氧核苷酸。
[0026] 在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸包含：（i)与SEQ ID NO: 173的调 控区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列，（ii)与SEQ ID NO: 173的内含子区中示出的 18-30核苷酸序列互补的序列；和/或（iii)与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173中示出的 18-30核苷酸序列互补的序列或对应于SEQ ID NO:3的18-30连续核苷酸片段的序列，其中 所述序列包含选自SEQ ID NO:4-168中任一个的序列。
[0027] 在所公开方法的一些实施方案中，所述多核苷酸的序列包含SEQ ID NO:4-168中 任一个的片段，还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQ ID NO:3 的18-30连续核苷酸片段，或对应于与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 173中示出的18-30核 苷酸序列互补的18-30核苷酸分子。
[0028] 在所公开方法的一些实施方案中，分离的双链RNA分子包括包含选自SEQ ID NO: 169-171中的序列且包括约11-27个核苷酸的第一链。在该方法的某些实施方案中，小 发夹RNA包含SEQ ID NO: 172的序列。
[0029] 在目前公开的主题的一些实施方案中，在药物组合物中提供抗OGT剂。而且在一 些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体包含例 如凝胶、醇、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、Pluronic? F-127、藻酸盐、水凝胶和/或基于纤 维素的载体，基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基 甲基纤维素及其混合物。
[0030] 在本发明方法的一些实施方案中，药物组合物被配制成用于和/或通过局部施 用、局部注射、伤口敷料和/或胶态凝胶敷料来给药。在所公开方法的某些实施方案中，药 物组合物被配制用于缓释、缓慢释放、延长释放和/或控释，以及进一步地，该组合物的形 式为液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏、泡沫剂和/或涂料。
[0031] 在所公开方法的一些实施方案中，药物组合物是局部地和/或通过局部注射给 药。在某些实施方案中，施用所述药物组合物或药剂以治疗有伤口的个体，且在一些实施方 案中，个体的伤口延迟，难以愈合，未以期望的速度愈合和/或是慢性的。在某些实施方案 中，伤口的特征至少部分是OGT的表达增加。
[0032] 在本发明方法的一些实施方案中，（i)个体是糖尿病患者，（ii)个体患有1型糖尿 病，（iii)个体患有2型糖尿病，（iv)个体的血糖水平高于正常血糖水平，（V)个体有胰岛 素抗性受体，和/或（vi)个体不是糖尿病患者。
[0033] 在一些实施方案中，所公开方法还包括对细胞或对个体施用第二伤口愈合剂和/ 或第二抗OGT剂的步骤。
[0034] 要理解的是，前面的概述和下面的详述都说明了本发明的实施方案中，且意在提 供用于理解如所声明的发明的性质和特征的概述或构架。本说明书用来解释所声明主题的 原理和操作，并阐述使用本发明原理的示例性实施方案。一旦阅读下面的公开内容并考虑 附图，本发明的其它和进一步的特征和优点对于本领域技术人员会是十分显而易见的。
【附图说明】
[0035] 图1.高血糖增加 O-GlcNAc糖基化并阻碍人类角质细胞的伤口愈合。在用补充葡 萄糖到指示的最终浓度的培养基中培养HaCaT细胞。通过SDS-PAGE和免疫印迹法，使用识 别O-GIcNAc修饰的RL2抗体并使用GAPDH作为负载对照分析细胞裂解物（图1)。相对于 GAPDH负载对照将RL2信号定量（图1B)。在有指示的葡萄糖浓度的DMEM中孵育人角质细 胞单层。用移液管吸头对细胞进行划痕，并于Oh (小时）和16h时拍摄显微照片（图1C)。 然后使用图像分析软件测量伤口大小。所有条件的N = 11 (图1D)。误差线反映均值标准误 差。*表示与正常葡萄糖水平（5. 5mM)相比P值〈0.07，**表示与正常葡萄糖水平（5. 5mM) 相比 P 值〈0.0005。25mM 和 IOOmM 之间的 P 值〈0.01。
[0036] 图2. O-GIcNAc途径中的RNA干扰（RNAi)影响人角质细胞中的伤口愈合速度。此 外，使用shRNA进行的OCT抑制（knockdown)使伤口愈合加速。用靶向OGT、OGA和GFP (对 照）的shRNA稳定转导HaCaT细胞，并使之生长至融合。然后通过探测O-GlcNAc修饰（RL2)、 OGT蛋白和肌动蛋白（负载对照）的免疫印迹法分析细胞裂解物（图2A)。相较于肌动蛋 白信号，将RL2反应性量化（图2B)。转导细胞在有25mM葡萄糖的生长培养基中生长至融 合，并划痕以引入伤口。图2C中示出在Oh和12h处获得的代表性显微照片，而图2D中示 出对裸露伤口区域的定量。在划痕伤口分析中，对于未处理细胞，N= 18;对于shGFP，N = 10 ;对于shOGT，N = 8 ;以及对于shOGA，N = 14。误差线反映均值的标准误差（SEM)。星号 (*)表示P值〈0.05的结果。
[0037] 图3.特定OGT抑制使人角质细胞伤口愈合加速。用IOOnM抗OGT的siRNA或乱序 对照siRNA (scrambled control siRNA)转染HaCaT细胞。对融合培养物的细胞裂解物进 行探测RL2、抗OGT和抗GAPDH反应性的免疫印迹（图3A)和定量（图3B)。用siRNA转染 60小时后，将融合细胞划痕，并获得在0h、16h和26h处的显微照片（图3C)。使用图像分 析软件对裸露伤口区域进行定量（图3D)。对于未转染细胞，N = 7 ;对于对照siRNA，N = 7 ;以及对于OGT siRNA，N = 6。误差线反映标准误差。星号表示相较于对照，p值〈0. 05。
[0038] 图4. OGT转染的角质细胞中细胞与细胞的粘附提高。图4A显示分散酶分析的结 果，其中用分散酶处理后，对照（Con)和OGT (OGT)转染的角质细胞的融合单层培养物飘离 板，并通过来回摇晃培养物10次受到剪切力作用。由OGT细胞生成较少片段，这表示相 较于对照显示出较大的细胞与细胞粘附。图4B和图4C显示对照和超表达OGT的角质细胞 的电子显微照片，其中图4B提供俯视图且图4C提供正交视图，各图都示出与对照角质细 胞相比，超表达OGT的角质细胞的细胞膜更紧密地关联。
[0039] 图5.与对照小鼠相比，在糖尿病小鼠的皮肤中观察到胞内蛋白的0-糖基化增加。 图5显示使用GIcNAc特异性单克隆抗体RL2的免疫印迹分析，其表明与野生型对照相比， 在糖尿病小鼠的表皮提取物中GIcNAc修饰增加。星号表示对照中未观察到而糖尿病皮肤 中检测到的蛋白质的额外GlcNAc修饰。箭头绘出相对于对照在糖尿病皮肤中未改变的蛋 白的GIcNAc修饰并用作负载对照（+，阳极；-，阴极）。
[0040] 图6.胞内0-糖基化增加使伤口愈合延迟。通过划痕使对照（Con)和OGT(OGT) 转染的角质细胞的融合单层培养物受到损伤，并确定伤口闭合的时间。如图6中所示，对照 角质细胞用16小时愈合伤口；而OGT超表达的角质细胞在16小时时未能闭合伤口。
[0041 ] 图7.使用OGT特异性shRNA抑制OGT活性促进角质细胞伤口愈合和在单层划痕 试验中逆转葡萄糖对伤口愈合的剂量依赖型抑制。用浓度递增的葡萄糖处理人HaCat对照 (较暗色柱）和使用OGT特异性shRNA (hOGT，浅色条）抑制OGT的HaCat角质细胞的融合 培养物，通过划痕使之受到损伤，以及在受损伤19小时后测量愈合伤口的大小（每组η = 12)，如图7Α中所示。如图7Α中的划痕试验，对于非转导对照HaCat角质细胞和GFP特异 性shRNA(shGFP)转导对照，与shOGT转导的HaCat角质细胞相比（每组η = 12)，在图7Β 中示出数据。
[0042] 图8. OGT的shRNA抑制减少角质细胞胞内蛋白0-糖基化；而OGA抑制增加蛋白 〇-糖基化。使用靶向GFP (对照）、OGT和OGA的shRNA稳定转染的HaCaT细胞生长至融合。 然后用抗⑴O-GIcNAc修饰（RL2)、（ii)OGT蛋白和（iii)GAPDH(负载对照）的抗体通过免 疫印迹分析细胞裂解物，如图8A和图8B中所示。如所示的，OGT的基因抑制减少O-GlcNAc 蛋白修饰；而OGA的基因抑制增加 O-GlcNAc蛋白修饰。
[0043] 图9.当局部施用于伤口时，OGT反义寡脱氧核苷酸使测试小鼠皮肤中的OGT蛋 白水平和O-GlcNAC修饰下调。在受损伤后t = 0和t = 24小时时，将50 μ I P丨uronic? F-127凝胶中的IOnM OGT反义寡脱氧核苷酸局部施用于WT小鼠的全层皮肤伤口。在受损伤 后48小时时，收集用OGT反义ODN或溶媒对照（vehicle control)处理的小鼠的损伤周围 皮肤。通过SDSPAGE分离皮肤提取物，并用抗O-GIcNAc修饰（RL2)、0GT蛋白或GAPDH(用 作负载对照）的抗体，通过免疫印迹来探测，如图9中所示。
[0044] 发明详述
[0045] 本文中列出了目前公开的主题的一个或多个实施方案的详细信息。研究本文中提 供的信息后，本文中描述的实施方案的修改和其它实施方案对于本领域技术人员将是显而 易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体详细信息主要提供用 于清楚理解，而不会由其理解为是限制性的。如有冲突，以本申请的说明书包括定义为准。
[0046] 通过解释本发明的方式提供各实施例，且对其没有限制性。事实上，对本领域技术 人员来说在不偏离本发明的范围的情况下，对本发明的教导可以进行各种修改和变化是显 而易见的。例如，作为一个实施方案的一部分而说明或描述的特征可以与另一个实施方案 一起使用以得到又一实施方案。
[0047] 除非所涉及上下文中另有说明或明确相反的暗示，所有涉及的本发明单数特征或 限制应包括相应的复数特征或限制，反之亦然。
[0048] 除