一种基于zna引物的str分型试剂盒的制作方法

一种基于zna引物的str分型试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及一种用于微量降解生物样本的miniSTR分型试剂盒。该试剂盒采用ZNA引物替代传统的DNA引物，同时复合扩增12个miniSTR基因座和一个性别识别基因座：D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D3S3053、D17S1301、D21S11和Amelogenin。本发明、将miniSTR分型技术和ZNA引物扩增相结合，提供的STR分型试剂盒适合于中国人群，且适用于少数民族人群，适用于微量以及高度降解生物样本，分型的灵敏度和精确性大大提高。
【技术领域】
[0001]本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及一种用于微量降解生物样本miniSTR 分型试剂盒。 一种基于ZNA引物的STR分型试剂盒
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（short tandem repeat，STR)又被称为微卫星DNA (microsatellite DNA)，是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记，其核心序列一般 由2~6个碱基组成，核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等位基 因。由于其重复单位较为简单，也被称为简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs)。 由于核心单位数目的变化，使STR的长度在人群中变异较大，构成了STR的遗传多态性，进而 成为STR分析技术的生物学基础。STR序列绝大多数分布于基因组非编码区，核心重复序列 呈串联排列，扩增片段一般在400bp以下，目前在法医个人识别及亲子鉴定中得到了广泛应 用。然而在实际应用中，由于物理、化学以及天气等环境因素的影响，检材中DNA分子易发生 降解、断裂，经常得不到完整的DNA分型甚至分型失败，这就给法医学分析带来了很大的困 难。为了解决上述降解生物样本的分型问题，产生了一种新的STR分型技术:在设计引物时， 使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR扩增的产物就会比STR基因座更短一些， 艮PminiSTR技术。
[0003] 虽然miniSTR分型技术在对降解生物样本的分析中获得了很大的成功，但其应用 仍然存在一定的局限性。例如，由于受限于STR核心重复序列的长度，miniSTR的扩增片段长 度不可能无限的减小，这就令不同基因座的miniSTR扩增片段分布更为集中，各个基因座的 等位基因片段长度范围相互重叠的机率比普通STR要高得多。因此基于miniSTR原理设计的 荧光标记复合扩增试剂盒不可能同时容纳很多基因座，一次检验所提供的信息量较少，必 须增加复合扩增的次数。此外，当DNA模板数量很少或者样本扩增产量很低的时候，miniSTR 的使用就会受到限制。另外，PCR扩增产物的长度小于150bp的时候，剩余在引物上的染料分 子会对电泳图谱产生影响。而在实际的法医学检案工作中，由于环境因素等影响，使用的生 物样本通常既是降解样本，同时往往也是低拷贝数（( Low copy number，LCN)样本，即DNA含 量少于IOOpg，相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。
[0004] 为提高LCN生物样本的法医学STR分型的灵敏度和成功率，通常采用两种策略。一 种是增加 PCR反应的循环次数，提高STR基因座扩增成功率和产物量，而后进行DNA分析。虽 然增加 PCR循环数能够提高LCN样本的STR成功检出率，但存在以下风险:实验室环境和操作 污染对样本STR分型的干扰作用变得更加明显；非特异产物大量积累，分型精确性大幅下 降；分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的现象。另一种策略是首先进行LCN 样本的全基因组扩增，获取足量的DNA模板，而后进行STR分型。这种策略也存在一些实际应 用的缺陷:发生等位基因丢失;针对特定类型检材的全基因组扩增技术尚不明确等。
[0005] 法庭科学STR基因组的选取需要考虑众多因素，其中首要因素是STR基因座的个体 识别力（Power of discrimination，!^)。美国联邦调查局（FBI)在1997年选定了 13个核心 STR基因座用于建立DNA联合索引系统（CODIS) : CSFlPO、D3S12358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21Sll、FGA、HUMTH01、TP0X、Vwa。为进一步增强区分 度，FBI随后又在CODIS数据库中加入了基因座D2S1338和D19S433。目前常用的商品化STR复 合扩增试剂盒，如ABI公司的Identifi ler?以及Promega公司的'PowerPlex 16?等，均包括 上述13个核心STR基因座。然而STR基因座的多态性在不同种族和人群中存在明显的差异， 上述STR基因座的选取主要是基于西方人群所选定的，在实际应用中并不一定适用于中国 人群。
[0006] 为解决上述问题，中国专利申请200410096613公开了一种荧光标记STR基因座的 复合扩增检验系统，该系统包括14个STR基因座。该系统使用的DNA引物能够将相应基因座 扩增产物控制在400个碱基(bp)的范围内，灵敏度达到0.125ng。该系统虽然提供了适合中 国人群的STR基因座，但是由于其检测灵敏度的限制，难以实现对LCN样本的检测。
[0007] 又如，中国专利申请201410076618公开了一种21个短串联重复序列的复合扩增体 系及试剂盒，其采用的位点组合，均为COD IS基因座，0.1 ng的DNA模板均可检测获得完整的 基因分型图谱。虽然其包含的STR基因座相对较多，但对中国不同人群的适用性较弱；并且 当模板量低于〇. Ing时，分型效果不佳。
[0008] 综上所述，虽然STR分型技术在法医DNA检验分析领域中有重要意义，然而目前建 立起的商品化扩增体系或试剂盒多数是针对西方人群，在实际使用中并不适合中国人群； 少数适合中国人群的检测体系，一方面无法同时满足对微量(或低拷贝数）以及高度降解生 物样本的检测，另一方面对各类人群的普遍适用性较差。

【发明内容】

[0009] 术语:除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术 领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0010]本发明中的术语"dNTPs"指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核苷酸的混合 物;本发明中的术语"ddH20"指双蒸水。
[0011] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于ZNA引物的miniSTR分型试剂盒，以相对 较少的STR数目实现分型效能更强、更适用于中国各类人群、精确性更高、更适用于微量和 高度降解生物样本。
[0012] 为解决上述问题，本发明提供了一组mini STR基因座，所述的一组STR基因座包含 以下12个miniSTR基因座：
[0013] D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、 D4S2364、D3S3053、D17S1301和D21S11。
[0014] 上述12个miniSTR基因座中D21S11为CODIS系统中13个核心基因座之一，目前市场 上常用的STR分型试剂盒大多是在CODIS系统的13个核心基因座的基础上增加或删除其中 的几个基因座。因此一定程度上并不适用于中国人群。本发明仅保留了 1个CODIS系统的基 因座，采用了大量非⑶DIS系统的基因座，上述11个非⑶DIS系统的基因座满足法医学的相 关要求，例如基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡、基因座之间不存在连锁关系，扩增 效率高、突变率低及侧翼序列不存在突变热点等。
[0015] 此外，在使用东北、西北、西南、中南和华东汉族人群以及藏族、蒙古族、土家族、撒 拉族、哈萨克、白族、维族、俄罗斯族、朝鲜族等少数民族群体样本对上述除了 D21S11之外的 11个miniSTR基因座进行多态性验证。并按照法医学DNA检验对STR基因座的要求，对上述基 因座的以下法医学参数:个体识别力(DP)、非父排除率(EPP)、多态性信息含量(PIC)、预期 杂合度(HE)、观察杂合度(HO)进行统计分析后，发现上述11个miniSTR基因座不仅在汉族人 群中具有高多态性，在藏族、蒙古族、土家族、撒拉族、哈萨克、白族、维族、俄罗斯族、朝鲜族 等少数民族群体中也具有高多态性；同时具有非常高的个体识别力和非父排除率，因此更 加适合于中国人群，包括以上少数民族人群。
[0016] 11个miniSTR基因座的法医学参数如下所示：
[0019] 本发明还提供了一种miniSTR分型试剂盒，所述的miniSTR分型试剂盒包括用于扩 增上述 12 个 miniSTR 基因座：D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、 0354529、025441、0452364、0353053、01751301和021511的12对2嫩引物。
[0020]本发明所述的miniSTR分型试剂盒还包括用于扩增性别识别基因座Amelogenin的 1对ZNA引物。
[0021] 本发明所述的miniSTR分型试剂盒同时复合扩增上述12个miniSTR基因座和 Amelogenin基因座。
[0022] Zip Nucleic Acids，简称ZNA，是一种新型的寡核苷酸衍生物，是通过在DNA分子 的核苷酸上偶联精胺衍生物Z unit而获得的寡核苷酸衍生物。Z unit的偶联部位既可以在 DNA分子5 '或者3 '末端的核苷酸上，也可以位于中间部位的核苷酸上。与DNA分子一样，ZNA 分子也可用作PCR引物，且具有相同的严格碱基互补配对选择性。
[0023] 本发明所述的用于扩增 miniSTR 基因座 D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、 D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D3S3053、D17S1301和D21S11，以及 Amelogenin基因座的13对ZNA引物，是以扩增这13个基因座的DNA引物为基础，在其核酸序 列中的特定位置核苷酸上偶联Z unit而获得的ZNA序列。
[0024] 本发明所述的用于扩增 miniSTR 基因座 D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、 0251776、0151627、0354529、025441、0452364、0353053、01751301和021511的12对0嫩引物 为：
[0025] 用于扩增D20S1082的一对DNA引物为：
[0026] 正向引物:序列如SEQ ID NO: 1所示，
[0027] 5 '-ACATGTATCCCAGAACTTAAAGTAAAC-3 '；
[0028] 反向引物:序列如SEQ ID NO:2所示，
[0029] 5 '-GCAGAAGGGAAAATTGAAGCTG-3 '；
[0030] 用于扩增D6S474的一对DNA引物为：
[0031] 正向引物:序列如SEQ ID NO:3所示，
[0032] 5 '-GGTTTTCCAAGAGATAGACCAATTA-3 '；
[0033] 反向引物:序列如SEQ ID NO:4所示，
[0034] 5 '-GTCCTCTCATAAATCCCTACTCATATC-3 '；
[0035] 用于扩增D12ATA63的一对DNA引物为：
[0036] 正向引物:序列如SEQ ID NO:5所示，
[0037] 5 '-GAGCGAGACCCTGTCTCAAG-3 '；
[0038] 反向引物:序列如SEQ ID NO:6所示，
[0039] 5 '-GGAAAAGACATAGGATAGCAATTT-3 '；
[0040] 用于扩增D9S1122的一对DNA引物为：
[0041 ] 正向引物:序列如SEQ ID NO:7所示，
[0042] 5 '-GGGTATTTCAAGATAACTGTAGATAGG-3 '；
[0043] 反向引物:序列如SEQ ID NO:8所示，
[0044] 5 '-GCTTCTGAAAGCTTCTAGTTTACC-3 '；
[0045] 用于扩增D2S1776的一对DNA引物为：
[0046] 正向引物:序列如SEQ ID NO:9所示，
[0047] 5 '-TGAACACAGATGTTAAGTGTGTATATG-3 '；
[0048] 反向引物:序列如SEQ ID NO: 10所示，
[0049] 5 '-GTCTGAGGTGGACAGTTATGAAA-3 '；
[0050] 用于扩增D1S1627的一对DNA引物为：
[0051 ] 正向引物:序列如SEQ ID NO: 11所示，
[0052] 5 '-CATGAGGTTTGCAAATACTATCTTAAC-3 '；
[0053] 反向引物:序列如SEQ ID NO: 12所示，
[0054] 5 '-GTTTTAATTTTCTCCAAATCTCCA-3 '；
[0055] 用于扩增D3S4529的一对DNA引物为：
[0056] 正向引物:序列如SEQ ID NO: 13所示，
[0057] 5 '-CCCAAAATTACTTGAGCCAAT-3 '；
[0058] 反向引物:序列如SEQ ID NO: 14所示，
[0059 ] 5，-GAGACAAAATGAAGAAACAGACAG-3，；
[0060] 用于扩增D2S441的一对DNA引物为：
[0061 ] 正向引物:序列如SEQ ID NO:15所示，
[0062] 5 '-CTGTGGCTCATCTATGAAAACTT-3 '；
[0063] 反向引物:序列如SEQ ID NO: 16所示，
[0064] 5 '-GAAGTGGCTGTGGTGTTATGAT-3 '；
[0065] 用于扩增D4S2364的一对DNA引物为：
[0066] 正向引物:序列如SEQ ID NO: 17所示，
[0067] 5 '-CTAGGAGATCATGTGGGTATGATT-3 '；
[0068] 反向引物:序列如SEQ ID NO: 18所示，
[0069] 5 '-GCAGTGAATAAATGAACGAATGGA-3 '；
[0070] 用于扩增D3S3053的一对DNA引物为：
[0071] 正向引物:序列如SEQ ID NO: 19所示，
[0072] 5 '-TCTTTGCTCTCATGAATAGATCAGT-3 '；
[0073] 反向引物:序列如SEQ ID NO:20所示，
[0074] 5 '-GTTTGTGATAATGAACCCACTCAG-3 '；
[0075] 用于扩增D17 S1301的一对DNA引物为：
[0076] 正向引物:序列如SEQ ID NO:21所示，
[0077] 5 '-AAGATGAAATTGCCATGTAAAAATA-3 '；
[0078] 反向引物:序列如SEQ ID NO:22所示，
[0079] 5 '-GTGTGTATAACAAAATTCCTATGATGG-3 '；
[0080] 用于扩增D21S11的一对DNA引物为：
[0081 ] 正向引物:序列如SEQ ID NO:23所示，
[0082] 5 '-ATTCCCCAAGTGAATTGC-3 '；
[0083] 反向引物:序列如SEQ ID NO:24所示，
[0084] 5，-GGTAGATAGACTGGATAGATAGACGA-3，。
[0085 ]本发明所述的用于扩增Ame I ogen in基因座的一对DNA引物为：
[0086] 正向引物:序列如SEQ ID NO:25所示，
[0087] 5 '-AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3 '；
[0088] 反向引物：序列如SEQ ID NO:26所示，
[0089] 5 '-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3 '。
[0090] 本发明所述的用于扩增 miniSTR 基因座 D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、 0251776、0151627、0354529、025441、0452364、0353053、01751301和021511的12对2嫩引物 为：
[0091] 用于扩增D20S1082的一对ZNA引物为：
[0092]正向引物:SEQ ID N0:1所示的核酸序列从5'端起的第3、8、9、15、17和23个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、8、15 和23个核苷酸中的任意2个或多个；
[0093]反向引物：SEQ ID N0:2所示的核酸序列从5'端起的第5、7、8、11、14、15和17个核 苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、 10、14和17个核苷酸中的任意2个或多个；
[0094] 用于扩增D6S474的一对ZNA引物为：
[0095] 正向引物：SEQ ID N0:3所示的核酸序列从5'端起的第4、5、9、12、20、21和23个核 苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、 9、 20和23个核苷酸中的任意2个或多个；
[0096]反向引物：SEQ ID N0:4所示的核酸序列从5'端起的第4、9、10、16、22和23个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、9 和22个核苷酸中的任意2个或多个；
[0097] 用于扩增D12ATA63的一对ZNA引物为：
[0098] 正向引物:SEQ ID N0:5所示的核酸序列从5'端起的第4、10、14、15、16和18个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、9、 15和18个核苷酸中的任意2个或多个；
[0099]反向引物:SEQ ID N0:6所示的核酸序列从5'端起的第3、5、6、13、19和20个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、13和 19个核苷酸中的任意2个或多个；
[0100] 用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为：
[0101]正向引物:SEQ ID N0:7所示的核酸序列从5'端起的第3、7、11、16和22个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、11和16 个核苷酸中的任意2个或多个；
[0102]反向引物：SEQ ID N0:8所示的核酸序列从5'端起的第5、7、11、14、18和21个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、 11、18和21个核苷酸中的任意2个或多个；
[0103] 用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为：
[0104] 正向引物:SEQ ID N0:9所示的核酸序列从5'端起的第4、8、10、12、16、20和24个核 苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、 10、 12和24个核苷酸中的任意2个或多个；
[0105]反向引物:SEQ ID勵：10所示的核酸序列从5'端起的第3、6、10、12、15和20个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6、 15和20个核苷酸中的任意2个或多个；
[0106] 用于扩增D1S1627的一对ZNA引物为：
[0107] 正向引物:SEQ ID勵：11所示的核酸序列从5'端起的第5、9、14、17、20和25个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、 14、17和25个核苷酸中的任意2个或多个；
[0108]反向引物：SEQ ID ^):12所示的核酸序列从5'端起的第3、6、10、15和20个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6、15 和20个核苷酸中的任意2个或多个；
[0109] 用于扩增D3S4529的一对ZNA引物为：
[0110] 正向引物：SEQ ID勵：13所示的核酸序列从5'端起的第3、6、9、13、16和18个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第6、9、 13和18个核苷酸中的任意2个或多个；
[0111] 反向引物：SEQ ID勵：14所示的核酸序列从5'端起的第6、10、13、15、18和21个核 苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第6、 10、13和21个核苷酸中的任意2个或多个；
[0112] 用于扩增D2S441的一对ZNA引物为：
[0113] 正向引物:SEQ ID勵：15所示的核酸序列从5'端起的第3、5、8、11、14和19个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、8、 14和19个核苷酸中的任意2个或多个；
[0114] 反向引物：SEQ ID ^):16所示的核酸序列从5'端起的第5、9、13、15和19个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、9和 15个核苷酸中的任意2个或多个；
[0115] 用于扩增D4S2364的一对ZNA引物为：
[0116] 正向引物:SEQ ID ^):17所示的核酸序列从5'端起的第3、5、9、14和19个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、5、14和 19个核苷酸中的任意2个或多个；
[0117] 反向引物：SEQ ID勵：18所示的核酸序列从5'端起的第4、7、9、12、18和22个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、 12和18个核苷酸中的任意2个或多个；
[0118] 用于扩增D3S3053的一对ZNA引物为：
[0119] 正向引物:SEQ ID ^):19所示的核酸序列从5'端起的第3、7、10、14、17、19和22个 核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第 3、7、14、19和22个核苷酸中的任意2个或多个；
[0120]反向引物：SEQ ID N0:20所示的核酸序列从5'端起的第4、7、13、16和20个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、13 和20个核苷酸中的任意2个或多个；
[0121] 用于扩增D17S1301的一对ZNA引物为：
[0122] 正向引物:SEQ ID N0:21所示的核酸序列从5'端起的第3、6、9、12和15个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6、12和 15个核苷酸中的任意2个或多个；
[0123] 反向引物:SEQ ID N0:22所示的核酸序列从5'端起的第4、7、9、13、16、20和24个核 苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、 7、9、16和24个核苷酸中的任意2个或多个；
[0124] 用于扩增D21 SI 1的一对ZNA引物为：
[0125] 正向引物:SEQ ID N0:23所示的核酸序列从5'端起的第3、6、10、和15个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6和15 个核苷酸中的任意2个或多个；
[0126] 反向引物:SEQ ID N0:24所示的核酸序列从5'端起的第4、7、11、13、17和23个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、11 和23个核苷酸中的任意2个或多个。
[0127]本发明所述的用于扩增Amelogenin基因座的一对ZNA引物为：
[0128] 正向引物：SEQ ID N0:25所示的核酸序列从5'端起的第3、5、11、15和19个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、11和 15个核苷酸中的任意2个或多个；
[0129] 反向引物：SEQ ID N0:26所示的核酸序列从5'端起的第5、9和16个核苷酸中的任 意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列。
[0130] 本发明所述的STR分型试剂盒中，用于扩增12个miniSTR基因座以及Amelogenin基 因座的ZNA引物分别由四种荧光素标记，相同荧光素标记视为同一组，第一组为:D20S1082、 D6S474和D12ATA63,第二组为：41^1(^611丨11、0951122和0251776，第三组为：0151627、 D3S4529 和 D2S441，第四组为：D4S2364、D3S3053、D17S1301 和 D21S11。
[0131] 本发明所述的STR分型试剂盒中，第一组STR基因座的ZNA引物的荧光标记为FAM， 第二组STR基因座的ZNA引物的荧光标记为HEX，第三组STR基因座的ZNA引物的荧光标记为 TAMRA，第四组STR基因座的ZNA引物的荧光标记为R0X，其中荧光素标记于用于每个STR基因 座的一对ZNA引物中的任意一条的5 '末端。
[0132] 本发明所述的STR分型试剂盒还包括每个基因座对应的等位基因标准物，以确定 样品中每个基因座的等位基因。
[0133] 本发明所述的STR分型试剂盒还包括DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、DNA提取试剂。
[0134] 本发明所述的STR分型试剂盒用于扩增样品中的STR基因座的PCR扩增程序为:95 。(:变性1111^11，然后94°(：变性3〇8,62°(：退火15-6〇8,72°(：延伸11^11，进行2〇-35个循环，最后 60°(：保温4511^11，4°(：保存。
[0135] 本发明所述的STR分型试剂盒适用于人类的骨骼、唾液、血液、毛发、精斑和陈旧血 痕等检材所提取的DNA样本检测。
[0136] 本发明还提供了上述STR分型试剂盒在案件排查、个体识别以及尸源认定中的应 用。
[0137] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0138] 目前市场上常用的个体识别和身份鉴定的STR分型试剂盒通常选用⑶DIS系统的 基因座，扩增片段的长度约200-400bp，如美国ABI公司的Identif iler?以及Promega公司的 PmyerPIex 16?等，然而随着实际案检工作的需求不断提高，对个体识别系统或试剂盒的 普遍适用性和兼容性不断提出更高的要求。
[0139] 虽然miniSTR在对降解DNA模板获得了很大的成功，但仍然也存在一些问题，例如， 由于受限于STR核心重复序列的长度，miniSTR的扩增片段长度不可能无限的减小，这就使 得不同基因座的miniSTR扩增片段分布更为集中，各个基因座的等位基因片段长度范围相 互重叠的机率比普通STR要高得多。因此基于miniSTR原理设计的荧光标记复合扩增试剂盒 不可能同时容纳很多基因座，一次检验所提供的信息量较少，必须增加复合扩增的次数。当 DNA模板数量很少或者样本扩增产量很低的时候，miniSTR的使用就会受到限制。
[0140] 本发明提供的miniSTR分型试剂盒中的STR基因座相应ZNA引物获得扩增片段长度 小于180bp，更加适合DNA高度降解的检材。
[0141] 本发明提供的miniSTR分型试剂盒在PCR扩增时，当DNA模板量低至12.5pg时，仍能 够获得清晰的扩增条带和分型结果，而使用相应DNA引物在相同扩增条件下，50pg的模板量 的扩增条带就开始模糊不清。因此，本发明提供的STR分型试剂盒具有相对更高的灵敏度。
[0142] 本发明设计的DNA引物或ZNA引物序列在扩增时不存在明显的竞争差异，使得扩增 产物更加平衡、特异，能够获得清晰完整的分型结果，进行个体识别的准确度高。
[0143] 本发明提供的miniSTR分型试剂盒中的miniSTR基因座相应ZNA引物，其核苷酸序 列以及Z unit的偶联部位的选择使得在复合扩增时，扩增产物更加平衡，特异性更高，从而 使得分型结果更加准确。
[0144] 本发明提供了一组miniSTR基因座，除了在中国汉族人群中多态性高，在藏族、蒙 古族、土家族、朝鲜族、撒拉族、哈萨克、白族、维族、俄罗斯族等少数民族群体中也具有高多 态性，能够有效解决由于不同区域、不同种族和不同民族之间遗传标记存在遗传差异性而 对STR分型系统的造成的应用限制。其个体识别的适用性更强，能够更好地更方便地应用于 实际案检工作中。
[0145] 本发明提供的mini STR分型试剂盒在PCR扩增时，使得PCR扩增循环数减少，在循环 数减少到25时，仍能获得完整的分型结果。一方面缩短了分型耗时，另一方面扩增产物仍能 保持平衡，再一方面降低了高循环数导致的非特异产物大量积累，分型精确性大幅下降，分 型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的风险，使得分型更加快速、精确。
[0146] 本发明提供的miniSTR分型试剂盒，在使用时PCR退火时间缩短至15s，仍可获得同 退火时间60s相同质量的扩增结果，因此使得PCR扩增时间缩短，进而使得分型时间缩短。因 此在用于案件侦破时，具有相对更高的时效性。
[0147] 综上所述，本发明创造性地将miniSTR分型技术和ZNA引物扩增相结合，提供的STR 分型试剂盒适合于中国人群，且适用于少数民族人群，适用于微量以及以及高度降解生物 样本的检测，分型的灵敏度和精确性大大提尚。
【附图说明】
[0148] 图1为实施例1中的基因座分型检测结果图。
[0149] 图2为实验例2中的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0150] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行； 所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的 是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替 换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0151] 本发明中CldH2O指双蒸水。
[0152] 本发明中，DNA分子的z unit偶联委托美国Polypliis-tran:s：fec:tkin?sA公司进行； PCR仪购自美国伯乐Bio-rad公司，型号为T100?;ABI 3130x1遗传分析仪购自美国ABI公司； Taq DNA聚合酶、dNTPs购自美国NEB公司;R0X-500DNA分子量标准购自克劳宁(北京)生物科 技有限公司，货号为DSMR-100。
[0153] 实施例1对10个不同志愿者进行基因座分型
[0154] 1、检材采集:检材为志愿者血液，共10份。
[0155] 2、模板DNA提取:采用Che I ex-100法分别从10份不同志愿者的血液检材中提取模 板 DNA。
[0156] 3、PCR 扩增：
[0157] (I)、使用的ZNA引物为：
[0158] 用于扩增D20S1082的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID NO: 1所示的核酸序列从 5'端起的第9和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID NO:2所示的核 酸序列从5'端起的第5、11和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0159] 用于扩增D6S474的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:3所示的核酸序列从5' 端起的第5和21个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID N0:4所示的核酸 序列从5'端起的第10和23个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0160] 用于扩增D12ATA63的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:5所示的核酸序列从 5'端起的第4、10和16个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID N0:6所示 的核酸序列从5'端起的第5、13和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0161] 用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为:正向引物:SEQ ID N0:7所示的核酸序列从5' 端起的第7和22个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID N0:8所示的核酸 序列从5'端起的第5、11和21个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0162] 用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为:正向引物:SEQ ID N0:9所示的核酸序列从5' 端起的第4、8、12和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID NO: 10所示 的核酸序列从5'端起的第6、10、15和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0163] 用于扩增D1S1627的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID NO: 11所示的核酸序列从 5'端起的第5、14、20和25个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物：SEQ ID NO: 12 所示的核酸序列从5'端起的第6、15和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0164] 用于扩增D3S4529的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID NO: 13所示的核酸序列从 5'端起的第6、13和18个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID NO: 14所示 的核酸序列从5'端起的第6、13和21个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0165] 用于扩增D2S441的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:15所示的核酸序列从5' 端起的第5、11和19个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID N0:16所示的 核酸序列从5'端起的第5、9和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序 列；
[0166] 用于扩增D4S2364的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID NO: 17所示的核酸序列从 5'端起的第5和19个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物：SEQ ID NO: 18所示的 核酸序列从5'端起的第7、12和18个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0167] 用于扩增D3S3053的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID NO: 19所示的核酸序列从 5'端起的第7、14和22个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID NO:20所示 的核酸序列从5'端起的第7和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0168] 用于扩增D17S1301的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:21所示的核酸序列从 5'端起的第6和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物：SEQ ID NO: 22所示的 核酸序列从5'端起的第4、9、16和24个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0169] 用于扩增D21S11的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:23所示的核酸序列从5' 端起的第3、6和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物：SEQ ID NO: 24所示的 核酸序列从5'端起的第4、11和23个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列；
[0170] 用于扩增Amelogenin基因座的一对ZNA引物为：正向引物：SEQ ID N0:25所示的核 酸序列从5'端起的第3和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列，反向引物:SEQ ID NO: 26所示的核酸序列从5'端起的第5和16个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列。
[0171] 上述13对ZNA引物混合构成复合扩增ZNA引物。
[0172] (2)、PCR扩增体系为：
[0173] IOyL 体系： 模板DNA \μΙ 复合扩增ZNA引物 2μΕ dNTFs 0.5μL
[0174] Taq DNA 聚合酶 0.2μL Taq DNA 聚合險 Buffer 1μΙ_. (IdH2O 讣足 lO.uL
[0175] (3)、PCR扩增程序为：
[0176] 95°C 变性 llmin，然后94°C变性30-60s，62°C退火15-60s，72°C延伸lmin，进行20-35个循环，最后60°C保温45min，4°C保存。
[0177] 4、毛细管电泳检测：
[0178] 以R0X-500作为DNA分子量内标，将PCR扩增产物或等位基因标准物lyL、甲酰胺9yL 内标R0X-500 IyL混合后加入96孔板中，95°C变性3min，立即冰浴3min，离心后放入ABI 3130x 1遗传分析仪进行电泳检测。
[0179] 其中1个志愿者的基因座分型检测结果如图1所示。
[0180] 实验例1检材类型
[0181] 1、检材采集:采集骨骼、唾液斑、血液、毛发、精斑、陈旧血痕等检材。
[0182] 2、模板DNA提取：同实施例1。
[0183] 3、？0財广增：同实施例1。
[0184] 4、毛细管电泳检测：同实施例1。
[0185] 检测结果:除个别检材外，绝大部分都能成功获得分型结果。
[0186] 实验例2模板浓度
[0187] 以D20S1082基因座为例，取实施例1中的1个志愿者的血液DNA作为模板，分别采用 其ZNA引物和DNA引物，分别按照200、100、50、25、12.5、6.25pg的模板量进行PCR扩增，PCR扩 增体系和扩增程序同实施例1，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。在相同扩增 条件下，ZNA引物获得的扩增产物浓度明显高于DNA引物，且ZNA引物在模板量为12.5pg时仍 然可以看到清晰的扩增条带，而DNA引物在相同条件下，50pg的模板量的扩增条带就开始模 糊不清。其余基因座的模板浓度情况和D20S1082基因座相同。
[0188] 案例：
[0189] 2013年3月，在北京某区发现了已完全白骨化的人体部分骨骸，经侦查机关认定是 一起碎尸案，同时发现了可能是碎尸地点的第一现场。北京市公安局对该碎尸的肱骨及可 疑现场的血痕进行了 DNA检验，虽然血痕得到了 STR检验结果，但肱骨未能检测到STR结果， 因此无法进行同一认定。发明人受办案机关委托将上述两个检材用本发明提供的分型试剂 盒进行检验，得到的分型结果完全一致，由于根据DNA检验认定了碎尸现场，为案件的最终 侦破提供了重要的科学证据。
[0190]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒包括用于扩增12 个miniSTR基因座的12对ZNA引物，所述的12个miniSTR基因座为：D20S1082、D6S474、 D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D3S3053、D17S1301和 D21Sll〇2. 如权利要求1所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒同 时复合扩增所述的 12 个 miniSTR 基因座为:D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、 D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D3S3053、D17S130GPD21S11。3. 如权利要求1所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒还 包括用于扩增性别识别基因座Ame 1 ogen in的1对ZNA引物。4. 如权利要求3所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒同 时复合扩增所述的12个miniSTR基因座和性别识别基因座Amelogenin。5. 如权利要求3所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的用于扩增12个miniSTR 基因座的12对ZNA引物为： 用于扩增D20S1082的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 1所示的核酸序列从5 '端起的第3、8、9、15、17和23个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、8、15和23 个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID NO: 2所示的核酸序列从5 '端起的第5、7、8、11、14、15和17个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、10、 14和17个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D6S474的一对ZNA引物为： 正向引物：SEQ ID N0:3所示的核酸序列从5'端起的第4、5、9、12、20、21和23个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、9、20 和23个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID N0:4所示的核酸序列从5'端起的第4、9、10、16、22和23个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、9和22 个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D12ATA63的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 5所示的核酸序列从5 '端起的第4、10、14、15、16和18个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、9、15和 18个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物:SEQ ID NO: 6所示的核酸序列从5 '端起的第3、5、6、13、19和20个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、13和19个 核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 7所示的核酸序列从5 '端起的第3、7、11、16和22个核苷酸中的任 意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第3、11和16个核 苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID N0:8所示的核酸序列从5'端起的第5、7、11、14、18和21个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、11、18 和21个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 9所示的核酸序列从5 '端起的第4、8、10、12、16、20和24个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、10、 12和24个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物:SEQ ID NO: 10所示的核酸序列从5 '端起的第3、6、10、12、15和20个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6、15和 20个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D1S1627的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 11所示的核酸序列从5 '端起的第5、9、14、17、20和25个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第5、14、17 和25个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID N0:12所示的核酸序列从5'端起的第3、6、10、15和20个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第3、6、15和20 个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D3S4529的一对ZNA引物为： 正向引物：SEQ ID ^):13所示的核酸序列从5'端起的第3、6、9、13、16和18个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第6、9、13和 18个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID NO: 14所示的核酸序列从5 '端起的第6、10、13、15、18和21个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第6、10、 13和21个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D2S441的一对ZNA引物为： 正向引物：SEQ ID ^):15所示的核酸序列从5'端起的第3、5、8、11、14和19个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、8、14和 19个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物:SEQ ID N0:16所示的核酸序列从5'端起的第5、9、13、15和19个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第5、9和15个核 苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D4S2364的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 17所示的核酸序列从5 '端起的第3、5、9、14和19个核苷酸中的任 意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第3、5、14和19个 核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID ^):18所示的核酸序列从5'端起的第4、7、9、12、18和22个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、12和 18个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D3S3053的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 19所示的核酸序列从5'端起的第3、7、10、14、17、19和22个核苷 酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、7、 14、19和22个核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID N0:20所示的核酸序列从5'端起的第4、7、13、16和20个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第4、7、13和20 个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D17 S1301的一对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID NO: 21所示的核酸序列从5 '端起的第3、6、9、12和15个核苷酸中的任 意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第3、6、12和15个 核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物:SEQ ID NO: 22所示的核酸序列从5 '端起的第4、7、9、13、16、20和24个核苷酸 中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、9、 16和24个核苷酸中的任意2个或多个； 用于扩增D21 SI 1的一对ZNA引物为： 正向引物：SEQ ID N0:23所示的核酸序列从5'端起的第3、6、10、和15个核苷酸中的任 意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第3、6和15个核 苷酸中的任意2个或多个； 反向引物:SEQ ID NO: 24所示的核酸序列从5 '端起的第4、7、11、13、17和23个核苷酸中 的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Z unit的位置优选为第4、11和23 个核苷酸中的任意2个或多个。6. 如权利要求3所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的用于扩增性别识别基 因座Amelogenin的1对ZNA引物为： 正向引物:SEQ ID N0:25所示的核酸序列从5'端起的第3、5、11、15和19个核苷酸中的 任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列，其中偶联Zunit的位置优选为第3、11和15个 核苷酸中的任意2个或多个； 反向引物：SEQ ID N0:26所示的核酸序列从5'端起的第5、9、和16个核苷酸中的任意2 个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列。7. 如权利要求3所述的mini STR分型试剂盒，其特征在于：所述的mini STR分型试剂盒 中，用于扩增12个miniSTR基因座以及Amelogenin基因座的ZNA引物分别由四种荧光素标 记，相同荧光素标记视为同一组，第一组为：D20S1082、D6S474和D12ATA63,第二组为： Amelogenin、D9S1122和D2S1776,第三组为：D1S1627、D3S4529和D2S441，第四组为： D4S2364、D3S3053、D17S1301和D21S11。8. 如权利要求3所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒还 包括每个基因座对应的等位基因标准物，以确定样品中每个基因座的等位基因。9. 如权利要求3所述的miniSTR分型试剂盒，其特征在于:所述的miniSTR分型试剂盒还 包括DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、DNA提取试剂。10. 权利要求1-10任意一项所述的miniSTR分型试剂盒在案件排查、个体识别以及尸源 认定中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106086223SQ201610717316
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】严江伟, 杨雅冉, 杨猛, 赵晶, 陈彤
【申请人】中国科学院北京基因组研究所