基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的检测东方蜜蜂微孢子虫的试剂盒及应用，由无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品组成。荧光定量PCR反应液含有Real?time Probe PCRMix、ddH2O、检测用引物和探针。本发明试剂盒特异性强、灵敏度高、反应时间仅42分钟，非常适合对东方蜜蜂微孢子虫病的现场快速检测，可以在基层广泛推广。
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的 东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用。 基于POCK IT M i cro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试 剂盒及应用
【背景技术】
[0002] 蜜蜂作为一种重要的授粉昆虫在维持农业可持续发展、农作物的多样性和提高农 产品的质量与产量方面起着重要作用，仅蜜蜂授粉就可占英国农场总产值的19%，在美国 所取得的经济效益高达12.5亿美元。但近年来美国、欧洲和中国等国家的蜂群出现了衰竭 失调，蜜蜂蜂群出现明显下降趋势，其中东方蜜蜂微孢子虫是危害蜂群的主要病原物之一。 该病原传播能力强，感染的寄主也广，它不仅感染东方蜜蜂、西方蜜蜂，而且感染熊蜂。被感 染的蜂群越冬死亡率大大提高，产蜜量严重下降。
[0003] 目前现场诊断方法主要是在显微镜下检查蜜蜂肠道内容物，以确定是否感染微孢 子虫。每群至少采集25只采集蜂，按每只蜂加1毫升水的比例加适量水，然后进行碾磨。把磨 好的液体放在显微镜下观察，孢子沉降很快，磨好的液体搅拌后立即蘸取1滴进行观察。使 用血球计确定感染水平，每只蜜蜂含百万个孢子时，一个视野中可观察到4-5只孢子。该方 法灵敏性有限，而且最重要的是无法区分东方蜜蜂微孢子虫和西方蜜蜂微孢子虫（西方蜜 蜂微孢子虫通常是相对良性的寄生虫，危害较轻）。因此，对东方蜜蜂微孢子虫建立一种操 作简单、快速、敏感、特异的检测方法迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的 东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒及应用，本方法是基于POCKIT Micro平台的荧光PCR，操作简 单、敏感性高、特异性强，可以现场对东方蜜蜂微孢子虫的检测提供科学依据，对保障蜂群 健康、促进养蜂业持续发展具有重要意义。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东 方蜜蜂微孢子虫检测的引物和探针，所述引物和探针包括:东方蜜蜂微孢子虫上游引物和 东方蜜蜂微孢子虫下游引物和东方蜜蜂微孢子探针，其中，
[0006] 所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述东方蜜 蜂微孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 3所示；东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3' 端连接有非荧光淬灭基团和MGB。
[0007] 本发明还公开了一种上述的引物和探针在制备东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒方 面的应用。
[0008] 本发明还公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试 剂盒，其特征在于，包括无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、阳性对照品和阴性对 照品；所述荧光定量PCR反应液由Real-time Probe PCR Mix、ddH20、检测用引物和东方蜜 蜂微孢子探针组成;所述检测用引物为东方蜜蜂微孢子虫上游引物和东方蜜蜂微孢子虫下 游引物，
[0009]所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述东方蜜 蜂微孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 3所示；东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3' 端连接有非荧光淬灭基团和MGB。
[0010]进一步地，阳性对照品为有东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的DNA样品，阴性对照品无 东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的样品。
[0011] 进一步地，标准品为具有东方蜜蜂微孢子虫基因片段的重组质粒，该基因片段的 核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012] 进一步地，该试剂盒保存于-20°c下。
[0013] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0014] 1)本发明提供了一种东方蜜蜂微孢子虫的荧光PCR检测试剂盒，其优点是特异性 强、灵敏度高、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。
[0015] 2)本发明能快速、准确地检测出被检样本中的东方蜜蜂微孢子虫DNA，也可用于蜂 群东方蜜蜂微孢子虫感染的分子流行病学调查。
[0016] 3)本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，操作简单，不仅省时省力而且节省了大 量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特 异性强的检测方法。
[0017] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0018] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [00 19] 图1是POCKIT Micro仪器的结构图；
[0020]图2东方蜜蜂微孢子虫阳性样本灵敏度检测结果，其中，I: IO5拷贝/50μ1反应体 系;2: IO4拷贝/50μ1反应体系;3: IO3拷贝/50μ1反应体系;4: IO2拷贝/50μ1反应体系；
[0021]图3本发明对采集的部分样本检测结果，其中，1:阴性对照；2:东方蜜蜂微孢子虫 阴性;3.阳性对照;4.东方蜜蜂微孢子虫阳性。
【具体实施方式】
[0022]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手 段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0023]实施例1基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒
[0024]本发明的目的是提供一种检测东方蜜蜂微孢子虫的试剂盒，该试剂盒包含:无菌 去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、阳性对照品和阴性对照品。
[0025] 其中，荧光定量PCR反应液含有Real-time Probe PCR Mix、ddH20、检测用引物和 探针;其中检测用引物为检测东方蜜蜂微孢子虫的上下游引物和探针共3条(表1):
[0026] 表1枪测东方密蝰微孢子电的h下游引物和探针
[0028]标准品为具有东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)基因片段的重组质粒，该基因 片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品 为有东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的DNA样品，阴性对照品为无东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的 样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0029]实施例2本发明试剂盒使用方法
[0030] 1.荧光PCR反应体系制备：总体积为50μ1，荧光定量PCR反应液于冰上融化及制备 荧光定量PCR反应管。依次取荧光定量PCR反应液25μ1，以及样本DNA(待检测样本、阳性对照 品、阴性对照品ΗμL，上下游引物各?μL、探针?μL，于荧光定量PCR反应管中混合。加样时注 意避光操作。将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡。
[0031] 2.扩增检测：把PCR反应管置于POCKIT Micro仪器内，按运行键，即开始反应； POCKIT Micro如图 1所示。
[0032] 3.检测结果判定：表示阳性，表示阴性。
[0033] 实施例3东方蜜蜂微孢子虫标准品的制备和灵敏性检测方法
[0034] 东方蜜蜂微孢子模板(用来扩增标准品的DNA模板)的制备:采集25只采集蜂，按每 只蜂加1毫升水的比例加适量水，然后进行碾磨。研磨后离心，收集沉淀;按照通用基因组提 取试剂盒（宝生物Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)操作提取DNA，即为 东方蜜蜂微孢子虫模板DNA。
[0035]将采用NcF和NcR引物PCR扩增东方蜜蜂微孢子虫模板DNA，扩增出的目的产物克隆 到pEASY-Tl (全式金公司），转化后进行菌落PCR鉴定，阳性菌落培养后提取质粒进行测序。 测序结果正确质粒采用NanoDrop2000精确定量，然后根据质粒分子量进行计算摩尔量，制 备出10 5、104、103和IO2拷贝AU的标准品用于灵敏性检测。
[0036] 配制如下反应体系：
[0037]标准品（东方蜜蜂微孢子模板DNA): ΙμL
[0038] NcF:lyl(终浓度 500ηΜ)
[0039] NcR:lyl(终浓度 500ηΜ)
[0040] Probe :1μ1(终浓度 25〇ηΜ)
[0041 ] 2X Probe Μ?χ:10μ1
[0042] (ΜΗ20:6μ1
[0043] 使用试剂盒时，对于N个样品，应配制(Ν+3)倍体积的反应体系(包括阴性对照、阳 性对照各一个，以及分装耗费误差），保证各反应管分装均匀。
[0044] 各反应管放入POCKIT Micro反应孔，按"运行键"即可，42分钟后反应结束，阳性结 果为"+"，阴性结果为
[0045] 其中，通用基因组提取试剂盒（Uni versal Genomi c DNA Extract ion Ki t Ver. 3.0)为宝生物工程(大连)有限公司产品，Real-time Probe PCR Mix购自宝生物公司， POCKIT Micro仪器(厦门金瑞鸿捷公司）。引物、探针设计与合成均由六合华大公司完成；
[0046] 标准品设置4个梯度，分别为105、104、103和IO2拷贝/50μ1反应体系，结果如图2所 不:其中，1:1〇 5;2:104;3:103;4:102;说明本方法灵敏性最尚为100个拷贝。
[0047] 实施例4东方蜜蜂微孢子虫荧光PCR检测
[0048] 1.样本DNA提取
[0049] 分别采集1例经实验室PCR方法确诊的感染东方蜜蜂微孢子虫的蜜蜂及1例无感染 的蜜蜂，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为 1·5ng/yl〇
[0050] 2.样本检测
[00511 取出荧光定量PCR反应液于冰浴融化后取25μ1，上下游引物各ΙμL，探针ΙμL，再加 入待检测样本DNA ΙμL。另外同时再设置PCR反应管，依次加入上述试剂，设置阳性对照品、 阴性对照品。样品加好后，按运行键开始反应。
[0052] 3.检测结果
[0053] 检测结果如图3所示，图中1:阴性对照;2:东方蜜蜂微孢子虫阴性;3.阳性对照;4. 东方蜜蜂微孢子虫阳性;说明本检测方法特异性好，只对阳性标准品和微孢子虫阳性蜜蜂 样本产生"+"阳性判读结果。
[0054]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改 和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行 改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测的引物和探针，其特 征在于，所述引物和探针包括:东方蜜蜂微孢子虫上游引物和东方蜜蜂微孢子虫下游引物 和东方蜜蜂微孢子探针，其中， 所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述东方蜜蜂微 孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 3所示；东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5 '端连接有FAM标记，3 '端连 接有非荧光淬灭基团和MGB。2. 权利要求1所述的引物和探针在制备东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒方面的应用。3. -种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试剂盒，其特征在于， 包括无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、阳性对照品和阴性对照品;所述荧光定量 PCR反应液由Real-time Probe PCR Mix、ddH20、检测用引物和东方蜜蜂微孢子探针组成； 所述检测用引物为东方蜜蜂微孢子虫上游引物和东方蜜蜂微孢子虫下游引物， 所述东方蜜蜂微孢子虫上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述东方蜜蜂微 孢子虫下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 3所示；东方蜜蜂微孢子探针的核苷酸序列的5 '端连接有FAM标记，3 '端连 接有非荧光淬灭基团和MGB。4. 根据权利要求3所述的基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试 剂盒，其特征在于，阳性对照品为有东方蜜蜂微孢子虫DNA片段的DNA样品，阴性对照品无东 方蜜蜂微孢子虫DNA片段的样品。5. 根据权利要求3所述的基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试 剂盒，其特征在于，所述的标准品为具有东方蜜蜂微孢子虫基因片段的重组质粒，该基因片 段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。6. 根据权利要求3所述的基于POCKIT Micro荧光PCR平台的东方蜜蜂微孢子虫检测试 剂盒，其特征在于，该试剂盒保存于_20°C下。
【文档编号】C12Q1/68GK106086221SQ201610709212
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月22日
【发明人】李锐, 袁玉伟, 杨华, 郝力力, 吉小凤, 钱鸣蓉, 肖英平
【申请人】浙江省农业科学院