恶臭假单胞菌的pcr检测用引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物和检测方法，其中，引物的核苷酸序列为序列1和序列2；检测方法包括下列步骤：1）将权利要求1中的引物、待检菌液的DNA模板与PCR扩增用的含Mg2+的PCR缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶混合，配制得PCR反应体系；2）将上述的PCR反应体系置于PCR仪上，按照预定扩增条件进行扩增；3）扩增结束后，利用电泳检测扩增片段从而断定结构；本发明采用PCR方法进行恶臭假单胞菌的基因片段检测，检测结果的准确度更高，检测方法更加灵敏，仅需要普通的PCR仪和电泳仪就可以达到检测的目的，而且仅用2-3小时就可以出具检测结果。
【专利说明】恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别提供了一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法。
【背景技术】
[0002]恶臭假单胞菌在自然界中普遍存在，是一种能够去除环境污染的环保微生物菌剂。美国、日本等国家已将该菌大批量生产制成产品经销到世界各国。为了增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来细菌的破坏，需要尽快建立环保微生物菌剂中恶臭假单胞菌检验方法。
[0003]目前，只有形态学鉴定和生化鉴定两种方法检测恶臭假单胞菌，而上述两种检测方法的结果均有很大的不确定性。
[0004]因此，如何研发一种新的检测恶臭假单胞菌的方法，成为人们亟待解决的问题。
[0005]
【发明内容】
鉴于此，本发明的目的在于提供一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法，其通过采用PCR方法进行恶臭假单胞菌的基因片段检测，该检测方法不仅更加灵活，而且检测结果准确度高。
[0006]本发明一方面提供了恶臭假单胞菌的PCR检测用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’
序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3，
本发明另一方面提供了恶臭假单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤:
1)将上述恶臭假单胞菌的PCR检测用引物、待检菌液的DNA模板与PCR扩增用的含Mg2+的PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶混合，配制得PCR反应体系；
2)将上述的PCR反应体系置于PCR仪上，按照预定扩增条件进行扩增；
3)扩增结束后，利用电泳检测扩增片段从而断定结构。
[0007]优选，所述扩增条件为:94 °C预变性Imin ;94 °C变性15s，61°C退火15s，72 °〇延伸15s，进行30个循环；72 °C延伸5min。
[0008]进一步优选，所述电泳检测为凝胶电泳检测。
[0009]进一步优选，所述凝胶电泳检测具体为:3~5V/cm恒压电泳，电泳50~60min 本发明提供的恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法，采用PCR方法进行恶臭假
单胞菌的基因片段检测，检测结果的准确度更高，检测方法更加灵敏，仅需要普通的PCR仪和电泳仪就可以达到检测的目的，而且仅用2-3小时就可以出具检测结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为特异性确定检测的电泳图；
图2为敏感性确定检测的电泳图；图3、图4和图5为29批恶臭假单胞菌的样品检测电泳图。
【具体实施方式】
[0011]下面以具体的实施例对本发明进行进一步的解释，但并不用于限制本发明的保护范围。
[0012]实施例1
引物的设计:
在Gengbank上查阅恶臭假单胞菌全基因序列，设计针对恶臭假单胞菌保守基因设计的特异性引物，其具体核苷酸序列为:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’
序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3，
扩增恶臭假单胞菌目的基因片段为161bp。
[0013]实施例2
待检菌液的DNA模板提取:
O以无菌操作取Ig UL)样品加入到IOOmL生理盐水中混匀，移取I环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30°C培养24h。取样过程中，在样品旁边放置I个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照。
[0014]2)挑取平板上1-3个单菌落转营养肉汤35土 1°C恒温培养箱内增菌培养18h~24h。
[0015]3)细菌基因组DNA的提取
取上述培养的菌液200ul，使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行，提取得到细菌基因组DNA。
[0016]实施例3
PCR扩增方法的建立:
I) PCR反应体系的配制:具体的成分配制见表1，
表1
【权利要求】
1.一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’ 序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3’。
2.一种恶臭假单 胞菌的PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤: 1)将权利要求1中的引物、待检菌液的DNA模板与PCR扩增用的含Mg2+的PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶混合，配制得PCR反应体系； 2)将上述的PCR反应体系置于PCR仪上，按照预定扩增条件进行扩增； 3)扩增结束后，利用电泳检测扩增片段从而断定结构。
3.按照权利要求2所述恶臭假单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，所述扩增条件为:94 °C预变性Imin ；94 °C变性15s，61°C退火15s，72 °C延伸15s，进行30个循环；72 °〇延伸 5min。
4.按照权利要求2所述恶臭假单胞菌的PCR检测方法，其特征在于:所述电泳检测为凝胶电泳检测。
5.按照权利要求4所述恶臭假单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，所述凝胶电泳检测具体为:3~5V/cm恒压电泳，电泳50~60min。
【文档编号】C12Q1/68GK103898221SQ201410135105
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】耿庆华, 王芳, 王金玲, 张莹, 林颖 申请人:中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局