记反应体系为10μL:
[014 引 3μLDNA化 5ng/μL)，正向、反向引物巧Ong/yL)各lyL，5yLGoTaq曠Green Mastermix(Promega，Wisconsin,USA)；
[0149]PCR反应程序为：94°C预变性 4min;94°C变性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，34 个循环；72°C保溫5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6.0%非变性聚丙締酷胺凝胶， 150V恒功率电泳分离比，银染显色后在胶片观察灯下进行带型统计分析。
[0150] 结果表明：针对分子标记GI1354,31份材料中有3份材料带型与表型结果不相符， 正确率为90. 3% (见图8,表3)。
[0151] 表3 :利用31份WQ132与FS871为亲本构建的Bi株系对标记GI1354进行准确性 验证度1群体为（Q132XFS871)XQ13。。图8中的条带由左自右分别为!V221至F2-251、 Q132、FS871。
[0152]
[0153]
[0154] 实施例3:
[0155] 本实施例为上述与cr基因紧密连锁的分子标记GI1354,在鉴别不同遗传背景的 辣椒材料中是否含有cr基因的应用。
[0156] 上述分子标记GI1354作为PCR引物，对于不同辣椒材料的基因组DNA进行PCR扩 增反应，得到扩增产物，再将该扩增产物进行非变性聚丙締酷胺凝胶电泳，银染显色后，进 行带型统计分析，W确定辣椒材料是否含有cr基因。
[0157] 上述与cr基因紧密连锁的分子标记GI1354应用于鉴定辣椒材料中是否含有cr 基因的方法，包括W下步骤：
[0158] (1)辣椒材料基因组DNA提取：采用天根植物基因组DNA提取试剂盒值P305-2)提 取辣椒材料的基因组DNA，提取方法详见试剂盒的操作说明，得到辣椒材料基因组DNA。
[0159] 上述辣椒材料为对CMV表现为感病的辣椒材料：茄口、Y化0WONDER,对CMV表现为 抗病的辣椒材料：湘301、Tombak(中抗）；
[0160] 上述感病辣椒材料的直接来源于北京市农林科学院蔬菜研究中屯、辣椒种质资源 库。
[OW] 似PCR扩增反应：W该分子标记GI1354作为PCR引物，W该辣椒材料基因组DM作为模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物。
[0162] 优选地，该PCR扩增反应的体系中包括：
[0163]模板DNA0.5-2.0ng/yL正向、反向引物各l-lOng/yLdNTP各 100-500μπιο1/ レMgCl2l-5mmol/^，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μレ体积百分比为10-20%的10XTaq Buffer；
[0164] 更优选地，该PCR扩增反应体系中包括：
[0165]模板DNA1.6ng/yL，正向、反向引物各 5ng/yL，dNTP各 100ymol/L，MgClz Immol/LTaqDNA聚合酶 0.lU/μL体积百分比为 10% 的 10XTaqBuffer;
[0166] 其中，上述化qDNAPolymerase及其Buffer购自北京全式金生物技术有限公司， dNTPs购自TaKaRa公司；
[0167] 作为一种优选的方案，该PCR扩增反应采用W下的10μL体系：
[016引 3μL的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧Ong/μL)各1μL，5μL的 GoTaq?GreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA);上述GoTaq?GreenMastermix购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，目录号为M7122。
[0169] 该PCR反应程序为：94°C预变性4min;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s， 34个循环；72°C保溫5min，得到扩增产物。
[0170] (3)电泳和染色：将该扩增产物用6.0%的非变性聚丙締酷胺凝胶，于150V恒功率 电泳分离Ih;再银染显色（参见实施例2的步骤③）后，在胶片观察灯下进行带型统计分 析（参见实施例2的步骤③）。
[0171] 结果表明：针对分子标记GI1354,4份抗感明确的辣椒材料中均不含有cr基因，正 确率为100%。因此，该分子标记GI1354可W应用于检测辣椒材料是否含有cr基因。
[0172] 本发明中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。
[0173] 显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是 对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还 可W做出其他不同形式的变化或变动。运里无法对所有的实施方式予W穷举。凡是属于本 发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354,其特征在于：所述分子标记具有 序列表中的SEQIDNO: 1~2的至少一个的核巧酸碱基序列。2. 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的应用，其特征在于：所述分子标 记应用辣椒材料中Cr基因的检测。3. 根据权利要求2所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的应用，其特 征在于： 所述检测包括W下步骤： 辣椒材料基因组DNA提取步骤：对辣椒材料进行提取处理，得到辣椒材料基因组DNA; PCR扩增反应步骤：W所述分子标记作为PCR引物，W所述辣椒材料基因组DNA作为模 板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物； 分析步骤：将所述扩增产物进行电泳分离处理，显色处理，再统计分析所述辣椒材料是 否含有Cr基因。4. 根据权利要求3所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的应用，其特 征在于： 所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有： 模板DNA0. 5-2.Ong/yL正向、反向引物各I-IOng/yLdNTP各 100-500ymol/ レMgCl2l-5mmol/^，l'aqDNA聚合酶0.1-0.5U/yレ体积百分比为10-20%的10Xl'aq Buffer; 优选地，所述PCR标记反应体系中含有： 模板DNA1. 6ng/JiL，正向、反向引物各 5ng/JiL，dNTP各 100Jimol/L，MgClzlmmol/L，TaqDNA聚合酶0.lU/yL体积百分比为10 %的IOXhqBufferc5. 根据权利要求3所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的应用，其特 征在于： 所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有： 体积百分含量为10-50%的模板DNA化5ng/ y L)，正向、反向引物巧化g/ y L)的体积 百分含量各5-15%，体积百分含量为40-60%的GoTaq〇$Green Master mix ; 优选地，PCR标记反应体系中含有： 体积百分含量为30%的模板DNA化5ng/iiL)，正向、反向引物巧化g/iiL)的体积百分 含量各10%，体积百分含量为50%的GoT泌傑*GreenMastermix。6. 根据权利要求3或4所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的应用， 其特征在于： 所述PCR扩增反应步骤中，PCR反应程序为：94°C预变性4min;94°C变性15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，：34 个循环；72°C保溫 5min。7. 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的获取方法，其特征在于： 所述获取方法包括W下步骤： 将辣椒供试材料进行苗期抗病接种鉴定，W明确CMV抗性由单隐性基因Cr控制；再利 用SSR引物和InDel引物进行筛选和分离，得到所述与辣椒CMV抗性基因Cr紧密连锁的分 子柄记GI1354。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354及获取方法和应用。与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354具有序列表中的SEQ？ID？NO:1～2的至少一个的核苷酸碱基序列。所述分子标记应用辣椒材料中cr基因的检测，所述检测包括辣椒材料基因组DNA提取、PCR扩增反应、分析等步骤。本发明直接将筛选获得的PCR引物作为分子标记使用，可以准确地检测到辣椒材料是否含有cr基因，本发明方法方便、快捷、节约成本。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105368824
【申请号】CN201510591422
【发明人】张晓芬, 耿三省, 陈斌
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年9月16日...