，并将其中 一块玻璃板底部的空隙封上。
[0054] 4)制胶（12%质量百分比的聚丙締酷胺凝胶）50血：19. 65血d地2〇+20血30%胶 原液+10血 5ΧΤΒΕ+35μΙTEMED+350yLAPS。
[00巧]5)灌胶：用100ml注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注 射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙締酷胺溶液，几乎注满空隙。
[0056] 6)立即将合适的梳子轻轻插到凝胶中，小屯、勿使梳齿下留有气泡。梳子的顶端应 略高于玻璃板的上沿。
[0057] 7)丙締酷胺于室溫聚合30~60min，冬天则放入30°C烘箱中。若凝胶回缩明显， 应补加溶液。凝胶完全聚合时可见梳齿下两条折光线。
[005引 8)拔梳子：用1XT邸浸润凝胶的顶端2~4分钟，小屯、拔出梳子，立即用1XTBE冲洗一下加样孔，W防止梳子所留存的少量丙締酷胺溶液在加样孔聚合，产生不平整的表 面。
[005引9)将胶膜夹在电泳槽上，每20μL体系中加2μL上样缓冲液，混匀，点样1μL。[0060] 10)电泳：120V，60mA，距到2/3处停下（约化）。
[006。 PAGE胶的银染步骤采用快速染色法，具体步骤如下：
[006引1)染色：聚丙締酷胺凝胶电泳结束后，卸下玻璃板，将凝胶转移至染色液中，室溫下于摇床上W40~80巧m振荡8~lOmin。
[0063] 2)清洗：倒尽染色液，用(1地2〇清洗凝胶2次，20~30s，第二次清洗20~30s后， 加入微量显色液，稍振荡后倒掉变黑的显色液。
[0064]扣显色：倒尽上述清洗液，再加入适量显色液，W40rpm振荡至清晰带纹出现（约 5min)，倒尽显色液，并用d地2〇冲洗2~3次。
[006引 4)洗胶：用d地20清洗，将PAGE胶小屯、的转移到白色底板上，用凝胶成像系统拍 照。
[006引分析PCR扩增产物电泳结果，发现BO1SSR00207在耐/易抽臺池和两个亲本之间 都存在差异（图2和图3)，认为其有可能与目标性状（耐抽臺性）存在连锁关系。
[0067] 3.筛选出一个SSR分子标记B〇1SSR00207,其上游引物为沈QIDNO. 1，下游引物 为SEQIDNO. 2 ;经单株验证分析，该分子标记BO1SSR00207与结球甘蓝耐抽臺基因的遗传 距离为10. 69cM。
[0068] 具体做法为：对筛选得到的B0ISSROO2O7分子标记进行F2分离群体的单株验证， 统计耐/易抽臺单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Kosambi函数计算标 记与控制耐抽臺性状基因之间的遗传距离。结果显示（图4)，23个耐抽臺单株中有20株存 在特异带，3株没有特异带；15株易抽臺单株中有1株没有特异带。结果表明，BO1SSR00207 分子标记与结球甘蓝耐抽臺性有较紧密的连锁性，但在耐抽臺和易抽臺单株中有一定的交 换，交换率为10. 53%，经Kosambi函数换算SSR标记BO1SSR00207与抗病基因的遗传距离 为 10. 69cM。
[0069] 4.为了验证分子标记B0ISSROO207的在育种实践中的适用性，我们随机选取了 34 个抽臺性各异的结球甘蓝品种进行验证，结果显示，28个品种验证结果均与实际情况一致， 符合率达到82. 35% (表2)。上述结果表明，BO1SSR00207在结球甘蓝耐抽臺分子标记辅 助选择中具有较好的适用性。
[0070] 表2BO1SSR00207对34个品种进行耐易抽臺性的验证结果表
[0071]
[0072]
[0073] 5.对筛选获得的分子标记B〇1SSR00207进行回收和测序，结果显示，B〇1SSR00207 的序列长度为16化P(如SEQIDNO. 3所示）。序列分析结果显示，该标记为（CT)η二核巧 酸重复类型，在易抽臺植株中是（CT)8,在耐抽臺植株中是（CT) 10。
[0074] 具体做法为；
[0075] (5. 1)胶条切取：用无菌手术刀切取含有目标DNA片段的非变性PAGE胶，胶条宽 约2mm，再用干净的綴子将胶条转入1. 5mL离屯、管。用液氮将胶条磨碎。
[007引（5.。样品浸泡：加入 200μL分散缓冲液（0. 5MCH3COONH4,0. 01MMg(CH3COO)2，ImM邸TA，0. 1 %SDS，P册.0)，用无菌枪头将碎胶和缓冲液混匀；60°C溫浴60min，期间每 15min振荡1次，确保缓冲液和碎胶充分接触，提高目的片段的释放量。
[0077] (5.3)氯仿抽提：加入200μL氯仿萃取液（氯仿：异戊醇：无水乙醇为19:1:5) 混匀，W1300化pm离屯、3min，吸上清液150μL，转到新的1. 5血无菌离屯、管中。
[0078] (5. 4)酒精沉淀：加入300μL预冷的无水乙醇，混匀，-20°C放置30min;W 13000巧m离屯、4min;弃上清液，倒置干燥15~20min。
[0079] (5.WDM溶解：加入10μLd地2〇溶解，-20°C保存。
[0080] (5. 6)PCR扩增：PCR的反应体系（20μL) :75ng回收的DNA模板，0.抓TaqDNA 聚合酶（FermentasTM)、〇. 4μΙ(10μηιο1·??)dNTPs、1μΙ(10μηιο1 ?L1)上下游引物、2μΙ lOXPCRBuffer(200mmol·LiTris抑 8. 0,200mmol·LiKCl，lOOmmol·L1(畑4)25〇4和 20mmol·LiM拆〇4)，加d地2〇至20μL。PCR检测的扩增程序：94°C预变性3min，进入35个 循环（94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)，最后再72°C延伸7min。PCR反应过程在 BIO-RADSIOOQTmThermal切cler仪器上进行，样品在4°C条件下保存。
[0081] 巧.7)PCR产物回收：PCR产物的回收操作步骤参照Axyen?凝胶回收试剂盒说明书 进行。
[0082] (5.8)回收产物的载体连接：连接体系（10μU:5μL2XRapidLigation Buffer, 4μL回收产物，0. 5μLT-easy载体（50ng·μL1)，1. 5UΤ4DNA连接酶 (Promega?)，加d地2〇 至 10μL。4°C连接 10 ~12h。
[0083] (5. 9)连接载体的转化：拿出在-75°C保存的大肠杆菌感受态细胞100μ以稍解 冻，加入10μL的连接产物。满旋混匀后，放入冰中，冰浴30min，然后放入42°C水浴锅中 热击100s，再冰浴5min。在超净工作台上每管加入ImL的液体LB培养基。在恒溫摇床上 37°C，200巧m振摇约90min。将LB固体培养基放入微波炉中，加热融化。待融化的LB培 养基略微冷却后，每30mL加入7. 5μL的氨节青霉素钢（Amp, 200mg·mL1)，混匀后，倒成两 个平板，冷却凝固。将摇床中的菌液取出后，12000rpm，离屯、Imin，弃上清。用移液枪将残 留上清和沉淀混匀，滴到已凝固成平板的LB培养基上，用涂抹棒涂抹均匀。平板正面朝上 30min，待菌液干后，倒置平板于37°C的培养基中10~12h。
[0084](5. 10)挑菌斑测序：在30血液体LB培养基中加入7. 5μLAmp(200mg·血-1)，混 匀后吸取ImL培养基分装至1. 5mL离屯、管中，用移液枪枪头挑取平板上的白色菌斑，在离屯、 管中的LB培养基中吸打几下，确保挑取的菌落已经接种到该离屯、管的培养基中。将上述带 有目标菌落的LB培养基置于37°C恒溫摇床，200rpm水平振摇约12h。W上述摇好的菌液为 模板，WSP6/T7引物对菌液进行检测。菌液PCR的反应体系W及扩增程序同化）。根据菌 液PCR琼脂糖凝胶电泳的检测结果，选阳性菌液，吸取500μL并送往上海英驗生物技术有 限公司进行测序。
[0085] 上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权 利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记，其特征在于，其上游引物为SEQID NO. 1，下游引物为SEQIDNO. 2。2. -种权利要求1所述的与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记的获得方法，其特 征在于，包括以下步骤： (1) 利用经过多代自交选育出的耐抽薹材料'Y9805'和易抽薹材料'Y5-3-14'，将耐抽 薹亲本和易抽薹亲本进行杂交得到Fi群体，Fi自交后获得F2群体； (2) 针对F2群体，采用改良的BSA法分别构建耐抽薹基因池和易抽薹基因池； (3) 利用SSR分子标记技术，对易抽薹基因池和耐抽薹基因池进行与结球甘蓝耐抽薹 性分子标记的筛选；筛选出与目标性状（耐抽薹性）存在连锁关系分子标记B〇1SSR00207， 经单株验证分析，该分子标记与结球甘蓝耐抽薹基因的遗传距离为10. 69cM。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2具体为： (2. 1)通过冬性鉴定确定匕群体中每一个单株的耐抽薹性，以抽薹情况将F2R群体单 株分为1级~9级。其中，1级为：短缩茎伸长（<lcm) ;9级为：花薹高度大于20cm; (2. 2)取F2代群体中的1级单株15株，采用CTAB法提取基因组DNA，混样后构建F2代 耐抽薹基因池；取9级单株15株，采用CTAB法提取基因组DNA，混样后构建F2代易抽薹基 因池。
【专利摘要】本发明公开了一种与结球甘蓝耐抽薹基因连锁的分子标记及其获得方法。该方法先将易抽薹材料和耐抽薹材料杂交得到F1群体并自交构建F2群体；利用SSR分子标记技术和改良BSA法对结球甘蓝F2群体进行耐抽薹分子标记的筛选，获得与结球甘蓝耐抽薹基因紧密连锁的分子标记BolSSR00207。该SSR分子标记与控制耐抽薹性状基因的遗传距离为10.69cM，为(CT)n二核苷酸重复类型，在易抽薹植株中是(CT)8，在耐抽薹植株中是(CT)10。对随机选取的34个抽薹性各异的结球甘蓝品种进行验证，符合率达到82.35％。研究结果提供了一种结球甘蓝耐抽薹分子标记辅助选择的方法，并为分离新的结球甘蓝耐抽薹基因奠定了研究基础，同时，本发明对芸薹属作物的抗寒种质创新和耐抽薹理论研究均有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105368831
【申请号】CN201510837157
【发明人】余小林, 邹明华, 缪黎明, 王芳展, 刘振宁, 陈纪算, 王巍
【申请人】浙江大学, 宁波海通食品科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月26日