专利名称：一种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法
技术领域：
本发明属于无性繁殖技术领域，具体涉及ー种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法
背景技术：
蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb. ) Trev ,又名千层塔，山芝和蛇足草等，为石杉科Huperoaceae石杉属Huperzia Bernh.多年生草本蕨类植物，在中国民间主要将全草用于治疗跌打损伤、淤血肿痛和精神分裂等疾病。自1972年我国科技工作者首次报道从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用后，对其进行了大量的研究，发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的こ酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗老年痴呆症(AD)、重症肌无カ和单纯记忆障碍等有显著疗效。近年来随着人口老龄化的加剧，市场对石杉碱甲的需求量不断攀升，石杉碱甲的来源还是以其原药材蛇足石杉为主。但是，蛇足石杉中石杉碱甲的含量很低，仅为0.007%左右，而且现存的该类植物大多生长缓慢，野生状态下蛇足石杉的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6 15年才能成熟。另外，研究表明蛇足石杉的生长对环境湿度的要求很高，湿度在81%-90%才能适合其正常生长繁殖。这些都极大地限制了蛇足石杉野生资源的再生。现由于蛇足石杉在主产国一中国的蕴藏量甚少，很本不够社会的需求。吴荭等对中国蛇足石杉野生蕴藏量进行了调查，初步确定我国蛇足石杉天然生物量为4656. 6t。并以此为基础，在进一步考虑人的采集能力的前提下，判定我国蛇足石杉的理论可采量为1604t。我国蛇足石杉商业可采量大约不会超过200t。由于蛇足石杉资源分散，而且许多相对集中的产地均位于自然保护区和风景区范围内，不可能大規模开采，解决资源短缺的问题还有赖于寻求其他更加科学合理的途径。不然，这种宝贵的自然资源将处于灭绝的边缘。到目前为止，蛇足石杉的扦插实验只能在人工气候室或湿度较大的地区进行，而在中国西部地区进行相关的扦插或移栽实验均以失败告终。
发明内容
针对蛇足石杉野生资源短缺，并对生长环境中湿度要求在81% 90%之间，本发明目的在于，提供ー种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法，以保存蛇足石杉的种质资源，并能为实验室相关方面的研究提供鲜活的实验材料。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案ー种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法，其特征在于，具体按以下步骤操作(I)培养基质的准备将干燥水苔置于含3-吲哚丁酸0. 5mg/rimg/L的1/2MS培养液中充分吸水后，装入广ロ培养瓶中达1/3体积处，用封瓶膜将瓶ロ封住，于121°C下灭菌25min，晾凉备用；(2)材料的表面灭菌从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鲜材料,经自来水冲洗干净，剪取顶芽6-8cm在超净工作台中先浸在质量分数为75%的こ醇溶液中30_60s ’然后置于浓度为0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min，再用无菌水冲洗3_5次，作为扦插的材料；(3)孢子体的扦插培养将灭菌后的顶芽扦插在灭过菌的培养瓶中培养，培养温度为22±2°C、光照时间12-16/d条件下进行培养10-12周，顶芽的下端生根，上端长出新的顶芽或发生分支；(4)孢子体的继代扩繁剪取步骤(3)中获得植株的顶芽，然后扦插于另一新的培养瓶中继续培养，而剩下的形态学下端接种于含细胞分裂素培养液的培养瓶中培养，培养条件与步骤(3)中的温度、光照时间相同；培养10周后，原来剪去顶芽的下端可长出新的顶芽，而扦插的顶芽则能产生新的根井能伸长或发生分支。 所述的蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鲜材料为石杉科(Huperziaceae)石杉属(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb.)Trevis)的顶芽。所述的步骤(3)中水苔浸泡培养液为常规的1/2MS培养液中加入0. lmg/L^lmg/L的3-吲哚丁酸(IBA)。所述的含细胞分裂素培养液为常规的1/2MS培养液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) lmg/L 10mg/L。采用本发明进行蛇足石杉试管扦插的方法，带来的技术效果体现在以下几方面I、将蛇足石杉扦插于培养瓶中并用封瓶膜封闭瓶ロ，这样既保证了蛇足石杉生长时对湿度的要求，又保证瓶子内外能进行一定的气体交換，因此蛇足石杉能正常地在瓶中生长，这对于蛇足石杉种质资源的保存有一定的意义；2、蛇足石杉培养的基质中添加有多种植物激素，激素可促进其生根生芽，这能加快蛇足石杉的扩繁，能为实验室进行相关方面的研究提供鲜活的实验材料。
具体实施例方式考虑到人工气候室培养蛇足石杉成本极高，申请人经过对多种培养基质的筛选，最終确定水苔作为理想的扦插基质，用培养瓶来提供适宜的湿度条件，配合植物激素的调节作用，首次成功对蛇足石杉孢子体进行了试管扦插。以下所述的1/2MS培养液也称为1/2MS培养基。MS培养基是常用的基本培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。而1/2MS是将MS的大量元素减半其他不变而配置的培养基，这主要是降低无机盐浓度。目前已经有商品化的产品面市，例如上海丽臣生物科技有限公司生产的1/2MS培养基(产品编号11944，规格250g/瓶)，主要用于植物组织培养。以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，本发明不限于这些实施例。实施例
I:
(I)培养基质的准备将干燥水苔置于含3-吲哚丁酸(IBA) 0. 5mg/L的1/2MS培养液中充分浸泡，再装入广ロ培养瓶中达1/3体积处，用封瓶膜将瓶ロ封住，于121°C下灭菌25min，晾凉备用；(2)材料的表面灭菌从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鲜材料,经自来水冲洗干净，剪取顶芽6cm在超净工作台中先浸在质量分数为75%的こ醇溶液中30s ;然后置于浓度为0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，作为扦插的材料；
(3)孢子体的扦插培养将所述顶芽扦插于灭过菌的培养瓶中，培养温度为22±2°C、光照时间16h/d条件下进行培养12周，顶芽的下端生根率为93%，上端长出新的顶芽(叶片)或发生分支；(4)孢子体的继代扩繁剪取步骤(3)中获得植株的顶芽，然后扦插于另一新的培养瓶中继续培养，而剩下的形态学下端接种于含细胞分裂素培养液的培养瓶中培养，该含细胞分裂素培养液为常规的1/2MS培养液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)5mg/L。培养温度和光照条件与步骤(3)相同。培养10周后，原来剪去顶芽的下端可以长出新的顶芽，而扦插的顶芽则能产生新的根井能生长或发生分支。实施例2 (I)培养基质的准备将干燥水苔置于含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的1/2MS培养液中充分浸泡，再装入广ロ培养瓶中达1/3体积处，用封瓶膜将瓶ロ封住，于121°C下灭菌25min，晾凉备用；(2)材料的表面灭菌从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鲜材料,经自来水冲洗干净，剪取顶芽8cm在超净工作台中先浸在质量分数为75%的こ醇溶液中60s ;然后置于浓度0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5min，再用无菌水冲洗3次，作为扦插的材料；(3)孢子体的扦插培养将所述顶芽扦插于培养瓶中，培养温度为22±2°C、光照时间12h/d条件下进行培养12周，顶芽的下端生根率为87%，上端长出新的叶片或发生分支；(4)孢子体的继代扩繁剪取步骤(3)中获得植株的顶芽，然后扦插于另一新的培养瓶中继续培养，而剩下的形态学下端接种于含10mg/L 6-节氨基嘌呤的培养瓶中培养,培养温度和光照条件与步骤(3)相同。培养10周后，原来剪去顶芽的下端可以长出新的顶芽，而扦插的顶芽则能产生新的根井能伸长或发生分支。
权利要求
1.ー种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法，其特征在于，按以下步骤操作 (1)培养基质的准备 将干燥水苔置于含3-吲哚丁酸0. 5mg/L^lmg/L的1/2MS培养液中充分吸水后，装入广ロ培养瓶中达1/3体积处，用封瓶膜将瓶ロ封住，于121°C下灭菌25min，晾凉备用； (2)材料的表面灭菌 从野外采集蛇足石杉新鲜材料，经自来水冲洗干净，剪取顶芽6cm 8cm,超净工作台中先浸在质量分数为75%的こ醇溶液中30s 60s ;然后置于浓度为0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5min 8min,再用无菌水冲洗3次,作为扦插的材料； (3)孢子体的扦插培养 将灭菌后的顶芽扦插在灭过菌的培养瓶中，培养温度为22±2°C、光照时间12/d 16/d条件下进行培养10周 12周，顶芽的下端生根，上端长出新的顶芽或发生分支； (4)孢子体的继代扩繁 剪取步骤(3)中获得植株的顶芽，然后扦插于另一新的培养瓶中继续培养，而剩下的形态学下端接种于含细胞分裂素培养液的培养瓶中培养，培养条件与步骤(3)中的温度、光照时间相同，培养10周后，原来剪去顶芽的下端长出新的顶芽，而扦插的顶芽则能产生新的根井能生长或发生分支。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的蛇足石杉新鮮材料为石杉科(Huperziaceae)石杉属(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trevis)的顶芽。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的含细胞分裂素培养液为常规的1/2MS培养液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) lmg/L 10mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法，该方法以新鲜蛇足石杉孢子体顶芽为材料，用试管扦插的方式进行材料的繁殖和保存。方法简单易行，效率高，对于蛇足石杉的种质资源保存有着重要的意义，并能为各地实验室进行相关方面的研究提供鲜活的实验材料。
文档编号A01H4/00GK102640706SQ20121014386
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者包日双, 尉亚辉, 郭斌 申请人:西北大学