专利名称：一种独一味组织培养离体快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的组织培养和离体快速繁殖，尤其涉及一种独一味组织培养离体快速繁殖方法。
背景技术：
独一味是唇形科(Lamiaceae)独一味属多年生无莖草本植物,又名独步通,藏语亦称“大巴”、“打布巴”，产于我国青海、西藏、四川、云南西北部、甘肃，生于海拔270(T4500m的高山草甸、河滩草甸。独一味味苦、微寒，根及根茎或全草入药，药材表面枯黄色或黄褐色，质坚硬、干枯、气腥臭，是我国藏、蒙、纳西等民族民间常用草药之一，具有止血、镇痛、活血化瘀、抗菌消炎、增强免疫力等作用，藏医将其用于骨髓炎、关节黄水病、骨折、跌伤、枪伤等。在我国一千多年前的藏医学名著《四部医典》和《晶珠本草》中就已有记载。藏药独一味生长周期长，随着奇正炎痛贴、独一味片及胶囊等国家级新药的大量生产，独一味药材已供不应求。而独一味药材长期依赖野生采挖来满足国内外市场需求，种质资源破坏严重、蕴 藏量急剧减少。尤其是近年来随着国内外对独一味需求量的增加，大量掠夺性采挖，使独一味逐渐成为濒危植物，面临物种丧失、资源枯竭的危险，因此进行种质资源保护和扩大独一味繁育势在必行。植物组织培养技术是利用细胞的全能性(即个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。)，取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖；(2)便于保持优良生物学特性；⑶在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的独一味突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。本发明首次采用无菌苗幼根为外植体进行组织培养方法，开展野生独一味种质离体繁殖研究工作，这为挽救珍稀藏药独一味种质资源，开展遗传改良、促进独一味的工厂化育苗提供了一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种易于操作、可进行大规模工厂化生产的独一味组织培养离体快速繁殖方法。为解决上述问题，本发明所述的一种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min,置于500ppm赤霉素溶液中浸泡Ih后，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15 30秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡灭菌51分钟，并用无菌去离子水冲洗3飞次后接种到MS无激素培养基上，其中每25ml所述MS无激素培养基中接种4粒所述消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体；
⑵外植体接种将所述外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml所述愈伤组织诱导培养基中接种2小段所述外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol m_2. s—1、光照时间为12 14 h cf1的条件下培养10 25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织；
⑶愈伤组织增殖将所述愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，其中每25ml所述愈伤组织增殖培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的条件下愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织；
⑷愈伤组织的芽诱导将所述步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每 25ml所述诱芽培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25V ±2°C、光照强度为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 14 h cf1的条件下培养30 35天，形成丛生芽；
(5)丛生芽的增殖将所述丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml所述芽增殖培养基中接种I棵所述丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m—2. s—1、光照时间为12 14 h . Cf1的条件下培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗；
(6)生根诱导将所述丛生独一味苗进行分株，后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种I棵所述丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；
(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质；
⑶植株移栽将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。所述步骤⑴中的独一味为唇形科独一味属多年生草本植物。所述步骤⑴中的MS无激素培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至
5.8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤⑵中的愈伤组织诱导培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液(TlOml，浓度为
0.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5 20ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤⑶中的愈伤组织增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤⑷中的诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液l(T30ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液(TlOml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121 °C高温消毒即得。所述步骤(5)中的芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，浓度为0. lmg/ml的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉
6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤(6)中的生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有机成分母液IOml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液(T20ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤(7)中的育苗基质总孔隙度为70% 75%，有机质含量为20%。所述大量元素母液是指含有硝酸铵(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸钾(KNO3) 1900mg/L,硫酸镁(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg/L,氯化钙(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸锰(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸锌(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化钾(KI) 0. 83mg/L，钥酸钠(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸铜(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化钴(CoCl2'6H20) 0. 025mg/L 的混合液。所述有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0. lmg/L,盐酸吡哆醇0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述铁盐母液是指含有硫酸亚铁(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本发明与现有技术相比具有以下优点
I、本发明首次采用幼叶外植体通过生物工程技术一组织培养技术进行组织培养，克服了独一味育苗周期过长、繁殖系数低的问题；同时开展野生独一味种质资源离体繁殖研究工作，为挽救珍稀藏药独一味种质资源，开展遗传改良、促进独一味的工厂化育苗提供了一条新途径，提供了一种能进行独一味的人工繁殖、种质资源离体保存、利用及选育药用成分含量高的突变系的组织培养离体繁殖方法。
2、由于本发明所用培养基中含有植物激素2，4-D和6-BA，2，4_D激素属细胞生长素类，此生长素的生理作用主要是促进细胞伸长生长和细胞分裂，具有诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力的特点；6-BA激素属细胞分裂素类，具有诱导芽分化的主导作用，促进芽的分化和侧芽萌发生长等特点，因此诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，炼苗后可直接成活，易于操作，可进行大规模工厂化生产。3、本发明利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖，即启动快；⑵便于保持优良生物学特性，即同步性好；(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的独一味突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。
具体实施方式
、
实施例I 一种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15秒，然后以无菌去离子水冲洗2次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 1%%的升汞中，浸泡灭菌8分钟，并用无菌去离子水冲洗3次后接种到MS无激素培养基上，其中每25mlMS无激素培养基中接种4粒消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体。MS无激素培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑵外植体接种将外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种2小段外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol m_2. s—1、光照时间为12 14 h . cf1的光照培养箱内培养10 25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液0 ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m_2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . nT2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成丛生芽。
诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液0ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)丛生芽的增殖将丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml芽增殖培养基中接种I棵丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol nT2. s—1、光照时间为12^14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗。芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)生根诱导将丛生独一味苗进行分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液0 ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后,加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(8)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例2 —种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌20秒，然后以无菌去离子水冲洗2次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 15%的升汞中，浸泡灭菌6分钟，并用无菌去离子水冲洗4次后接种到MS无激素培养基上，其中每25mlMS无激素培养基中接种4粒消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体。MS无激素培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑵外植体接种将外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种2小段外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol nT2. S—1、光照时间为12 14 h . cf1的光照培养箱内培养10 25天，在幼根 两端切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m_2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . nT2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成丛生芽。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)丛生芽的增殖将丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml芽增殖培养基中接种I棵丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol nT2. s—1、光照时间为12^14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗。芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)生根诱导将丛生独一味苗进行分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。 生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(8)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例3 —种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌25秒，然后以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 2%的升汞中，浸泡灭菌5分钟，并用无菌去离子水冲洗6次后接种到MS无激素培养基上，其中每25mlMS无激素培养基中接种4粒消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体。MS无激素培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑵外植体接种将外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种2小段外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol nT2. S—1、光照时间为12 14 h . cf1的光照培养箱内培养10 25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液8ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . nT2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成丛生芽。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)丛生芽的增殖将丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml芽增殖培养基中接种I棵丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol nT2. s—1、光照时间为12^14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗。芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)生根诱导将丛生独一味苗进行分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30飞0 umol .m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。
(8)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例4 一种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 2%的升汞中，浸泡灭菌6分钟，并用无菌去离子水冲洗6次后接种到MS无激素培养基上，其中每25mlMS无激素培养基中接种4粒消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体。MS无激素培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑵外植体接种将外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种2小段外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol nT2. S—1、光照时间为12 14 h . cf1的光照培养箱内培养10 25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m_2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织。
愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . nT2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成丛生芽。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液30ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。
(5)丛生芽的增殖将丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml芽增殖培养基中接种I棵丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol nT2. s—1、光照时间为12^14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗。芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)生根诱导将丛生独一味苗进行分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(8)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例5 —种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min，置于500ppm赤霉素(GA3)溶液中浸泡Ih后，在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 2%的升汞中，浸泡灭菌8分钟，并用无菌去离子水冲洗6次后接种到MS无激素培养基上，其中每25mlMS无激素培养基中接种4粒消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体。MS无激素培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克， 后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑵外植体接种将外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种2小段外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol nT2. S—1、光照时间为12 14 h . cf1的光照培养箱内培养10 25天，在幼根两端切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m_2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内愈伤组织增殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . nT2.s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成丛生芽。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液30ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)丛生芽的增殖将丛生芽接种到芽增殖培养基上，其中每25ml芽增殖培养基中接种I棵丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol nT2. s—1、光照时间为12^14 h .Cf1的光照培养箱内培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗。芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)生根诱导将丛生独一味苗进行分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口
膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的光照培养箱内培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液20ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(8)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株，一般成活率在70%以上。一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。上述实施例1 5中的独一味为唇形科独一味属多年生草本植物独一味(Lamiophlomis rotate (Benth. ) Kudo);超净工作台，型号为BCM-1000A,由苏州安泰空气技术有限公司生产。MS无激素培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、诱芽培养基、芽增殖培养基、生根培养基中大量元素母液是指含有硝酸铵(NH4NO3) 1650mg/L，硝酸钾(KNO3)1900mg/L,硫酸镁(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg/L,氯化钙(CaCl2_ 2H20)440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸锰(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L,硫酸锌(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化钾(KI) 0. 83mg/L，钥酸钠(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸铜(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化钴(CoCl2_ 6H20) 0. 025mg/L 的混合液；有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素0. lmg/L,盐酸批卩多醇0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；铁盐母液是指含有硫酸亚铁(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA 2H2037. 3 mg/ L的混合液。
权利要求
1.ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤 ⑴外植体的选择和消毒处理选颗粒饱满的独一味种子，52°C的水浴锅内恒温浴12min,置于500ppm赤霉素溶液中浸泡Ih后，用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15 30秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的种子置于质量浓度为0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡灭菌51分钟，并用无菌去离子水冲洗3飞次后接种到MS无激素培养基上，其中每25ml所述MS无激素培养基中接种4粒所述消毒后的种子；3 4天后种子开始萌发，10天后将萌发的无菌苗的幼根作为初始培养外植体； ⑵外植体接种将所述外植体切成0. 3^0. 5cm长的小段，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml所述愈伤组织诱导培养基中接种2小段所述外植体；在温度为25°C ±2°C、光照强度为30 60 umol m_2. s—1、光照时间为12 14 h cf1的条件下培养10 25天，在幼根两端切ロ处膨大形成愈伤组织； ⑶愈伤组织増殖将所述愈伤组织接种到愈伤组织増殖培养基上，其中每25ml所述愈伤组织増殖培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的条件下愈伤组织増殖2(T35天，长出浅黄色、颗粒状致密的愈伤组织； ⑷愈伤组织的芽诱导将所述步骤⑶所得的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml所述诱芽培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为25V ±2°C、光照强度为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 14 h cf1的条件下培养30 35天，形成丛生芽； (5)丛生芽的増殖将所述丛生芽接种到芽増殖培养基上，其中每25ml所述芽增殖培养基中接种I棵所述丛生芽；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol . m—2. s—1、光照时间为12 14 h . Cf1的条件下培养3(T35天，形成生长健壮的独一味苗； (6)生根诱导将所述丛生独一味苗进行分株，后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种I棵所述丛生独一味苗；在温度为25°C ±2°C、光照强度为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 14 h .Cf1的的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗； (7)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质； ⑶植株移栽将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株；所述ー棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。
2.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑴中的独一味为唇形科独一味属多年生草本植物。
3.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑴中的MS无激素培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
4.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑵中的愈伤组织诱导培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为o. lmg/ml的2，4- ニ氯苯氧こ酸母液(TlOml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液5 10ml，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5 20ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
5.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑶中的愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液IOml,浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，カロ入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
6.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步 骤⑷中的诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml，有机成分母液IOml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-节氨基腺嘌呤母液l(T30ml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液(TlOml,后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
7.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤(5)中的芽增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液IOOml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液5ml，浓度为0.lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液2ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后,加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121 °C高温消毒即得。
8.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤(6)中的生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液(T20ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
9.如权利要求I所述的ー种独一味组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤(7)中的育苗基质总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。
全文摘要
本发明涉及一种独一味组织培养离体快速繁殖方法，该方法包括以下步骤⑴外植体的选择和消毒处理将独一味种子经浸泡灭菌、冲洗、接种，得初始培养外植体；⑵外植体接种将外植体切段，接种形成愈伤组织；⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种进行增殖，形成致密的愈伤组织；⑷愈伤组织的芽诱导将致密的愈伤组织接种形成丛生芽；⑸丛生芽的增殖将丛生芽接种形成生长健壮的独一味苗；⑹生根诱导将丛生独一味苗进行分株后接种培养，得完整再生小苗；⑺育苗基质消毒；⑻植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常独一味植株。本发明克服了独一味育苗周期过长、繁殖系数低的问题，易于操作、可进行工厂化快速育苗。
文档编号A01H4/00GK102657086SQ20121014378
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者周国英, 孙菁, 宋文珠, 徐文华 申请人:中国科学院西北高原生物研究所