一种血散薯的组织培养繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特指一种血散馨的组织培养繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 血散馨，学名Ste地aniadielsianaY.C.Wu，又称金不换、一滴血，为防己科千金 藤属植物。血散馨W块根入药，性寒，味苦；有清热解毒、散疲止痛的功效，用于中暑发烧、血 疲腹痛、咳嗽咯血、淋己结核等症。血散馨分布于我国广西、湖南、广东、贵州等省区，主产于 广西的桂平、防城、當宁、上林、隆林、天峨、南丹、东兰、罗城、金秀、慕浦、永福、灵川等地。
[0003] 血散馨常生于山谷、溪边、林中、石缝及峭壁上。近年研究发现，血散馨含有大量的 千金藤碱，具有抗癌、抗肿瘤、抑制中枢神经系统及解疫的作用。随着市场需求量的不断攀 升，野生资源遭到过度采挖，溯临枯竭。在自然条件下，血散馨主要依靠种子进行繁育，但种 子小，且种子成熟时自然脱落的特性常造成种子产量低，生产上难W实现大面积栽培。
[0004] 传统的植物组织培养接种环多为敞开的环固定连接在杆体上，存在严重的交叉感 染，大大降低了接种成活率，降低了血散馨的繁殖系数，因此，亟需一种克服细菌交叉感染， 提高血散馨的繁殖系数的植物组织培养接种环。
[000引发明的内容
[0006] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种血散馨的组织培养繁殖方法，采用生物技术对血 散馨进行组织培养繁殖，保持了原始品种的优良性状，在短时间内培育出大量可供大田栽 培的血散馨幼苗，显著提高了血散馨的种苗质量和繁殖系数，适合工厂化生产，从而满足生 产上的需要。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种接种装置，将接种环设置在壳体内，通过操作按 钮、第一凸块和第=凸块，实现接种环在壳体中的移动，对消毒的接种环和无菌的待接种物 在转移过程中有很好的保护作用，避免空气中的细菌污染接种环，从而带来的交叉感染，大 大提高了接种率。
[0009] 为了实现本发明的运些目的和其它优点，提供了一种血散馨的组织培养繁殖方 法，包括试管苗繁殖培养：用接种环取培育得到的无菌试管苗，接种至增殖培养基中，在培 养溫度为24~26°C，光照强度1400~16001UX，光照时间为10~12h/d的条件下培养25~ 35山得到大量不定芽；其中，所述增殖培养基的pH值为5. 5~6. 0,其包含：MS、25~35g/L 的薦糖、4~5g/L的琼脂、0. 5~1. 5g/L的活性炭、1. 0~2.Omg/L的6-苄基腺嚷岭、0. 5~ 1. 5mg/L的激动素和0.3~0.5mg/L的吗I噪下酸。
[0010] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述增殖培养基的抑值为5.8,其 包含：MS、30g/L的薦糖、4. 5/L的琼脂、1.Og/L的活性炭、1.Omg/L的6-苄基腺嚷岭、0. 5mg/ L的激动素KT和0. 3mg/L的吗I噪下酸。
[0011] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，还包括试管苗生根培养：将所述试 管苗繁殖培养中得到的不定芽切成带顶芽或蔽芽的茎段，用所述接种环取茎段将其接种至 生根培养基中，在培养溫度为24~26°C，光照强度1400~16001UX，光照时间为10~12h/ d的条件下培养25~35d，得到完整的带根苗；所述生根培养基的抑值为5. 5~6. 0,其包 含：1/2MS、25~35g/L薦糖、4~5g/L琼脂、0. 5~1. 5g/L活性炭、0. 1~1.Omg/L的生根 粉、0. 1~0. 3mg/L的吗I噪下酸和1. 0~2.Omg/L的糞乙酸。
[0012] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述生根培养基的抑值为5. 5~ 6. 0,其包含：l/2MS、30g/L薦糖、4. 5g/L琼脂、1.Og/L活性炭、1.Omg/L的生根粉、0. 2mg/L 的吗I噪下酸和2.Omg/L的糞乙酸。
[0013] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，在所述试管苗繁殖培养之前还包 括：
[0014] 无菌外植体的获取：取血散馨顶芽作为外植体，用质量百分数为0. 01~0. 09%洗 洁精水溶液浸泡3~8min，再经流水冲洗10~20min;移置于超净工作台上，用添加了 2~ 3滴吐溫-20的质量百分数为0. 1 %升隶消毒8~lOmin，然后用无菌水冲洗3~5次，再用 无菌吸水纸吸干表面水分，切成0. 5~0.8cm带一个顶芽的茎段，获得无菌外植体；所述无 菌水为经高压灭菌后的蒸馈水；
[0015] 无菌试管苗的获取：用所述接种环取所述无菌外植体，将其接种至诱导培养基中， 在培养溫度为24~26°C，光照强度1400~16001UX，光照时间为10~12h/d的条件下培养 25~35d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；所述诱导培养基抑值为5. 5~6. 0,其包含 MS、25~35g/L的薦糖，4~5g/L的琼脂，0. 5~1. 5mg/L的6-苄基腺嚷岭、0. 1~0. 9mg/ L的激动素和0. 1~0. 9mg/L的糞乙酸；
[0016] 所述试管苗繁殖培养之后还进行了试管苗炼苗移栽：将所述试管苗生根培养中获 得的完整的带根苗，在室溫为23~25°C的室内散射光照射2~4山打开瓶盖，在瓶中加入 少量自来水淹没培养基，炼苗3~5山待试管苗表面角质形成后，用綴子取出试管苗，洗净 根部培养基，移栽到质量比为3 : 1的泥炭±和细河沙混合的基质中生长40d，再移栽至大 田。
[0017] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述接种环设置在接种装置中，所 述接种装置还包括：
[0018] 连接杆，其第一端设有按钮，第二端与所述接种环的外圆周连接，所述连接杆上设 有第一弹性片，所述第一弹性片的下端固定连接在所述连接杆的上部，所述第一弹性片的 背离所述连接杆的一表面的上部上设有圆台状的第一凸块，所述第一凸块的下底面固定连 接在所述第一弹性片的表面上，所述连接杆下部设有环形凸起；
[0019] 壳体，其为中空的圆柱状结构，所述壳体套设在所述连接杆外部，所述按钮伸出所 述壳体的第一端，所述壳体的靠近其第一端的外壁上设有沿所述壳体轴线方向相对的可容 纳所述第一凸块的第一开口和第二开口，使得所述第一凸块可从所述第一开口和所述第二 开口伸出，所述第一开口和所述第二开口的沿所述壳体轴线方向的间距为2~3畑1，所述壳 体的内壁上沿径向内接有圆盘，所述圆盘上开设有使所述连接杆穿过的通孔，所述壳体的 靠近其第二端的外壁上设有与其轴线平行的条状凹槽，所述条状凹槽的沿壳体轴线方向相 对的一对槽壁上均设有银齿状滑槽；
[0020] 弹黃，其套设在所述连接杆上，并与所述环形凸起和所述圆盘相抵；
[0021] 盖帽，其包括较接的第一板体和第二板体，所述第一板体和所述第二板体的夹角 为90~160°，所述第一板体与所述壳体平行，所述第一板体的朝向所述壳体的第一表面 上设有第二凸块，所述第一板体的背离所述壳体的第二表面上设有第=凸块，所述第二凸 块连接有两个相对的与所述壳体轴线平行的条状的第二弹性片，所述第二弹性片的自由端 设有第四凸块，所述第四凸块可在所述银齿状滑槽中移动和定位，从而通过所述第二凸块 带动所述第一板体的移动，所述盖帽的第二板体为与所述壳体的第二端端面尺寸一致的圆 盘形结构，所述壳体的第二端上为无菌铁质材料，所述盖帽的第二板体上设有无菌吸铁石， 使得所述第二板体朝着所述壳体的第二端移动时，在所述吸铁石的吸力下，所述第二板体 将所述壳体的第二端封闭；
[0022] 在所述试管苗繁殖培养、试管苗生根培养和无菌试管苗的获取中的接种过程是通 过所述接种装置操作所述接种环实现的，具体为：朝着靠近所述壳体的第一端的方向移动 所述第=凸块，待所述第二板体脱离所述壳体的第二端后，按动所述按钮将所述第一凸块 从所述第一开口移动至所述第二开口，使得所述接种环伸出所述壳体的第二端，用所述接 种环取待接种物；
[0023] 朝向所述壳体内部按动所述第一凸块使得所述第一凸块在所述弹黃的弹性恢复 力下从所述第二开口移动至第一开口，待所述接种环缩回所述壳体内部后，朝着靠近所述 壳体的第二端的方向移动所述第=凸块，使得所述第二板体将所得壳体的第二端封闭，移 动所述接种装置至培养基上方，打开所述壳体的第二端，推出所述接种环，将待接种物接种 至培养基上。
[0024] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述接种环上和所述无菌试管内 壁均涂有质量比为1 : 10 : 5的纳米银、神山麦饭石和电气石混合形成的远红外材料。
[00巧]优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述诱导培养基、增殖培养基和生 根培养基中均添加有0.Img/L的生物素和lOmg/L的植物提取剂；
[0026] 其中，所述植物提取剂为体积比为10 : 5 :8: 1 : 4的西红柿提取液、芦苔提 取液、巧樣提取液和迷迭香提取液的混合溶液。
[0027] 优选的是，所述的血散馨的组织培养繁殖方法，所述试管苗移栽前，所述基质表面 铺设有两层聚乙締缓释膜，所述两层聚乙締缓释膜之间注入有质量配比为10:1:10:2 的泛酸、有机馨合肤、棚砂和屯水硫酸亚铁。
[0028] 本发明至少包括W下有益效果：
[0029] 第一、本发明采用生物技术对血散馨进行组织培养繁殖，保持了原始品种的优良 性状，在短时间内培育出大量可供大田栽培的血散馨幼苗，显著提高了血散馨的种苗质量 和繁殖系数，适合工厂化生产，从而满足生产上的需要；
[0030] 第二、本发明在诱导培养基中添加6-苄基腺嚷岭，激动素和糞乙酸，能够诱导不 定芽萌发；在增殖培养基中添加6-苄基腺嚷岭，激动素和吗I噪下酸，可促进不定芽的分化 和生长；在1/2MS生根培养基中添加生根粉、吗I噪下酸和糞乙酸可获得完整的带根化经炼 苗后可直接移栽至基质中；
[0031]第=、本发明得到的单芽繁殖系数达4-9倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗 生根率高达92. 3