专利名称：一种蛇足石杉组织培养的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种蛇足石杉组织培养体系建立 的方法。
背景技术：
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]又名救命王、金不换、千层塔、山 芝、蛇足草，属蕨类石杉科(Huperiaceae)石杉属(Huperzia Bemh.)，是一种珍贵的药用 蕨类植物。民间常用其全草治疗跌打损伤、淤血肿毒、精神分裂等疾病。其所含的石杉碱 甲AOluperzine A)已被药理实验证明可低毒、高效、可逆且高选择性地抑制乙酰胆碱酯酶 (AchE)，已开发出多种成药，可用于治疗重症肌无力、提高学习效率以及改善老年人的记忆 功能等，为目前治疗老年痴呆等疾病的特效药，市场前景广阔。由于人工合成的石杉碱甲A 类似物副作用大且成本高，因此目前用于成药的石杉碱甲A都来自野生资源。石杉碱甲的 野生资源主要来源于石杉科石杉属植物蛇足石杉、石杉科马尾杉属及石杉属其他植物。目 前绝大部分用于成药的石杉碱甲A均提取自野生蛇足石杉。由于蛇足石杉多生长在人迹罕至的山地密林或沟谷阴湿土中，对生境要求苛刻， 生长缓慢，生产周期长；加之石杉碱甲在全草中含量甚微，目前，药品生产完全依赖野生资 源，价格昂贵，长期采挖造成资源急剧减少，其野生资源总量十分有限。因此，寻求石杉碱甲 再生资源势在必行。目前的研究显示通过芽孢、扦插、压条和分株等营养繁殖方式进行蛇 足石杉的人工栽培虽然可行，但繁殖系数和生物量较低，进行大规模人工栽培的条件还不 成熟。而组织培养具有需要材料少、条件可控、不受季节限制、周期短、重复性强等优点，是 石松植物快速繁殖和大规模工厂化生产的理想手段。通过组织培养技术对蛇足石杉进行扩 大繁殖，旨在寻找一条方便快捷的繁殖途径，以便为人工大量栽培提供技术支持，为满足市 场需求打下基础。应用组织培养技术对蛇足石杉进行繁殖，既可扩大药材来源，又能保护野 生资源。蛇足石杉组织培养过程中存在外植体灭菌困难、无菌外植体的获得率低，外植体 接种后污染和褐化现象严重，不能正常生长、分化和增殖，愈伤组织的诱导率极低且增殖困 难等问题。虽然国内外研究者也进行了一些相关方面的尝试，但是至今还没有蛇足石杉组 织培养成功的报道。
发明内容
针对蛇足石杉组织培养过程中存在外植体灭菌困难、无菌外植体的获得率低，外 植体接种后污染和褐化现象严重，不能正常生长、分化和增殖等问题，本发明通过对灭菌方 法、培养基和培养条件的研究，实现了蛇足石杉组织培养较低的污染率、低褐化率、高成活 率、高生长率、高分化率和高生根率；本发明旨在提供一种蛇足石杉组织培养的方法。本发明的具体操作步骤如下一种蛇足石杉组织培养的方法包括以下步骤
(1)选择外植体从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子体，切取茎尖，经 自来水冲洗干净；(2)杀灭表面菌将洗净的茎尖在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液30-50s ；接着置于浓 度0. 的升汞(HgCl2)溶液浸泡7-lOmin，再转入浓度7%的双氧水(H202)溶液中浸泡 10-15min，最后用无菌水冲洗3-5次，作为蛇足石杉组织培养的外植体；(3)接种培养将所述外植体接种在促进茎尖生长的改良MS培养基上，置于22_27°C、光照时间 12-14h/d、光照强度800-20001x条件下进行培养2_3周；(4)杀灭内生菌将接种培养后的外植体转至含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基上，继续培 养2-3周，培养条件同步骤(3)；对内生菌进行杀灭。(5)扩繁培养将步骤(4)经内生菌杀灭后无菌的外植体转入丛生芽分化扩繁的改良MS培养基 继续培养一段时间，当茎尖顶芽长到5-8mm后，切取新长出的外植体顶芽约3_5mm转接到丛 生芽分化扩繁的改良MS培养基中进行组培苗的分化和增殖培养，培养条件同步骤(3)，从 组培苗茎基部分化产生出丛生苗；(6)生根培养切取步骤(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生苗转至生根培养基中，置于培养 室进行生根培养，培养条件同步骤(3)；所述改良MS培养基由下列物质组成950mg/L硝酸钾(KN03)、825mg/L硝酸铵 (NH4N03)、185mg/L 硫酸镁(MgS04 7H20)、220mg/L 氯化钙(CaCl2 2H20)、85mg/L 磷酸二 氢钾(KH2P04)、8. 45mg/L 硫酸锰(MnS04 H20)、4. 3mg/L 硫酸锌(ZnS04 7H20)、3. lmg/L 硼 酸(H3B03)、0. 415mg/L 碘化钾(KI)、0. 125mg/L 钼酸钠(Na2Mo04 2H20)、0. 025mg/L 硫酸铜 (CuS04 5H20)、0. 025mg/L 氯化钴(CoCl2 6H20)、50mg/L 肌醇、lmg/L 甘氨酸、0. 5mg/L 盐酸 吡哆醇(VB6)、0. 5mg/L烟酸(VB5)、0. lmg/L盐酸硫胺素_、9. 3lmg/L乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA 2H20)、6. 96mg/L 硫酸亚铁(FeS04 7H20)、30g/L 蔗糖、5. 6g/L 琼脂；所述含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基由下列物质组成在改良MS培养 基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0. 5mg/L孔雀石绿；所述丛生芽分化扩繁的改良MS培养基由下列物质组成在改良MS培养基中加入 2umol/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培养基由下列物质组成在改良MS培养基中加入10 u mol/L 3_吲哚丁 酸(IBA)。所述步骤(1)中切取茎尖1. 5-2. 0cm，用自来水冲洗干净，转入每升滴加0. 2ml洗 洁精的自来水中浸泡漂洗20min，再用自来水冲洗干净。步骤(3)中经表面灭菌后的茎尖外植体需用无菌滤纸吸干表面水分后再用于接 种培养。所述lOOmg/L抗生素AAS含30mg/L青霉素、50mg/L链霉素和125 u g/L两性霉素B，100mg/L抗生素AAS现配现用，AAS和孔雀石绿均过滤除菌后添加。步骤(6)中所述的生根培养所用的丛生苗为经步骤(5)中从组培苗茎基部分化 产生的丛生芽长至5-8mm。所述改良MS培养基、丛生芽分化扩繁的改良MS培养基和生根培养基灭菌前均于 50-60°C下，调节 pH 至 5. 8，且均于 121°C、104kPa 下灭菌 17_20min。所述含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基中的孔雀石绿和抗生素AAS先经
0.22um微孔滤膜过滤除菌，然后再添加到经高温高压灭菌并冷却至50-60°C的改良MS培养基。本发明的有益技术效果体现在以下方面1、由于选取了蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb. ) Trev.]的孢子体茎尖作为外 植体，采用了乙醇、升汞和双氧水配合对外植体表面的微生物进行杀灭，再通过孔雀石绿与 抗生素相结合来杀灭内生菌的方法，获得了 50%左右的无菌外植体，提高了无菌外植体的 得率，有效控制了外植体的褐化和白化，达到了外植体较低的污染率和褐化率的技术效果。2、由于选择了改良MS培养基作为组织培养的基本培养基，并且在22_27°C、光照 时间12-14h/d、光照强度800-20001X条件下培养，外植体褐化轻，实现了茎尖外植体的成 活率高达90 %，生长速度达6-8mm/月，生长良好的技术效果。3、由于选择了改良MS培养基附加2iimol/L 6_苄氨基嘌呤(6-BA)作为丛生芽分 化扩繁培养基，并且在22-27°C、光照时间12-14h/d、光照强度800-20001X条件下培养，实 现了组培苗的分化率达到90%，月增殖倍数达2. 1-3. 5，无褐化，生长效果好的技术效果。4、由于选择了改良MS培养基附加了 lOymol/L 3_吲哚丁酸(IBA)作为生根培养 基，并且在22-27°C、光照时间12-14h/d、光照强度800-20001x条件下培养，实现了丛生苗 的生根率达到100%，根系生长快且生根数达1. 6-3. 4/株，苗生长速率达9. 4mm/月，新叶形 成数达4片/月，生物量增加5. 1倍，丛生苗生长健壮且根系较发达的技术效果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述 而更清楚，但这示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。实施例(1)选择外植体从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子体，切取茎尖
1.5-2. 0cm用自来水冲洗干净，转入每升滴加0. 2ml (2-3滴)洗洁精的自来水中浸泡漂洗 20min，再用自来水冲洗干净后作为组织培养的外植体待灭菌；实验结果表明，采用合适长 度的茎尖作为外植体，褐化轻、易成活。孢子体在植物世代交替的生活史中，产生孢子和具2倍数染色体的植物体。由受 精卵(合子)发育而来。苔藓植物的孢蒴及其附属结构(蒴柄和基足)、蕨类和种子植物的 习见植物体都是孢子体。蛇足石杉孢子体从野外采回后，最多在15_22°C环境中保湿放置7-8天；孢子体放 置时间过长不利于茎尖外植体的灭菌和存活，孢子体采回后宜立即切取茎尖用于灭菌和培养。
(2)杀灭表面菌将洗净后的茎尖在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液30-50s ；接着置于浓度 0. 的升汞(HgCl2)溶液浸泡7-lOmin，再转入浓度7%的双氧水溶液中浸泡10-15min， 最后用无菌水冲洗3-5次，作为蛇足石杉组织培养的外植体；实验结果表明，采用浓度70% 的乙醇溶液、浓度0. 的升汞(HgCl2)和浓度7%的双氧水，表面灭菌效果好，污染率仅为 36%，污染率较低。浓度70%的乙醇溶液、浓度0. 1 %的升汞(HgCl2)溶液和浓度7%的双氧水(H202) 溶液用无菌水配制。(3)接种培养将蛇足石杉组织培养的外植体接种在促进茎尖生长的改良MS培养基上，置于 22-27°C、光照时间12-14h/d、光照强度800-20001x条件下进行培养；实验结果表明，在此 培养基上培养2-3周后，无菌外植体的成活率达90%，褐化轻。改良MS培养基由下列物质组成950mg/L硝酸钾(KN03)、825mg/L硝酸铵 (NH4N03)、185mg/L 硫酸镁(MgS04 7H20)、220mg/L 氯化钙(CaCl2 2H20)、85mg/L 磷酸二 氢钾(KH2P04)、8. 45mg/L 硫酸锰(MnS04 H20)、4. 3mg/L 硫酸锌(ZnS04 7H20)、3. lmg/L 硼 酸(H3B03)、0. 415mg/L 碘化钾(KI)、0. 125mg/L 钼酸钠(Na2Mo04 2H20)、0. 025mg/L 硫酸铜 (CuS04 5H20)、0. 025mg/L 氯化钴(CoCl2 6H20)、50mg/L 肌醇、lmg/L 甘氨酸、0. 5mg/L 盐酸 吡哆醇(VB6)、0. 5mg/L烟酸(VB5)、0. lmg/L盐酸硫胺素_、9. 3lmg/L乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA 2H20)、6. 96mg/L 硫酸亚铁(FeS04 7H20)、30g/L 蔗糖、5. 6g/L 琼脂。(4)杀灭内生菌将接种培养后的外植体转至含0. 5mg/L孔雀石绿和100mg/L抗生素AAS的改良MS 培养基上，于22-27°C、光照时间12-14h/d、光照强度800-20001x条件下继续培养2_3周， 对内生菌进行杀灭；实验结果表明，通过添加杀菌剂到培养基中，再经培养的外植体吸收到 体内后对内生菌进行杀灭，灭菌效果良好，3周后外植体的污染率仅为3%。含0. 5mg/L孔雀石绿和100mg/L抗生素AAS的改良MS培养基，是在上述改良MS 培养基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0. 5mg/L孔雀石绿组成。具体操作如下含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基中的孔雀石绿和抗生素 AAS先经0. 22 y m微孔滤膜过滤除菌，然后再添加到经高温高压灭菌并冷却至50-60°C的改 良MS培养基中。(5)扩繁培养将步骤(4)中经内生菌杀灭后无菌的外植体转入丛生芽分化扩繁的改良MS培养 基继续培养一段时间，当茎尖顶芽长到5-8mm后，切取新长出的外植体顶芽约3_5mm转接到 附加了 2iimol/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的改良MS培养基上，于22_27°C、光照时间12_14h/ d、光照强度800-20001X条件下在培养室中进行丛生芽的分化和增殖培养；实验结果表明， 组培苗的分化率达到90%，月增殖倍数达2. 1-3. 5，无褐化。丛生芽分化扩繁的改良MS培养基，是在上述改良MS培养基中加入2 ii mo 1 /L 6_苄氨基嘌呤(6-BA)组成的。(6)生根培养切取(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生苗转至生根培养基中，于22_27°C、光
7照时间12-14h/d、光照强度800-20001X条件下在培养室中进行生根培养；实验结果表明， 丛生苗的生根率达到100%，根系生长快且生根数达1. 6-3. 4/株，苗生长速率达9. 4mm/月， 新叶形成数达4片/月，生物量增加5. 1倍，丛生苗生长健壮且根系较发达。生根培养基是在上述改良MS培养基中加入10 u mol/L 3_吲哚丁酸(IBA)组成 的。上述改良MS培养基、丛生芽分化扩繁的改良MS培养基和生根培养基灭菌前均于 50-60°C下，调节 pH 至 5. 8，且均于 121°C、104kPa 下灭菌 17_20min。
权利要求
一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于包括以下步骤(1)选择外植体从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子体，切取茎尖，经自来水冲洗干净；(2)杀灭表面菌将洗净的茎尖在超净台中先浸入浓度70％的乙醇溶液30 50s；接着置于浓度0.1％的升汞(HgCl2)溶液浸泡7 10min，再转入浓度7％的双氧水(H2O2)溶液中浸泡10 15min，最后用无菌水冲洗3 5次，作为蛇足石杉组织培养的外植体；(3)接种培养将所述外植体接种在促进茎尖生长的改良MS培养基上，置于22 27℃、光照时间12 14h/d、光照强度800 2000lx条件下进行培养2 3周；(4)杀灭内生菌将接种培养后的外植体转至含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基上，继续培养2 3周，培养条件同步骤(3)；对内生菌进行杀灭。(5)扩繁培养将步骤(4)经内生菌杀灭后无菌的外植体转入丛生芽分化扩繁的改良MS培养基继续培养一段时间，当茎尖顶芽长到5 8mm后，切取新长出的外植体顶芽约3 5mm转接到丛生芽分化扩繁的改良MS培养基中进行组培苗的分化和增殖培养，培养条件同步骤(3)，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗；(6)生根培养切取步骤(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生苗转至生根培养基中，置于培养室进行生根培养，培养条件同步骤(3)；所述改良MS培养基由下列物质组成950mg/L硝酸钾(KNO3)、825mg/L硝酸铵(NH4NO3)、185mg/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、220mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、85mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、8.45mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、3.1mg/L硼酸(H3BO3)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.025mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、50mg/L肌醇、1mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)、0.5mg/L烟酸(VB5)、0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA·2H2O)、6.96mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、30g/L蔗糖、5.6g/L琼脂；所述含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基由下列物质组成在改良MS培养基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0.5mg/L孔雀石绿；所述丛生芽分化扩繁的改良MS培养基由下列物质组成在改良MS培养基中加入2μmol/L 6 苄氨基嘌呤(6 BA)；所述生根培养基由下列物质组成在改良MS培养基中加入10μmol/L 3 吲哚丁酸(IBA)。
2.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于所述步骤(1) 中切取茎尖1. 5-2. 0cm，用自来水冲洗干净，转入每升滴加0. 2ml洗洁精的自来水中浸泡漂 洗20min，再用自来水冲洗干净。
3.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于步骤(3)中经表面灭菌后的茎尖外植体需用无菌滤纸吸干表面水分后再用于接种培养。
4.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于所述100mg/L 抗生素AAS含30mg/L青霉素、50mg/L链霉素和125 u g/L两性霉素B，100mg/L抗生素AAS 现配现用，AAS和孔雀石绿均过滤除菌后添加。
5.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于步骤(6)中 所述的生根培养所用的丛生苗为经步骤(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生芽长至 5-8mm 。
6.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于所述改良MS培 养基、丛生芽分化扩繁的改良MS培养基和生根培养基灭菌前均于50-60°C下，调节pH至 5. 8，且均于 121°C、104kPa 下灭菌 17_20min。
7.根据权利要求1所述的一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于所述含孔雀石 绿和抗生素AAS的改良MS培养基中的孔雀石绿和抗生素AAS先经0. 22 y m微孔滤膜过滤 除菌，然后再添加到经高温高压灭菌并冷却至50-60°C的改良MS培养基。
全文摘要
本发明公开了一种蛇足石杉组织培养的方法。该方法包括选择外植体、杀灭表面菌、接种培养、杀灭内生菌、扩繁培养和生根培养操作步骤。蛇足石杉是一种珍贵的药用蕨类植物，对生境要求苛刻，在自然条件下生长缓慢、生产周期长，常规方法繁殖系数和生物量低，无法满足药品生产的需要。本发明使蛇足石杉试管苗的分化率达到90％，月增殖倍数达2.1-3.5，生根率达到100％，根系生长快且生根数达1.6-3.4/株，再生苗生长健壮且根系较发达。本发明方法简便易行，效率高，有效地抑制了蛇足石杉外植体的污染和褐化，促进了外植体的存活生长，成本低，为实现蛇足石杉的人工大量栽培提供了重要的技术支持。
文档编号A01H4/00GK101889551SQ201010252709
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者杨雪飞, 梁昊, 罗建平 申请人:合肥工业大学