专利名称：人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物细胞技术领域，具体涉及一种能用于从人表皮细胞分离得到人表 皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基和分离得到的人表皮源性间充质干细胞样 多能细胞及其制备方法。
背景技术：
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于材料来源困难、伦理问 题和异种(异体)免疫排斥反应等原因，不容易被应用到临床。成体干细胞存在于成体各 种组织中。由于其材料来源广泛，可实施自体细胞移植，故在临床疾病治疗中有着广泛的应 用前景。目前国内外分离成功的成体干细胞有间充质干细胞、表皮干细胞、神经干细胞、脂 肪干细胞和胰岛干细胞等。但目前报道的这些成体干细胞要么生长速度缓慢，要么扩增代 数有限，都不能在较短时间内(三个月)获得临床疾病治疗所需要的巨额细胞数。这也是 目前妨碍成体干细胞应用到临床的瓶颈之一。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞的细胞培养基，该细胞培养基还可以用于人表皮源性间充质干细胞样 多能细胞的传代培养。本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的 细胞培养基为在葡萄糖含量为0. 5 5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、 非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积 分数为 10 25%、1 40ng hbFGF/mL、0. 1 20ng hSCF/mL、0. 1 2mL 100X 非必须氨基 酸/100mL、0. 1 2mL含质量分数为3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000 8000U 庆大霉素/100mL。本发明的DMEM培养基是公知的培养基，葡萄糖、胎牛血清、hbFGF(人碱性成纤细 胞生长因子)、hSCF (重组干细胞因子)、100X的非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、PBS溶液以及 庆大霉素都属于现有技术的产品，要么能够根据现有技术配置，要么能够从试剂公司购买 到。本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的 细胞培养基的配制方法是在DMEM培养基中加入葡萄糖，搅拌均勻，使其终浓度为0. 5 5g/L，形成一级基础培养基。然后在一级基础培养基中添加胎牛血清，hbFGF、hSCF、非必 须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积分数 为 10 25%、1 40ng hbFGF/mL、0. 1 20ng hSCF/mL、0. 1 2mL 100X 非必须氨基酸 /100mL、0. 1 2mL含质量分数为3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000 8000U庆 大霉素/lOOmL，搅拌均勻后而制得能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞的细胞培养基。所述的含质量分数为3% L-谷氨酰胺的PBS溶液是在每IOOmL的PBS溶液中加入3g的L-谷氨酰胺。本发明的第二个目的是提供一种利用本发明的细胞培养基制备人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞的方法及其制备出的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤a)将人表皮细胞在上述细胞培养基中培养；b)然后用消化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干 细胞样细胞，即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。该人表皮源性间充质干细胞样多能细胞在体外条件下进行传代培养，因此本发明 的第三个目的是提供本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的传代培养方法，该方 法为以本发明的细胞培养基作为传代培养基，于36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度下 进行传代培养，而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株。本发明的人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞生长速度快，隔1 4天就可以1 3的比例传代一次，可在3个月内 传30代以上，且至少可以从每个临床废弃的皮肤标本从约3 X IO4个细胞开始三个月内获 得2X1016个新的成体干细胞。所述的人表皮细胞的优选获取方法是取包皮或其他皮肤组织，用II型组织酶消 化获得表皮，将表皮剪碎，再用胰蛋白酶进一步消化，获得表皮细胞。所述的人表皮细胞在上述细胞培养基中培养，优选培养条件为36士 1°C、5士 CO2,90 100%湿度，每隔2-3天更换细胞培养基。所述的b)步骤优选为当细胞生长至60 90%融合度时，用质量分数为0.25%的 胰蛋白酶与质量分数为0.02%的EDTA溶液按照体积比1 1混合而形成的消化液消化，祛 除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞样细胞，即为人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞。将本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞(见图1、2)用常规的方法制备 染色体涂片，进行核型检查核型为正常男性46条染色体，带型正常(见图3、4)。使用流式细胞术和免疫组化技术检测本发明的人表皮源性间充质干细胞样多 能细胞株的表面标志(检测方法是公知技术，商业试剂公司可提供试剂盒，按照试剂 公司提供的技术方案实施即可)，其表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志 CD73 (93. 5 99. 8% )、CD90(63. 4 99. 7% )、CD105(20. 3 92. 8% ) ,Vimentin (51. 3 96.7% )和Nestin(74. 2 98.4% )，如图5所示，阳性的细胞呈棕色或棕黑色；不表达 或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血液细胞和血管内皮细胞标志i3-IIItubulin(0 18. 7% )、MAP-2 (0 3. 2% )、GFAP (0 7. 2% )、CK19(0 1. 0% )、CD34 (0 1. 3% )、 CD45(0 0. 5%)、CD3(0 1. 1 % )、CD19 (0 0. 5% )、CD16 (0 0. 7%)、CD4(0 0. 5%), CD8 (0 0. 7% )、CD31(0 5. 8% )、VEGF-R2 (0 5. 5% )和 CDlO (0. 2 18. 2% )。用无血清神经干细胞培养基(购自GIBCO公司)培养本发明的人表皮源性间充质 干细胞样多能细胞株6天，再改用添加胎牛血清至终体积分数为10%的神经干细胞培养基 (购自GIBCO公司)培养7天，镜检发现，细胞已形成神经细胞样的细长突起(见图6)。激光 共聚焦显微镜观察技术检测细胞表面标志(检测方法是公知技术，商业试剂公司可提供试 剂盒，按照试剂公司提供的技术方案实施即可)，发现其表达神经细胞特异性标志MAP-2、β -IIItubulin,阳性的细胞呈红色荧光(见图7，蓝色为细胞核Hochest染色，红色为标记 红色荧光单抗染色，由于图7是黑白图，蓝色的细胞核呈椭圆状，而红色荧光呈点状)。由此 可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株能分化为神经样细胞。用免疫细胞培养基(购自GIBCO公司)培养本发明的人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞株，7天后，镜检形态观察发现，细胞形成了分泌泡，细胞内外存在多量的折光 性强的圆形小泡(见图8)。用流式细胞术检测其表达免疫细胞特异性标志的量增加，如 CD19(1. 7 11. 3% )、CD16(1. 3 5. 4% )、CD4(7. 3 14. 5% )、CD8 (4. 2 8. 1 % )。由 此可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株能分化成免疫细胞样细胞。以每个胚胎4 8个本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的量注射入小 鼠囊胚腔内制作嵌合体小鼠(常规制作方法)，经PCR技术、人Y染色体原位杂交技术以及 抗人单抗免疫荧光激光共聚焦显微镜观察技术检测发现(检测方法是公知技术，商业试剂 公司可提供试剂盒，按照试剂公司提供的技术方案实施即可)，在嵌合体小鼠血液中存在人 Y染色体以及人CD19等蛋白。如图9 (PCR电泳图)所示PCR技术检测到在10号和11号 嵌合体小鼠(约5. 5月龄)血液中存在人Y染色体标志性基因SRY基因(10和11泳道)； 如图10 (人Y染色体原位杂交技术以及抗人单抗免疫荧光激光共聚焦显微镜观察技术检测 图)所示10号嵌合体小鼠(约5. 5月龄)血液中存在的人Y染色体(图IOA和D中的红 色点，即图IOA中箭头所指的部分)和人标志性蛋白CD19(图IOB和D中的绿色荧光点)。 由此可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞在5个月内可以在嵌合体小鼠体 内存活、迁移和分化。流式细胞术和免疫缺陷小鼠体内移植实验检测(常规方法)发现 HLA-DR(0 1. 3% )低表达或不表达和HLA-I (0. 1 61. )低表达或中度表达；以每只 鼠约IXlO7个将细胞经腹腔注射和皮下注射入SCID小鼠体内3个月后无发现肿瘤产生。 由此表明本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞生物安全性良好。综上所述，本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞具有间充质干细胞样的 表形、核型正常，能够表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志，不表达或低表达终 末神经细胞、表皮细胞、血液细胞和血管内皮细胞的特异性标志，能够分化为神经细胞样细 胞和免疫细胞样细胞，生物安全性良好。利用本发明提供的细胞培养基，按照本发明的分离方法，可从人表皮细胞中分离 得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞，该人表皮源性间充质干细胞样多能细胞生物安 全性良好，能够分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞，具有在神经系统损伤修复、免疫 系统疾病治疗和异种器官构建的应用潜能。本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 生长速度快，在本发明的体外传代培养条件下，可在短时间内(三个月内)至少可以传代30 代，每个临床废弃的皮肤标本从约3 X IO4个细胞开始最终至少可以获得2 X IO16个细胞，足 以满足临床疾病治疗和构建组织工程化器官所需。
图1和图2是人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株的普通光学形态图，类似间 充质干细胞的表形；图3和图4是本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株的染色体涂片的带 型图5是应用流式细胞术和免疫组化技术检测本发明的人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志图；图6是显微镜下观察本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞分化为神经 细胞样细胞图；图7是激光共聚焦显微镜观察技术检测细胞表达神经细胞特异性标志MAP-2、 β -IIItubulin的图；图7A是细胞核Hochest染色(蓝色)，图7B是细胞体红色荧光标记 单抗染色、图7C是图7A和图7B的重叠图。图8是显微镜下观察本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞分化为免疫 细胞样细胞的图；图9是对嵌合体小鼠的血液经PCR技术检测的电泳图，其中M =Marker,H20 水、N 正常鼠外周血(阴性对照)、6 6号嵌合体小鼠外周血、7 7号嵌合体小鼠外周血、8 8号嵌 合体小鼠外周血、9 9号嵌合体小鼠外周血、10 10号嵌合体小鼠外周血、11 11号嵌合体 小鼠外周血、P 人表皮源性间充质干细胞样多能细胞(阳性对照)；图10是应用Y染色体原位杂交技术以及抗人单抗免疫荧光共聚焦显微镜观察技 术检测嵌合体小鼠血液的图；图IOA是人Y染色体原位杂交图(红色点代表人Y染色体)、 图IOB是绿色荧光标记的人CD19单抗共聚焦显微镜观察图(绿色代表人CD19蛋白)、图 IOC是细胞核Hochest染色(蓝色)、图IOD是图10A、图IOB和图IOC的重叠图。经重叠后 可见人Y染色体位于细胞核内，人CD19蛋白位于细胞体上。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例11.配制细胞培养基在葡萄糖含量为0. 5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨 基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使上述各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积分数 为 10%、40ng hbFGF/mL、0. Ing hSCF/mLUmL 100X 非必须氨基酸/100mL、2mL 含质量分数 为3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000U庆大霉素/100mL。由此而形成本实施例的 细胞培养基。所述的100X的非必须氨基酸购自购自GIBCO公司，其货号为11140。2.获取表皮组织和表皮细胞取临床废弃的包皮组织，浸泡在含1000U庆大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存；4 小时内进行如下处理用PBS充分洗涤，祛除血细胞，剪去皮下疏松结缔组织，用II型组织 酶(2U/mL)浸泡消化过夜，获得表皮，然后将表皮剪碎，用质量分数为0. 25%的胰蛋白酶进 一步消化30分钟，获得表皮细胞，用PBS洗涤，然后离心祛除消化酶，用本实施例的细胞培 养基重新悬浮细胞。3.培养表皮细胞将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶3 4个中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度培养箱内进行培养，隔2 3天更换细胞培养基。4.筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细胞
当细胞生长至60 90%的融合度时，用质量分数为0. 25%的胰蛋白酶加质量分 数为0. 02%的EDTA(按体积比1 1混合)组成的消化液进行分段消化；收集消化下来的 间充质干细胞样细胞，祛除未消化下来的表皮细胞；将收集到的间充质干细胞样细胞置于 离心管内，1000 1500rpm、5min离心祛除消化液；然后用本实施例的细胞培养基重新悬浮 细胞，该细胞即为本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞，将该细胞进行计数。5.体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞以约1 X105f/mL的密度接种 于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%湿度培 养箱内进行培养，隔1 4天，以1 3比例传代一次，直至30代以上，而获得人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞株。每个临床废弃的皮肤标本获得的细胞三个月内至少传代30 代以上，从约3 X IO4个细胞最终至少获得2X IO16个新的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞。对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株进行检测发现，该细胞株具 有间充质干细胞样的表形，核型正常，表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表达或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血液细 胞和血管内皮细胞标志β -III tubulin、MAP-2、GFAP、CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10 ；能分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞；HLA-DR低 表达或不表达和HLA-I低表达或中度表达。以每只鼠约1 X IO7个将细胞经腹腔注射和皮 下注射入SCID小鼠体内3个月后没有发现肿瘤产生。由此表明本发明人表皮源性间充质 干细胞样多能细胞株生物安全性良好。实施例21.配制细胞培养基在葡萄糖含量为5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基 酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使上述各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积分数为 25%Ung hbFGF/mL、20ng hSCF/mL、2mL 100X 非必须氨基酸/100mL、0. ImL 含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和8000U庆大霉素/100mL。由此而形成本实施例的细 胞培养基。所述的100X的非必须氨基酸购自购自GIBCO公司，其货号为11140。2.获取表皮组织和表皮细胞取临床废弃的包皮组织，浸泡在含1000U庆大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存；4 小时内进行如下处理用PBS充分洗涤，祛除血细胞，剪去皮下疏松结缔组织，用II型组织 酶(2U/mL)浸泡消化过夜，获得表皮，然后将表皮剪碎，用质量分数为0. 25%的胰蛋白酶进 一步消化30分钟，获得表皮细胞，用PBS洗涤，然后离心祛除消化酶，用本实施例的细胞培 养基重新悬浮细胞。3.培养表皮细胞将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶3 4个中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度培养箱内进行培养，隔2 3天更换细胞培养基。4.筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细胞当细胞生长至60 90%的融合度时，用质量分数为0. 25%的胰蛋白酶加质量分数为0.02%的EDTA(按体积比1 1混合)组成的消化液进行分段消化；收集消化下来的 间充质干细胞样细胞，祛除未消化下来的人表皮细胞；将收集到的间充质干细胞样细胞置 于离心管内，1000 1500rpm、5min离心祛除消化液；然后用本实施例的细胞培养基重新悬 浮细胞，该细胞即为本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞，将该细胞进行计数。5.体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞以约1 X105f/mL的密度接种 于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%湿度培 养箱内进行培养，隔1 4天，以1 3比例传代一次，直至30代以上，而获得人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞株。每个临床废弃的皮肤标本获得的细胞三个月内至少传代30 代以上，从约3 X IO4个细胞最终至少获得2X IO16个新的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞。对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株进行检测发现，该细胞株具 有间充质干细胞样的表形，核型正常，表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表达或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血液细 胞和血管内皮细胞标志β -III tubulin、MAP-2、GFAP、CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10，能分化神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞。HLA-DR低表 达或不表达和HLA-I低表达或中度表达，以每只鼠约1 X IO7个将细胞经腹腔注射和皮下注 射入SCID小鼠体内3个月后没有发现肿瘤产生，由此表明本发明人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞生物安全性良好。实施例31.配制细胞培养基在葡萄糖含量为2. 5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基 酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使上述各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积分数为 18%,20ng hbFGF/mLUOng hSCF/mL、0. ImL 100X 非必须氨基酸/100mL、ImL 含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和4000U庆大霉素/100mL。由此而形成本实施例的细 胞培养基。所述的100X的非必须氨基酸购自购自GIBCO公司，其货号为11140。2.获取表皮组织和表皮细胞取临床废弃的人包皮组织，浸泡在含1000U庆大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存； 4小时内进行如下处理用PBS充分洗涤，祛除血细胞，剪去皮下疏松结缔组织，用II型组 织酶(2U/mL)浸泡消化过夜，获得表皮，然后将表皮剪碎，用为质量分数为0. 25%胰蛋白酶 进一步消化30分钟，获得表皮细胞，用PBS洗涤，然后离心祛除消化酶，用本实施例的细胞 培养基重新悬浮细胞。3.培养表皮细胞将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶3 4个中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度培养箱内进行培养，隔2 3天更换细胞培养基。4.筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细胞当细胞生长至60 90%的融合度时，用质量分数为0. 25%的胰蛋白酶加质量分 数为0. 02%的EDTA(按体积比1 1混合)组成的消化液进行分段消化；收集消化下来的间充质干细胞样细胞，祛除未消化下来的表皮细胞；将收集到的间充质干细胞样细胞置于 离心管内，1000 1500rpm、5min离心祛除消化液；然后用本实施例的细胞培养基重新悬浮 细胞，该细胞即为本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞，将该细胞进行计数。5.体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞以约1 X105f/mL的密度接种 于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%湿度培 养箱内进行培养，隔1 4天，以1 3的比例传代一次，直至30代以上，而获得人表皮源 性间充质干细胞样多能细胞株。每个临床废弃的皮肤标本获得的细胞三个月内至少传代30 代以上，从约3 X IO4个细胞最终至少获得2X IO16个新的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞。对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株进行检测发现，该细胞株具 有间充质干细胞样的表形，核型正常，表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表达或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血液细 胞和血管内皮细胞标志β -Illtubulin、MAP-2、GFAP, CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10，能分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞。HLA-DR低 表达或不表达和HLA-I低表达或中度表达，以每只鼠约1 X IO7个将细胞经腹腔注射和皮下 注射入SCID小鼠体内3个月后没有发现肿瘤产生，由此表明本发明人表皮源性间充质干细 胞样多能细胞生物安全性良好。
权利要求
一种细胞培养基，其特征在于在葡萄糖含量为0.5～5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基酸、L 谷氨酰胺、庆大霉素，并使上述各种添加成分的终浓度如下胎牛血清体积分数为10～25％、1～40ng hbFGF/mL、0.1～20ng hSCF/mL、0.1～2mL 100X非必须氨基酸/100mL、0.1～2mL含质量分数为3％L 谷氨酰胺的PBS溶液/100mL和1000～8000U庆大霉素/100mL。
2.—种人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a)将人表皮细胞在权利要求1所述的细胞培养基中培养；b)然后用消化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞 样细胞，即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。
3.根据权利要求2所述的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征在 于，所述的步骤a)的人表皮细胞的获取方法为取包皮或其他皮肤组织，用II型组织酶消 化获得表皮，将表皮剪碎，再用胰蛋白酶进一步消化，获得人表皮细胞。
4.根据权利要求2所述的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征 在于，所述的步骤a)中人表皮细胞在权利要求1所述的细胞培养基中培养，培养条件为 36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度，每隔2-3天更换细胞培养基。
5.根据权利要求2所述的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征在 于，所述的步骤b)的具体步骤为当细胞生长至60 90%融合度时，用质量分数为0. 25% 的胰蛋白酶与质量分数为0.02%的EDTA溶液按照体积比1 1混合而形成的消化液消化， 祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞样细胞，即为人表皮源性间 充质干细胞样多能细胞。
6.根据权利要求2所述的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法制备的人 表皮源性间充质干细胞样多能细胞。
7.一种将权利要求6所述的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞进行传代培养的方 法，其特征在于，传代培养的条件为，以权利要求1所述的细胞培养基作为传代培养基，于 36士 1°C、5士 C02、90 100%湿度下进行传代培养，而获得人表皮源性间充质干细胞样 多能细胞株。
全文摘要
本发明公开一种细胞培养基和人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法。该培养基为在葡萄糖含量为0.5～5g/l的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使其终浓度为胎牛血清体积分数为10～25％、1～40ng hbFGF/ml、0.1～20ng hSCF/ml、0.1～2ml 100X非必须氨基酸/100ml、0.1～2ml含质量分数为3％l-谷氨酰胺的PBS溶液/100ml和1000～8000U庆大霉素/100ml。将人表皮细胞在上述细胞培养基中培养，用消化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞样细胞，经体外培养传代后即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株。该多能细胞株生物安全性良好，能分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞，具有在神经系统损伤修复、免疫系统疾病治疗和异种器官构建的应用潜能。
文档编号C12N5/0775GK101948803SQ201010282388
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者葛坚, 黄冰 申请人:中山大学中山眼科中心