组织剪掉；
步骤三:剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成l_3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37°C培养箱中消化15h ；
步骤四:用100mlPBS (磷酸盐缓冲液)稀释后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞；
步骤五:弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；
步骤六:使用添加有5%组成为:6%结合蛋白；1.5%生长因子；1.5% (组氨酸:脯氨酸3:1); 0.07%固醇类激素；0.5%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 I:1:1:1):维生素 C:维生素 D:维生素 E I:1:1:1]； 0.03% (铁:锌:钼:钴 2:2:1:1); 1.5%粘附因子；87.4%去离子水的血清替代物的MEM- α培养基重悬细胞并接种于1cm细胞培养皿中，于37°C、体积分数为5%C02培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；
步骤七:待细胞扩增至3-6X 17个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为:以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，结束后放入液氮中冻存。
[0011]实施例三
一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，包括以下步骤:
步骤一:用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；
步骤二:用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉；
步骤三:剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成l_3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37°C培养箱中消化15h ；
步骤四:用100mlPBS (磷酸盐缓冲液)稀释后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞；
步骤五:弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；
步骤六:使用添加有5%组成为:5%结合蛋白；1%生长因子；1% (组氨酸:脯氨酸3:1);0.05%固醇类激素；0.3%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 I:1:1:1):维生素C:维生素D:维生素E 1:1:1:1】;0.02% (铁:锌:钼:钴2:2:1:1 );1%粘附因子；91.63%去离子水血清替代物的MEM-α培养基重悬细胞并接种于1cm细胞培养皿中，于37°C、体积分数为5%C02培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；
步骤七:待细胞扩增至3-6X 17个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为:以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，结束后放入液氮中冻存。
【主权项】
1.一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一:用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中； 步骤二:用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉留婴儿面备用; 步骤三:剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成l_3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37°C培养箱中消化15h备用； 步骤四:用100mlPBS稀释步骤三消化液后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞备用； 步骤五:弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞； 步骤六:使用添加有5%组成为:3%-6%结合蛋白；0.5%-1.5%生长因子；0.5%-1.5% (组氨酸:脯氨酸3:1) ；0.03%-0.07%固醇类激素;0.1%-0.5%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 1:1:1:1):维生素C:维生素D:维生素E 1:1:1:1】；0.01%_0.03% (铁:锌:钼:钴2:2:1:1) ；0.5%-1.5%粘附因子；87.4%_95.36%去离子水的血清替代物MEM-α培养基重悬细胞并接种于1cm细胞培养皿中，于37°C、体积分数为5%C02培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养； 步骤七:待细胞扩增至3-6X 17个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为:以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，结束后放入液氮中冻存。
2.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为:3%结合蛋白；0.5%生长因子；0.5%非必须氨基酸(组氨酸:脯氨酸3:1) ;0.03%固醇类激素；0.1%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12I:1:1:1):维生素 C:维生素 D:维生素 E I:1:1:1] ；0.01% (铁:锌:钼:钴 2:2:1:1)；0.5%粘附因子；95.36%去尚子水。
3.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为:6%结合蛋白；1.5%生长因子；1.5% (组氨酸:脯氨酸3:1); 0.07%固醇类激素；0.5%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 1:1:1:1):维生素C:维生素D:维生素E I:1:1:1] ； (λ 03% (铁:锌:钼:钴2:2:1:1) ; 1.5%粘附因子；87.4%去尚子水。
4.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为:5%结合蛋白；1%生长因子；1% (组氨酸:脯氨酸3:1);0.05%固醇类激素；0.3%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 I:1:1:1):维生素C:维生素D:维生素E 1:1:1:1】;0.02% (铁:锌:钼:钴2:2:1:1 );1%粘附因子；91.63%去离子水。
【专利摘要】本发明涉及一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法；针对现有常用的PMSCs分离方法中存在的问题与缺陷，其解决问题的技术方案包括以下步骤：一：用大镊子取出胎盘将胎盘切割；二：剥离胎盘母体面和婴儿面；三：胎盘绒毛消化；四：用1000mlPBS稀释消化液，过滤离心收集细胞备用；五：用PBS重悬细胞，离心沉淀细胞；六：细胞传代培养；七：细胞冻存，本发明中用胶原酶I一步消化法分离PMSCs，能够减少操作步骤，减轻细胞损伤，有效提高目的细胞所占的比例，减少其他细胞的污染；从而缩短了细胞原代培养时间并使细胞纯度得到提高，能够大幅降低成本并能很好维持PMSCs原始状态，为PMSCs的大量制备以及将来广阔的临床应用打下了坚实的基础。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104726403
【申请号】CN201510120369
【发明人】王娟, 李乔丽, 芦俊萍, 刘瑾, 冯利娜, 赵靖, 张文丽, 尹珊
【申请人】河南中科干细胞基因工程有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月19日