金黄地鼠肾原代细胞培养液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种金黄地鼠肾原代细胞培养液。
【背景技术】
[0002] 原代细胞是指从生物体(通常指人体器官或组织以及小鼠、大鼠、兔子、狗和家禽 等动物器官和组织）取出后立即培养的细胞，也有人将培养的第一代与传五代以内的细胞 统称为原代细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，还可以 应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等，在 生物医药领域有着不可替代的作用，市场前景非常广阔。
[0003] 原代细胞培养是指将从动物机体内取出的器官或组织经各种酶(常用胰蛋白酶)、 螯合剂（常用m)TA)或机械方法处理后分散成单细胞，再置于合适的培养基中培养，使细胞 得以生存、生长和繁殖的过程。
[0004] 细胞培养基是人工模拟细胞在生物体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进 细胞生长增殖的物质基础。培养液和培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当为粉剂 时，倾向性的称为培养基，将粉剂配制成液体后，多称为培养液，培养液中常常补加血清、抗 生素等成分。
[0005]天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体 液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。虽营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定， 来源也受到限制。
[0006] 无血清细胞培养基是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成不含有任 何动物组分。由于技术原因，目前仍无法完全模拟天然血清的营养成分。当前市售的无血 清培养基多针对传代细胞设计，如杂交瘤细胞无血清培养基、CH0细胞无血清培养基、Vero 细胞无血清培养基和NS0细胞无血清培养基等。
[0007] 合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖 类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。合成细胞培养基是目前生物行业内使用最广泛的培 养基。自1950年199细胞培养基问世以来，合成细胞培养基发展至今已有几十种。由于 细胞种类和培养条件不同，合成的细胞培养基成分也不同，在动物细胞培养中最常用的基 础细胞培养基就有6~7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、PRMI1640、199等，其培养效果也各 有优劣。
[0008] 由于天然培养基的确切成分无法完全解析，导致重复性差，批间差异大，产品质量 不稳定。目前市场上用于细胞培养的主要为各种合成培养基，即通过人为地加入一些营养 物质(有机的和无机的)、维生素、盐、〇2和〇)2气体、血清蛋白、碳水化合物、辅因子等制备的 合成培养基。
[0009] 不同的人工培养基被分别设计用于不同的用途，按照细胞特性主要分为基础全系 培养基、适用于传代细胞的培养基和适用于原代细胞的培养基。
[0010] 虽然原代细胞的用途很多，但原代细胞的培养条件却最为苛刻。如狂犬疫苗生产 中所用的金黄地鼠肾原代细胞培养时，使用现有的培养基经常出现细胞贴壁时间长、生长 速率慢，形态差，活性降低，易老化，缓冲系统不稳定引起的pH值变化大等现象；特别是当 原代细胞做传代培养时，细胞活性和增殖能力逐代降低，导致培养失败。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种能更好的促进原代细胞生长，尤其是满足当前疫苗生 产中大规模原代细胞培养的金黄地鼠肾原代细胞培养液。
[0012] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，所述培养液的组分包括Hanks'平衡盐溶 液、水解乳蛋白、L-谷氨酰胺、L-盐酸半胱氨酸、新生牛血清、硫酸庆大霉素/卡那霉素；其 配制过程如下： 第一步，配制Hanks'平衡盐溶液 取Hanks'平衡盐，加注射用水，充分溶解后得到Hanks'平衡盐溶液备用； 第二步，配制营养液 按比例称量水解乳蛋白90份，L-谷氨酰胺4份，L-盐酸半胱氨酸1. 9份，用注射用水 将其充分溶解后得到营养液备用； 第三步，配制培养液 将第一步配制的Hanks'平衡盐溶液和第二步配制的营养液按比例分别在无菌状态下 过滤到配液罐中，然后将新生牛血清75~120份和硫酸庆大霉素溶液/卡那霉素溶液6份分 别过滤至配液罐中，添加注射用水定容，搅拌均匀后即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。
[0013] 所用注射用水的温度为31~37°C。
[0014] 所述第一步中配制的Hanks'平衡盐溶液为5~20倍浓缩液，最好为10倍浓缩液； 所述第二步中配制的营养液为5~15倍浓缩液，最好为10倍浓缩液。
[0015] 第三步中的新生牛血清的浓度为7. 5-12%，其最佳浓度为8. 5%。
[0016] 第三步中如果添加硫酸庆大霉素溶液，则其终浓度为20~30IU/ml，其最佳值为24 IU/ml;如果添加卡那霉素溶液，则其终浓度为40~50IU/ml，其最佳值为45IU/ml。
[0017] 本发明的优点在于配制方法简单，配制的成品培养液能更好的促进金黄地鼠肾原 代细胞的生长，细胞贴壁时间快，形态好，细胞增殖迅速，活力旺盛。
【具体实施方式】
[0018] 下面以配制100L培养液为例对本发明做更加详细的说明。
[0019] 实施例1 一、培养液的配制 第一步，配制Hanks'平衡盐溶液 取Hanks'平衡盐2包（497. 5g/包)，倒入盛有8L注射用水(温度为31~37°C)的15L瓶中，边倒边摇动，每袋再用100~200ml的注射用水两次冲洗袋内残留粉剂，冲洗水也倒 入15L瓶中，然后补加注射用水至10L，盖上硅胶塞摇晃至充分溶解即可得到10倍浓缩的 Hanks'平衡盐溶液； 第二步，配制营养液 在称量台内用电子天平准确称量水解乳蛋白900g，L-谷氨酰胺40g，L-盐酸半胱氨酸 19g，经复核无误后，依次倒入装有15L注射用水的50L容器中，补加注射用水至20L，轻摇使 之完全溶解，得到10倍浓缩的营养液； 第三步，配制培养液 无菌操作分别将第一步配制的Hanks'平衡盐溶液10L，第二步配制的营养液10L，浓度 8. 5%的新生牛血清8. 5L和终浓度24IU/ml的硫酸庆大霉素溶液0. 6L打入配液罐中，补加 无菌注射用水定容至100L。物料全部转移完毕后，保持转速30~50r/min搅拌20~30分钟， 使之混合均匀，即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。
[0020] 实际配制时，终浓度24IU/ml的硫酸庆大