间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及利用间充质干细胞诱导转化为胰岛细胞 的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细 胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖 尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛 细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难 极大的限制了这种疗法的应用。
[0003] 干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干 细胞分为全能干细胞（如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞）、多能干细胞胞（具 有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等）和专能干细胞（维持某一 特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等）。干细胞技术的不断突破及干细胞 本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的 各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉 及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性 肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于 人羊水、脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优 点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的 作用。
[0004] 对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗I型糖尿 病的理想策略之一。目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多米用贴壁诱导的方 式。因间充质干细胞有较强的贴壁性，在诱导过程中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍 较低，且诱导后获得的胰岛样细胞的细胞活性较低、活细胞比率低、胰岛细胞不够成熟等问 题。而二步法或者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残留 因子种类繁多，间充质干细胞诱导率低，获得的胰岛细胞数量较少，且不够成熟，增加了临 床应用的风险。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中诱导间充质干细胞转化成胰岛细 胞存在诱导率低、胰岛细胞活性低，不成熟等缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞转化为 胰岛细胞的转化率以及提高胰岛细胞活性的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种间充质干细胞转化为胰岛细胞 的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 取间充质干细胞进行培养；
[0008] 在培养的过程中用诱导液进行诱导；
[0009] 其中，所述诱导液为尼克酰胺和/或0 _细胞调节素。
[0010] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用诱导 液进行诱导中，尼克酰胺的浓度为5-20ng/ml;
[0011] 和/或0 -细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。
[0012] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中还包括 HGF，且HGF的浓度为 5-20ng/ml。
[0013] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用所述 诱导液进行诱导处理步骤之前，还需将间充质干细胞用预诱导剂进行预诱导；
[0014] 所述预诱导处理过程中，预诱导剂包括EGF、bFGF、银杏提取液和FCS。
[0015] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述预诱导剂中EGF的 浓度为5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质 量分数为2-10%。
[0016] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述预诱导时间为2-4 天。
[0017] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用所述 诱导液进行诱导处理步骤中，诱导时间为4-7天。
[0018] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，取所述间充质干细胞进 行培养过程中，采用的培养基为基础培养基。
[0019] 在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述基础培养基为頂DM 培养基或DMEM培养基。
[0020] 实施本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，可以达到以下有益效 果：该方法不仅易操作，而且所获得胰岛细胞数量较多，活性和成熟度较强，能够分泌较多 的胰岛素。
【附图说明】
[0021] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0022] 图1为通过本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法得到的胰岛细胞， 用PCR进行mRNA检测的电泳条带示意图。
【具体实施方式】
[0023] 为解决现有技术中利用间充质干细胞转化的胰岛细胞较少，且胰岛细胞活性低， 不成熟等缺陷，本发明的创新点在于提供一种诱导间充质干细胞转化成胰岛细胞的方法， 在该方法中加入能够促进干细胞增殖转化，以及提高细胞活性促进胰岛细胞成熟的尼克酰 胺和HGF等物质，从而实现了提高间充质干细胞转化率以及提高转化后胰岛细胞的活性和 成熟度，提高胰岛细胞质量的目的。
[0024] 具体地，本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法为：
[0025] 1、取间充质干细胞于基础培养基中，并用预诱导剂进行预诱导培养2-4天；
[0026] 2、再加入诱导液，对间充质干细胞继续诱导4-7天，直至转化成胰岛细胞；
[0027] 其中，诱导液为尼克酰胺和/或0 _细胞调节素。
[0028] 步骤1中，基础培养基可以是n?M或DMEM培养基，并在基础培养基中加入预诱 导剂，预诱导剂包括EGF(表皮生长因子）、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）、银杏提取液 和FCS(fetalcalfserum，胎小牛血清）。其中，EGF的浓度为5_20ng/ml、bFGF的浓度为 5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数为2-10%。
[0029] EGF能够促进间充质干细胞的增殖，以及胰岛细胞团的形成。bFGF不仅能促进间 充质干细胞的增殖以及细胞体积的增大，还有助于间充质干细胞转化成胰岛细胞。银杏提 取液是根据国际标准提取工艺提取的，也可购于德国舒培大药厂，商品名金纳多，其中含有 黄酮类及银杏内酯等，能够中和掉细胞培养过程中积累的氧自由基，这样可以使得细胞分 裂到很高的密度而不死亡，从而有利于间充质干细胞的增殖，降低细胞的氧化作用，提高 细胞内谷胱甘肽的水平，清除氧自由基，防止细胞在诱导或扩增的过程中过早的凋亡，有利 于间充质干细胞的转化；还会影响动物细胞胆固醇的代谢。FCS含有丰富的细胞生长必须 的营养成份，提供对维持细胞指数生长的激素，是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来 源，并提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，同时，起 酸碱度缓冲液作用。
[0030] 该步骤主要是为间充质干细胞转化作准备，包括间充质干细胞的增殖、细胞体积 增大，增强间充质干细胞活性等，因此，在该步骤中，基础培养基中添加的物质也并不局限 于上述本发明所提供的物质。
[0031] 在步骤2中，诱导液为尼克酰胺和/或0 -细胞调节素；其中，尼克酰胺的主要作 用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过程，促进细胞的增殖转化， 尼克酰胺是组成NAD+和NADP+的一个部分，组成的NAD+和NADP+通过电子传递链，传递H+， 合成ATP;同时尼克酰胺能够调节细胞内的ATP/ADP的比例，从而引起细胞膜上ATP敏感性 钾通道的关闭，膜发生去极化，继而导致电压依赖性钙通道开放，钙离子内流，触发了胰岛 0细胞分泌胰岛素，可以促进间充质干细胞向胰岛样细胞分化，同时，促进胰岛细胞成熟； 优选地，尼克酰胺的浓度为5-20ng/ml。
[0032] 与尼克酰胺作用机理类似，0 -细胞调节素具有诱导nestin阳性细胞分化为胰岛 素分泌细胞的能力，促进MSC向胰岛样细胞分化，并且能够促进胰岛细胞成熟，0 -细胞调 节素的浓度为5-40ng/mL。
[0033] 由于尼克酰胺可以参与呼吸链，协助合成ATP，并且能够触发胰岛0细胞分泌胰 岛素，促进间充质干细胞向胰岛样细胞分化，且成本较低，因此，在发明中，优先采用尼克酰 胺，当然也可根据不同的诱导需求选择尼克酰胺和/或0 _细胞调节素。
[0034] 因此，本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，不仅能够促进间充质 干细胞转化成胰岛细胞，提高间充质干细胞的转化率，而且可促进胰岛细胞的成熟，提高细 胞活性，同时，促进间充质干细胞细胞和胰岛细胞的增殖及细胞体积的增大。
[0035] 进一步地，本发明所采用的诱导液中，还包括HGF(hepatocytegrowthfactor，肝 细胞生长因子），且HGF的浓度为5-20ng/ml，在间充质干细胞细胞分化为胰岛样细胞的过 程中，对于细胞起到保护作用的同时对细胞的扩增有着重要作用，能够促进胰岛细胞的发 育和分化，进一步提高胰岛细胞的活性及成熟度。
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0037] 实施例1
[0038] 在本实施例中，间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，包括以下步骤：
[0039] 1、获取间充质干细胞于加入预诱导剂的頂DM培养基中培养4天；
[0040] 2、再加入诱导液继续进行诱导培养4天，至间充质干细胞转化成胰岛细胞。
[0041] 步骤1中，获取间充质干细胞的过程为：
[0042] 1)获取人脐带