可生产正丁醇的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种利用基因工程技术建构的菌株，且特别关于一种可生产正丁醇的 菌株及其应用。
[0002] 先前技术
[0003] 石化产业虽与我们的日常生活息息相关，但石化燃料价格不断上涨、存量日趋减 少与对环境造成的伤害逐日严重已局限这项产业的发展。因此，确实有必要开发更多再生 且环保的燃料，利用生物过程制造化学制品便应蕴而生。一般而言，生物所制造的化学制品 多为微生物的发酵产物。于微生物发酵过程中，发生了许多以NADH与NAD+为辅因子的氧 化还原反应。当NAD+作为电子接受者时，醣类代谢会伴随NADH产生。之后，于NADH存在 下还原醣类代谢中间物而再次产生NAD+。于大肠杆菌内，此种还原反应通常会产生乙醇、乳 酸、琥珀酸。故，维持NADH与NAD+间的氧化还原平衡乃是确保微生物发酵持续的关键。
[0004] 梭菌属（Clostridium)的正丁醇制造为微生物发酵的典型例（JonesandWoods 1986)。这种发酵制造分成二阶段：产酸（acidogenesis)与产溶剂（solventogenesis)(Lee etal. 2008)。产酸时，梭菌属会发酵葡萄糖而产生乙酸、丁酸。产溶剂时，梭菌属于再吸收 这些有机酸的同时制造丙酮、正丁醇与乙醇为最终产物。依这种合成路径，自葡萄糖直接合 成正丁醇会导致NADH/NAD+氧化还原失衡，主因在于此合成路径所需的NADH较于醣解途径 所产生的NADH多。正丁醇为一可替代的燃料，且就能量密度、蒸气压、吸湿性而言，正丁醇 优于乙醇（Mussattoetal. 2008)。以特定比例混合正丁醇与汽油后，此混合物可作为交通 运输的燃料，并直接使用已存在的输油管运输。上述性质让微生物所制造的正丁醇极受业 界注目。
[0005] 目前已有许多于不同菌种内制造正丁醇（Atsumi et al. 2008、Bhandiwad et al. 2014、Berezina et al. 2010、Lan and Liao 2011、Nielsen et al. 2009、Steen et al.2008、T〇ng et al.2014)的方案。这些方案虽然可行，但因其正丁醇的产量低而无法普 及。大肠杆菌已广泛作为生物科技的工具以用来制造高价值的化学制品和生物燃料。于引 用梭菌属的合成途径至大肠杆菌后，利用大肠杆菌制造正丁醇将大有可为。即使如此，胞内 氧化还原状态仍旧为一难以解决的问题。之后，此问题透过增加大肠杆菌内的NADH量获致 解决（Lim at el.2013、Shen et al.2011)。然而，这些现有技术所用的TB培养基（成分为： 1. 2g/L胰化蛋白（tryptone)、24g/L酵母萃取物、2. 31g/L磷酸二氢钾（KH2P04)、12. 54g/L 磷酸氢二钾（K2HP04)、4mL/L甘油）价格不斐，限制了它们的应用。
【发明内容】
[0006] 调控一种特殊大肠杆菌内NADH含量可提升正丁醇的产生，且引用梭菌属的CoA 依赖合成途径至此菌株内。这种调控为透过修饰菌株的中心代谢途径完成的，包含有： (1)将丙酮酸导入乙酰辅酶A; (2)放大五碳糖磷酸途径（pentosephosphatepathway， PPpathway) ; (3)将醣解通量引导至五碳糖磷酸途径；（4)自梓檬酸循环（tricarboxylic acidcycle，TCAcycle)转向乙酰辅酶A。如此一来，此菌株可培养于外加葡萄糖的M9Y培 养基（含有M9盐类与酵母萃取物）并有效地制造正丁醇。
[0007] 依上述概念，本发明提出一种可生产正丁醇的菌株，其属于大肠杆菌且含有：一丙 酮丁醇梭杆菌（Clostridiumacetobutylicum)的hbd基因、一丙酮丁醇梭杆菌的crt基 因、一丙酮丁醇梭杆菌的adhE2基因、一钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)的phaA基 因、一齿垢密螺旋体（Terponemadenticola)的ter基因、一酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的fdhl基因、一启动子PAPL、一操作子lacO。启动子PAPL为镶嵌于菌株的 染色体，以调控染色体上的zwf基因、pgl基因、udhA基因、以及aceEF基因操纵组-E354K 点突变的lpdA基因，操作子lacO为镶嵌于菌株的染色体，以调控色体上的gltA基因，且菌 株缺少pgi基因、ldhA基因、pta基因、adhE基因、frdA基因。
[0008] 于一实施例中，菌株为衍生自大肠杆菌BL21。
[0009] 于另一实施例中，启动子PXPL为镶嵌于zwf基因、pgl基因、udhA基因、及aceEF 基因操纵组-E354K点突变的lpdA基因的上游区域。
[0010] 于又一实施例中，操作子laC〇为镶嵌于gltA基因的上游区域。
[0011] 于再一实施例中，hbd基因、crt基因、adhE2基因、phaA基因、ter基因、fdh1基因 为受另一启动子PXPL调控。
[0012] 此外，于本发明揭露的范围内，更提出一种生产正丁醇的方法，其包含：培养上述 菌株于一含葡萄糖的M9Y培养基中。
[0013] 于一实施例中，培养基含有6g/L磷酸氢二钠（Na2HP04)、3g/L磷酸二氢钾、0? 5g/L 氯化钠、lg/L氯化铵、ImM硫酸镁、0.ImM氯化钙、10mg/L维他命Bl、5g/L酵母萃取物、20g/L 葡萄糖。
[0014] 为让本发明更明显易懂，文中使用的基因全名于下：aceEF_lpdA，丙酮 酸去氢酶复合体（pyruvatedehydrogenasecomplex) ;adhE，丁酸 / 丁醇去氢酶 (butyraldehyde/butanoldehydrogenase) ;adhE2, 丁酸 / 丁酸去氢酶（butyraldehyde/ butanoldehydrogenase) ;crt，巴豆酸酶（crotonase) ;fdhl，甲酸去氢酶（formate dehydrogenase) ;frdA，富马酸还原酶（fumaratereductase) ;gltA，梓檬酸合成 酶（citratesynthase) ;hbd，3-羟基丁 基辅酶A去氢酶（3-hydroxybutyryl-CoA dehydorgenase) ;ldhA，乳酸去氛酶（lactatedehydrogenase) ;pgi，憐酸葡糖异构 酶（phosphoglucoseisomerase) ;pgl，内酯酶（lactonase) ;phaA，0 -酮硫解酶 (0-ketothiolase) ;pta，磷酸乙酰转移酶（phosphateacetyltransferase) ;ter，反稀 酰基辅酶A还原酶（trans-enoyl-coAreductase) ;udhA，吡啶核苷酸转氢酶（pyridine nucleotidetranshydrogenase) ;zwf，葡萄糖-6_ 磷酸去氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase)〇
【附图说明】
[0015] 图1为大肠杆菌菌株BuT-14的正丁醇生产途径；图中符号?为强化基因的表现， ?为减弱或抑制基因的表现。
[0016] 图2为大肠杆菌菌株BuT-8-Fdhl于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
[0017] 图3为大肠杆菌菌株BuT-9于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
[0018] 图4为大肠杆菌菌株BuT-10于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
[0019] 图5为大肠杆菌菌株BuT-12于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
[0020] 图6为大肠杆菌菌株BuT-13于培养液中培养不同时间后的各种物质浓度。
[0021] 图7为大肠杆菌菌株BuT-14于培养液中培养不同时间后的各种物质浓度。
【具体实施方式】
[0022] 兹以下述实施例，详细说明本发明：
[0023] 制备例1 :菌株的培养
[0024] 接种液为透过将大肠杆菌生长于含2g/L葡萄糖的Luria-Bertani培养液中至隔 夜而取得。细胞密度为于光线波长550nm测得。接着，将接种液培养于50mL的M9Y培养液 中，其含有：6g/L磷