一种重组菌、其构建方法及提高阿维菌素产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及一种重组菌、其构建方法及提高阿维菌 素产量的方法。
【背景技术】
[0002] 阿维菌素（avermectin)是一种由阿维链霉菌（Streptomycesavermitilis)发 酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有广泛的驱虫和杀虫活性。阿维链霉菌发酵液中通常 含有8种阿维菌素组分Ala，Alb，A2a，A2b，Bla，Blb，B2a，B2b，其中，杀虫效果以B1组分 最佳，尤其是Bla组分。阿维菌素的作用机制独特，与常规化学杀虫剂不同，杀虫效果是一 般化学农药的几十倍，且不易使害虫产生抗性。作用靶点是线虫及节肢动物类寄生虫的神 经传导介质Y-氨基丁酸，对哺乳动物的毒性很小、选择性很高，且在植物中的残留时间很 短，土壤中的微生物能很快将其分解成无毒物质。由于阿维菌素的广谱、高效、无残留、对动 植物高度安全等突出优点，已在农业、畜牧业、医药等领域广泛应用，具有广阔的市场前景 和应用价值。而且，以阿维菌素作为母体，还开发出了一系列活性更高、选择性更强、对动植 物更安全的衍生产品，已经商业化的产品包括多拉菌素、伊维菌素、埃玛菌素等。
[0003] 目前，阿维菌素在国内已经实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但是， 我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。如何提高阿维菌素的 产量，降低生产成本，是阿维菌素研究中的一个重要课题。
[0004] 阿维菌素是一组由十六元环内酯与一个二糖（齐墩果糖）所生成的苷，在十六元 内酯周围还有一个含2个六元环的螺缩酮系及六氢苯并呋喃环系。糖基配体骨架是由一个 a支链脂肪酸S(+)-甲基丁酰脂肪酸或异丁酰脂肪酸为起始，7个乙酸盐和5个丙酸盐头尾 聚合而成。C-25位的不同的取代基分为a、b组分，a组分的二甲基丁酰基来源于S(+)_甲 基丁酰辅酶A，b组分的异丁酰基来源于异丁酰辅酶A。琥珀酰辅酶A合成酶（EC:6. 2. 1. 5)， 是细胞代谢过程中初级代谢三羧酸通路上重要的酶，如果琥珀酰辅酶A合成酶缺失，造成 三羧酸代谢通路减弱，更多的流向阿维菌素合成前体之一丙酰辅酶A的合成，也会间接增 加磷酸戊糖途径代谢通路流量，提高还原力供给。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种重组菌、其构建方法及提高阿维菌素产量的方法，通过敲除了 阿维链霉菌中的琥珀酰辅酶A合成酶a亚基的sucDl基因获得高产阿维菌素的重组菌，通 过获得的重组菌发酵生产阿维菌素，解决了现有阿维菌素的生产菌株产量低的问题。
[0006] 本发明的一个方面，提供了一种重组菌，所述重组菌为敲除了阿维链霉菌中的琥 珀酰辅酶A合成酶a亚基的sucDl基因的重组菌。
[0007] 在上述技术方案中，通过构建敲除了sucDl基因的表达载体，再将所述表达载体 导入阿维链霉菌获得所述高产阿维菌素的重组菌。
[0008]优选地，所述阿维链霉菌为StreptomycesavermitilisMA4680。
[0009] 在上述技术方案中，所述敲除了sucDl基因的表达载体通过在质粒载体中插入抗 性基因、sucD1L_arm基因、sucD1R-arm基因构建。
[0010] 在上述技术方案中，所述质粒载体为PJTU870。
[0011] 在上述技术方案中，所述抗性基因为aac3 (IV)基因。
[0012] 本发明的另一个方面，提供了一种构建上述技术方案中任一所述的重组菌的方 法，包括如下步骤：
[0013] 以阿维链霉菌基因组为模板克隆编码琥珀酰辅酶A合成酶a亚基的sucDl基因 上下游片段的sucDlL-arm基因和sucDlR-arm基因；
[0014] 克隆抗性基因，同时EcoRI酶切质粒载体；
[0015] 连接所述抗性基因、sucDlL-arm基因、sucDlR-arm基因和酶切后的质粒载体这 四个基因片段，构建敲除载体；
[0016] 将所述敲除载体转化到大肠杆菌中，测序验证后，再将所述敲除载体导入到阿维 链霉菌获得重组菌。
[0017] 优选地，所述大肠杆菌为E.coliDH5a。
[0018] 更优选地，所述大肠杆菌为没有限制修饰作用的E.coliET12567 (PUZ8002)。
[0019] 在上述技术方案中，所述质粒载体为PJTU870。
[0020] 在上述技术方案中，所述阿维链霉菌为StreptomycesavermitilisMA4680。
[0021] 在上述技术方案中，克隆所述抗性基因是以pSET152为模板克隆aac3(IV)基因。
[0022] 本发明的再一个方面，提供了一种提高阿维菌素产量的方法，包括利用权利要求 上述任一所述的重组菌进行发酵的步骤。
[0023] 本发明通过敲除了阿维链霉菌中的琥珀酰辅酶A合成酶a亚基的sucDl基因，使 阿维链霉菌中的琥珀酰辅酶A合成酶缺失，造成三羧酸代谢通路减弱，更多的流向阿维菌 素合成前体之一丙酰辅酶A的合成途径，也会间接增加磷酸戊糖途径代谢通路流量，提高 还原力供给，增加阿维菌素前体合成，提高阿维菌素的产量。
【附图说明】
[0024] 图1是敲除了阿维链霉菌中的sucDl基因的敲除质粒pSHl-K-sucDl的基因图谱；
[0025] 图 2 是阿维链霉菌StreptomycesavermitilisMA4680 (ATCC31267)及本发明制 备的重组阿维链霉菌经发酵得到的阿维菌素产量；
[0026] 图3A为阿维菌素Bla标准品HPLC图谱；
[0027] 图 3B为出发阿维链霉菌StreptomycesavermitilisMA4680 (ATCC31267)产生的 阿维菌素Bla的HPLC图谱；
[0028] 图3C为本发明实施例中制备的重组阿维链霉菌产生的阿维菌素Bla的HPLC图 谱。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0030] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1、sucDl基因敲除载体的构建
[0033] 1、sucDl基因上下游片段序列sucDlL-arm和sucDlR-arm的扩增
[0034] 设计引物，用于扩增位于阿维链霉菌Streptomycesavermitilis MA4680(ATCC31267)染色体上的sucDl基因上游片段（如序列表SEQIDNO:1所示）和下 游片段（如序列表SEQIDN0:2 所示），sucDlL-arm上游引物sucDlL-F(5'-AGGTCGACGG TATCGATAAGCTTGCGTCCCAGTCGGTGTAGITC-3 '），下游引物sucD1L-R(5 '-GITCCTAITCCGAAGIT CCTAITCGCGTCATGCCGTGTCACTACCTTC-3'），扩增产物应为 941bp。
[0035]sucDlR-arm上游引物sucD1R-F(5'-ACTTCGAAGTTCCTATACTTGTCGGGCTCCTTC AGCCGGC-3'），下游引物sucDl-R-R(5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGTACGAACACCAGGCAAGGG AA-3'），扩增产物应为1135bp测序验证。
[0036]以阿维链霉菌高产菌株StreptomycesavermitilisMA4680 (ATCC31267)(从申请 日起二十年内公众可从中国科学院微生物研究所获得）的总DNA为模板，sucDlL-armPCR 反应以sucDlL-F和sucDlL-R为引物，sucDlR-armPCR反应以sucDlR-F和sucDlR-R 为引物，米用NewEnglandBiolabs公司的Q5HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase， 进行PCR扩增，扩增条件为 98°C，3min;(98°C，10s;72°C，40s)X30 个循环；72°C，2min。对 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约941bp处有一条特异性的扩增条带，测序验证。
[0037] 2、安普霉素抗性基因aac3 (IV)的扩增
[0038]设计引物，用于扩增位于pSET152 质粒（BiermanM,LoganR, 0'BrienK,et al.PlasmidcloningvectorfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichia colitoStreptomycesspp.Gene, 1992, 116:43-49)(从申请日起二十年内公众可从中国 科学院微生物研究所获得）上的aac3 (IV)基因（如序列表SEQIDNO:3所示），上游引物 aac3(IV)-F(5'-CGAAGITCCTAITC-3'），下游引物aac3(IV)-R(5'-AAGTATAGGAACTTCTT-3'）， 扩增产物应为1284bp。
[0039]以pSET152 质粒为模板，aac3(IV)_F和aac3(IV)_R为引物，采用NewEngland Biolabs公司的Q5HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase，进行PCR扩增，扩增条件 为98°C，3min;(98°C，10s;55°C，30s)X30个循环；72°C，2min。对扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，在约1284bp处有一条特异性的扩增条带。
[0040]3、重组