一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产d-乳酸的工程菌及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌的构建，属于 基因工程领域。本发明还涉及一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌的应 用，特别是发酵生产D-乳酸，属于发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] D-乳酸是一种重要的手性中间体，其聚合物具有很高的热稳定性，可制成生物可 降解材料，因此其生产和应用受到广泛关注，成为目前研究的热点。微生物发酵法由于原料 来源广泛、生产成本低、光学纯度高、安全性高等优点已成为国内外生产D-乳酸的主要方 法。目前D-乳酸的生产主要以葡萄糖做为底物。自然界中生物质种类繁多，分布广泛，且 数量巨大，价格低廉。木质纤维素的水解产物富含大量糖类，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯通和 半乳糖等。这些混合糖可以作为碳源用以微生物发酵生产。如果能以木质纤维素水解后的 混合糖替代葡萄糖作为碳源用于微生物发酵就能够节省生产成本，同时将如秸杆的农业废 弃物加以利用，变废为宝，有益于保护环境。但是利用混合糖进行发酵目前面临着两个难 题：一，混合糖中的六碳糖较容易被微生物利用，但木糖等五碳糖很少有微生物能够利用； 二，利用混合糖发酵时大肠杆菌优先利用六碳糖，待六碳糖消耗完才利用五碳糖，而利用五 碳糖特别是木糖前有一段很长的停滞期，相比于纯木糖它的利用速度比较慢，而且通常木 糖没能利用完。上述现象的出现主要是由于葡萄糖效应：在两种混合碳源环境中大肠杆菌 通常优先利用其中容易代谢的一种（通常是葡萄糖），待前一种耗尽和一段停滞期后再开 始利用另一种碳源。大量研究表明，CCR的产生与糖类磷酸转移酶系统（PTS转运系统）有 关。PTS系统负责特异性地将葡萄糖从细胞外跨膜主动运输进入细胞，并在此过程中，将葡 萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解途径。
[0003] 虽然目前D-乳酸工程菌和生产菌已有不少，但普遍存在上述两方面问题；有少量 报道的改造工程菌虽然可以利用混合糖进行发酵，但不是发本酵产量低，转化效率不高，就 是副产物大量生成，产物纯度不高。因此，如何提高五碳糖的利用率，特别是以混合碳源发 酵时，降低葡萄糖效应，实现五碳糖和六碳糖的同步利用，提高碳源利用率及发酵效率，得 到光学纯度高的D-乳酸产品，是目前在乳酸发酵生产工艺中研究热点之一。
【发明内容】
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[0004] 为了克服现有乳酸发酵生产过程中的缺点与不足，本发明旨在提供一种可同步利 用五碳糖和六碳糖发酵产高光学纯D-乳酸工程菌。
[0005] 所述工程菌Escherichi.coliDX03的保藏号为CCTCCM2015414,保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏日期 2015年6月29日。Escherichi.coliDX03以能利用木糖发酵生产乙醇的大肠杆菌工程菌 RM10为出发菌株，以D-乳酸脱氢酶基因（ldhA)替换其乙醇脱氢酶基因（adhE)，得到能利 用木糖发酵产D-乳酸的重组菌；敲除葡萄糖转运入胞的酶IICB&的编码基因（ptsG)，降低 葡萄糖效应，最终得到能同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工程菌。该工程菌具体 是由以下步骤构建得到的：
[0006] (1)敲除菌株E.coliRM10的乙醇脱氢酶基因adhE，得到工程菌E.coliDX01;
[0007] ①以pKD4质粒为模板，用引物adhE-Pl、adhE_P2进行adhE同源重组片段的PCR 扩增；
[0008] ②纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；
[0009] ③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliRM10细 胞；
[0010] ④通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有PKD46质粒的E.coliRM10感 受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子（带有kan基 因的重组片段替换adhE基因，以将其从基因组上敲除），PCR验证阳性转化子，得到E.coli DX01；
[0011] ⑤消除E.coliDX01的卡那抗性。
[0012] (2)在E.coliDX01基因组上插入乳酸脱氢酶基因ldhA，得到能发酵产D-乳酸工 程菌E.coliDX02;
[0013] ①以野生型E.coliW的基因组为模板，以ldhA-Pl和ldhA-P2为引物，PCR扩增 带自身启动子的ldhA基因全长；
[0014] ②纯化扩增的ldhA基因片段；
[0015] ③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX01细 胞；
[0016] ④通过电转法将纯化后的ldhA基因片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX01 感受态细胞，后将涂布于LB平板；
[0017] ⑤挑选LB平板上的单菌落，进行无氧管筛选和PCR验证，得到E.coliDX02。
[0018] (3)敲除E.coliDX02葡萄糖转运入胞的酶IICBGlc的编码基因ptsG，得到可同 步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸工程菌E.coliDX03。
[0019] ①以PKD4质粒为模板，用引物ptsG-Pl、ptsG-P2进行ptsG同源重组片段的PCR 扩增；
[0020] ②纯化带有卡那霉素基因kan的同源重组片段；
[0021] ③通过热击法将带有同源重组酶编码基因的pKD46质粒转化入E.coliDX02细 胞；
[0022] ④通过电转法将纯化后的同源重组片段转化入带有pKD46质粒的E.coliDX02感 受态细胞中，经过复苏后，将菌液涂布于卡那抗性LB平板，筛选阳性转化子（带有kan基 因的重组片段替换PtsG基因，以将其从基因组上敲除）PCR验证阳性转化子，得到E.coli DX03；
[0023] ⑤消除E.coliDX03的卡那抗性。
[0024] 本发明的另一目的在于提供上述可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的工 程菌在乳酸生产中的用途，其发酵生产乳酸的工艺为：
[0025](1)种子培养：37°C下150r/min摇瓶培养工程菌至对数生长中期；
[0026] (2)发酵罐培养：以10%的接种量将菌液接种至发酵罐，发酵培养28_120h，发酵 参数为：pH7. 0, 37°C下150r/min，所述10%为经步骤（1)培养所得的菌液与发酵罐中培养 基的体积比。
[0027] 本发明提供的工程菌E.coliDX03乳酸生产工艺以及发酵培养基成分简单，能同 时利用五碳糖和六碳糖产高光学纯D-乳酸。目前还未知有相同的菌株报道，本发明的产 乳酸发酵菌相对现有技术具有如下优点：1、工程菌E.coliDX03能同时利用五碳糖和六碳 糖，是极具有潜力的可做为能利用木质纤维原料的乳酸发酵生产菌。其原理是因为ptsG 基因的敲除，降低了葡萄糖效应，使得木糖，阿拉伯糖等在葡萄糖存在的情况下，能同时被 消耗，从而加快发酵速度，缩短发酵时间。如：在5%葡萄糖和5%木糖为碳源的发酵过程 中能提高木糖消耗速率，有效缩短发酵时间，同时糖酸转化率达到〇.84g/g;在10%的混 合糖（6%葡萄糖，3%木糖，1%L-阿拉伯糖）为碳源进行发酵时，糖酸转化率达到0. 81g/ g，D-乳酸光学纯度达到99. 8%以上。2、其出发菌株RM10通过基因敲除技术阻断了其它 代谢副产物（如乳酸，乙酸，甲酸，琥珀酸等）的合成途径，使得碳代谢流都流向乙醇代谢 途径，不仅乙醇产量高，而且产物纯度高；而E.coliDX03正是在此基础上将乙醇脱氢酶基 因敲除掉，置换上D-乳酸脱氢酶基因，相当于将原来的乙醇代谢途径阻断，重新开启D-乳 酸代谢途径，因而终产物D-乳酸产量高，基本无其它副产物产生，D-乳酸光学纯度能达到 99. 8%以上。在达到产物高产量的同时，达到高光学纯度，也是现在同型发酵产乳酸的重要 指标。结合上述两个优点，本发明的工程菌E.coliDX03极具利用木质纤维素原料同型发 酵生产D-乳酸的生产潜力。
【附图说明】：
[0028] 图1为实施例1工程菌E.coliDXOladhE基因敲除PCR验证图；M:marker;1 :带 卡那抗性E.coliDX01PCR扩增片段；2:E.coliRM10PCR扩增片段。
[0029] 图2为实施例1工程菌E.coliDX021dhA基因插入PCR验证图；M:marker; 1 : E.coliDX02PCR扩增片段；2:E.coliRM10PCR扩增片段；3:E.coliWPCR扩增片段。
[0030] 图3为实施例2工程菌E.coliDX03ptsG基因敲除的PCR验证图；M:DNAmarker; 1 :E.co1iDX02PCR扩增片段；2 :卡那抗性基因PCR扩增片段；