化学品的制造方法
【专利摘要】本发明的课题是提供以六碳糖与五碳糖的混合糖为发酵原料的高收率的化学品的制造方法。作为本发明的解决问题的方法是，提供化学品的制造方法，是通过连续发酵来制造化学品的方法，包括：将微生物的培养液用分离膜过滤，将未过滤液保持在或回流至培养液中，在培养液中补加发酵原料，和回收过滤液中的生产物，所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖，所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
【专利说明】化学品的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用了包含六碳糖和五碳糖的发酵原料的通过连续发酵来制造化学品的方法。
【背景技术】
[0002]以乳酸等生物分解性聚合物原料、乙醇等生物燃料为代表的来源于生物质的化学品作为二氧化碳向大气中的排放问题和/或能源问题的显在化、以及可持续性(sustainability)和生命周期评估(LCA)对应型制品，受到强烈关注。作为这些生物分解性聚合物原料、生物燃料的制造方法，一般使用从玉米等可食性生物质纯化而得的六碳糖葡萄糖作为微生物的发酵原料，作为发酵产物得到，但如果使用可食性生物质，则可能由于与食物竞争而引起价格高涨，不能实现稳定的原料供应。于是，进行了使用来源于稻秸等非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的尝试(参照专利文献I)。
[0003]使用来源于非可食性生物质的糖作为发酵原料时，将非可食生物质所含的纤维素、半纤维素等通过糖化酶分解成糖，但此时不仅得到葡萄糖等六碳糖，还同时得到木糖等五碳糖，在使用来源于非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的情况下，需要使用六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料(参照专利文献I)。在使用六碳糖与五碳糖的混合糖时，需要使用除了六碳糖的代谢途径之外还具有五碳糖的代谢途径的微生物。作为五碳糖的代谢途径，已知通过 戊糖还原酶和五醇脱氢酶的代谢途径，已知作为第一阶段，戊糖还原酶与五碳糖作用而生成五醇，作为第二阶段，五醇脱氢酶与五醇作用。然而，实际上第一阶段所生成的五醇不进入第二阶段以后的代谢途径而蓄积在培养液中，因而存在生产收率不提高这样的课题。
[0004]作为以作为六碳糖与五碳糖的混合糖的来源于非可食性生物质的糖为微生物的发酵原料的发酵方法，可采用连续发酵，但实际对于连续发酵时的发酵收率并未确认(参照专利文献I)。另一方面，还已知将六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料进行连续发酵时，与分批发酵相比发酵收率显著降低(参照非专利文献I)。
[0005]因此，想要在以六碳糖与五碳糖的混合糖为发酵原料的具有通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶的五碳糖的代谢途径的微生物的发酵中提高发酵收率时，到目前为止的技术常识是认为，需要通过突变导入和/或基因导入来进行木糖代谢途径的改良。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:W02010/067785
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1:Susan T.Toon 等，Enhanced Cofermentat1n of Glucose andXylose by Recombinant Saccharomyces Yeast Strains in batch and Continuous OperatingModes., Applied B1chemistry and B1technology.，(1997)，63-65，243-255.
【发明内容】
[0011]发明要解决的课题
[0012]本发明的课题是，提高以六碳糖与五碳糖的混合糖作为具有通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶的五碳糖代谢途径的微生物的发酵原料进行发酵时的发酵收率。
[0013]用于解决课题的方法
[0014]本
【发明者】们对上述课题进行了深入研究，结果通过在使用具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物时，用包含六碳糖和五碳糖的发酵原料进行使用分离膜的连续发酵，从而解决了上述课题，实现了从六碳糖与五碳糖的混合糖中的收率提高，完成了本发明。
[0015]即，本发明如以下(I)~(7)。
[0016](I)化学品的制造方法，是通过连续发酵来制造化学品的方法，包括:将微生物的培养液用分离膜过滤，将未过滤液保持在或回流至培养液中，在培养液中补加发酵原料，和回收过滤液中的生产物，
[0017]所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖，所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
[0018](2)根据(I)所述的化学品的制造方法，在体积传氧系数即KLa为5~300小时―1的条件下进行连续发酵。 [0019](3)根据(I)或(2)所述的化学品的制造方法，所述发酵原料中所含的五碳糖与六碳糖的比率为1:9~9:1。
[0020](4)根据⑴或⑵所述的化学品的制造方法，所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
[0021](5)根据(I)~(4)的任一项所述的化学品的制造方法，五碳糖是木糖。
[0022](6)根据(I)~(5)的任一项所述的化学品的制造方法，戊糖还原酶是木糖还原酶。
[0023](7)根据(I)~(6)的任一项所述的化学品的制造方法，五醇脱氢酶是木糖醇脱氢酶。
[0024]发明的效果
[0025]根据本发明，可以大幅提高使用包含五碳糖和六碳糖的发酵原料的具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物的各种化学品的发酵生产的效率收率。
【具体实施方式】
[0026]本发明的化学品的制造方法的特征在于，是作为发酵原料使用包含五碳糖和六碳糖的混合糖的发酵原料，培养具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物，将其培养液用分离膜过滤，将未过滤液保持在或回流至培养液中，并且在培养液中补加发酵原料，回收过滤液中的生产物的连续发酵。
[0027]五碳糖是指构成糖的碳的数为5的糖，也称为戊糖(Pentose)。有I位具有醛基的戊醛糖和2位具有酮基的戊酮糖。作为戊醛糖，可列举木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖，作为戊酮糖，可列举核酮糖、木酮糖。作为本发明中使用的五碳糖，只要是微生物能够同化的五碳糖则可以是任一种，从自然界的存在比例和/或获得的容易性等观点出发，优选木糖、阿拉伯糖，更优选木糖。[0028]六碳糖是构成糖的碳的数为6的糖,也称为己糖(Hexose)。有I位具有醒基的醒糖和2位具有酮基的酮糖。作为醛糖，可列举葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、塔罗糖等，作为酮糖，可列举果糖、阿洛酮糖、山梨糖等。作为本发明中使用的六碳糖，只要是微生物能够同化的六碳糖就可以是任一种，从自然界中的存在比例和/或获得容易性等观点出发，优选葡萄糖、甘露糖、半乳糖，更优选葡萄糖。
[0029]关于本发明中使用的混合糖不特别限定，但由于包含六碳糖与五碳糖两者，因而优选使用来源于含纤维素的生物质的糖液。含纤维素的生物质可列举甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸、稻秸、麦秸等草木系生物质、和树木、废建材等木质系生物质等为例。含纤维素的生物质含有作为糖脱水缩合而成的多糖的纤维素或者半纤维素，通过将这样的多糖水解来制造可作为发酵原料利用的糖液。来源于含纤维素的生物质的糖液的制备方法可以是任何方法，作为这样的糖的制造方法，公开了使用浓硫酸将生物质进行酸水解来制造糖液的方法(日本特表平11-506934号公报、日本特开2005-229821号公报)，将生物质用稀硫酸进行水解处理后进一步进行纤维素酶等的酶处理从而制造糖液的方法(A.Aden等，“LignocellulosicB1mass to Ethanol Process Design and Economics UtilizingCo-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover,?NRELTechnical R印ort (2002))。另外作为不使用酸的方法，公开了使用250~500°C左右的亚临界水将生物质进行水解来制造糖液的方法(日本特开2003-212888号公报)，以及将生物质进行亚临界水处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特开2001-95597号公报)，将生物质用240~280°C的加压热水进行水解处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特许3041380号公报)。如以上那样的处理之后，还可以将所得的糖液进行纯化。其方法在例如W02010/067785中公开。
[0030]作为混合糖所含的五碳糖与六碳糖的重量比率，可以是任何比率，但如果作为混合糖中的五碳糖与六碳糖的重量比率表示为(五碳糖):(六碳糖)，则优选为1:9~9:1。这是假定来源于含纤维素的生物质的糖液为混合糖时的糖比率。
[0031]作为混合糖的总糖浓度，在微生物不受到底物抑制的程度内优选为高浓度。如果糖浓度过低，则生产效率差，因而优选为20g/L以上。作为优选的总糖浓度的范围，为20~500g/L。鉴于上述，则五碳糖的浓度优选为5g/L以上，六碳糖的浓度优选为5g/L以上。
[0032]另外，作为发酵原料所含的氮源可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源例如油柏类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类，可适宜添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等。
[0033]本发明中使用的微生物为了生长繁殖而需要特定的营养素时，可以将其营养物作为标准品或含有该营养物的天然物添加。另外，还可以根据需要使用消泡剂。在本发明中，培养液是指微生物在发酵原料中增殖而得的液体。补加的发酵原料的组成可以由培养开始时的发酵原料组成适宜变更，以使目的化学品的生产性变高。
[0034] 接下来，对于可以在本发明的化学品的制造方法中使用的微生物进行说明。对于本发明的微生物，只要是具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物就不特别限定。进而，使用的微生物可以是从自然环境中分离的微生物，也可以是通过突变和/或基因重组而部分性质被改变的微生物。[0035]戊糖还原酶是还原酶的一种，是指以NADH或NADPH为辅酶具有将戊醛糖转换为糖醇的活性的酶。例如，木糖还原酶相当于例如ECl.1.1.307,ECl.1.1.21，是将木糖转换为木糖醇的酶。阿拉伯糖还原酶相当于例如ECl.1.1.21，是将阿拉伯糖转换为阿糖醇的酶。另外，即使不是以上述EC编号分类的酶，只要是具有上述活性的酶，也包含在本发明中的戊糖还原酶中。
[0036]五醇脱氢酶是脱氢酶的一种，是以NAD+作为辅酶将五醇转换为戊酮糖的酶。例如，木糖醇脱氢酶相当于例如ECl.1.1.9,ECl.1.1.10，是将木糖醇转换为木酮糖的酶。阿糖醇脱氢酶相当于例如ECl.1.1.11、ECl.1.1.12，是将阿糖醇转换为核糖的酶。即使是分类上与五醇脱氢酶不同的酶，只要是具有上述活性的酶，也包含在本发明中的五醇脱氢酶中。
[0037]能代谢戊糖的微生物作为具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物而已知。例如，毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、管囊酵母(Pachysolen)属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)球拟酵母属(Torulopsis)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issachenkia)、酒香酵母属(Brettanomyces)、1J ^ K木9属(Lindnera)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)等。具体可列举树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、匕。3一于(Pichia mexcana)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、产I元假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、纤维假丝酵母(Candida tenuis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、^ ^ 'y r ^ 9' * ^V 'y 'y 7- (Candida sonorensis) > ^ ^ ^ r ? 夕'.r ? 'y r ν (Candida diddensiae)、中间假丝酵母(Candida intermedia)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、今^
>于.'彳夕'.J 夕 7 乂 ;l.一寸(Candida methanosorbosa)、今弋 > 夕'.々彳力一,、^ ?1 (Candida wickerhamii)、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces mar xianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、^ 寸子二
>今 7*.才丨>夕丨J 7 (Issachenkia orientalis)、汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)、多形汉逊酵母(Hansenula po Iymorpha)、球拟酵母(Torulopsis bomb i col a) >纳氏酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、1J ^ K ^ 7.口夕' 才、> 7 (Lindnerarhodanensis)、々< '7 力一厂乇 S 七八(ffickerhamomyces rabaulensis)等。它们具有戍糖还原酶和戍糖脱氢酶，可以通过利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,京都基因与基因组百科全书)、GenBank等的Web所公开的数据库进行检索而简单地获知。
[0038]另外，即使是数据库中无信息的微生物，也可以通过以下[I]、[2]所示的酶活性测定来获知。
[0039][I]戊糖还原酶活性测定
[0040]在包含200mM的木糖(或阿拉伯糖等的戊糖)、和100 μ L的1.5mM的NAD(P)H的50mM的磷酸缓冲液(900 μ L)中添加培养微生物的菌体提取液，在30°C监测反应所生成的NAD(P) +特异的340nM的吸光度的减少，从而可以测定戊糖还原酶活性。
[0041][2]五醇脱氢酶活性测定
[0042]在包含50mM的MgCl2、300mM的木糖醇(或阿拉伯糖等的戊糖)和100 μ L的1mM的NAD⑵+的50mM的Tris-HCl缓冲液900 μ L中添加培养微生物的菌体提取液，在35°C监测反应所生成的NAD(P)H特异的340nM的吸光度的增加，从而可以测定五醇脱氢酶活性。[0043]进而，即使是细菌、面包酵母等本来不具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶活性的微生物，只要通过基因重组使其表达该酶，则也包含在本发明中。作为本来不具有戊糖还原酶和戍糖脱氢酶活性的微生物已知的可列举，大肠菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、谷氛酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)、7 *。口 9外K子卟z.9工术9夕亍^力义(Sporolactobacillus Iaevolacticus)、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymixa)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、棕榈发酵单孢菌(Zymobacterpalmae)等。作为通过基因重组来制作表达该酶的微生物的方法，在日本特开2009-112289等中公开。
[0044]进而，还可以将具有该酶的微生物通过突变导入和/或基因重组而强化发酵能力，和/或导入外来基因而生产本来不产生的物质。具体地，是除了木糖还原酶和木糖醇脱氢酶之外还导入木糖异构酶，使作用于木糖醇的代谢物木酮糖的木酮糖激酶高表达，或对不生产D-乳酸的微生物导入D-乳酸脱氢酶，等等。
[0045]接下来，对于在本发明中作为分离膜使用的多孔性膜进行说明。
[0046]对于本发明中使用的多孔质膜不特别限定，只要具有将在微生物的利用搅拌型培养器或者搅拌型生物反应器的培养中所得的培养液从微生物进行分离过滤的功能即可，可以使用例如多孔质陶瓷膜、多孔质玻璃膜、多孔质有机高分子膜、金属纤维编织体、无纺布等。其中特别是多孔质有机高分子膜或陶瓷膜是合适的。
[0047]对于本发明中作为分离膜使用的多孔性膜的构成进行说明。本发明中使用的多孔性膜优选具有适应被处理水的水质和/或用途的分离性能和透水性能。
[0048]多孔性膜从阻挡性能和透水性能、分离性能、例如耐污染性的观点出发，优选为包含多孔质树脂层的多孔性膜。
[0049]包含多孔质树脂层的多孔性膜优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层发挥作用的多孔质树脂层。多孔质基材支撑多孔质树脂层而赋予分离膜以强度。
[0050]本发明中使用的多孔性膜在多孔质基材的表面具有多孔质树脂层时，无论多孔质树脂层渗透到多孔质基材中，还是多孔质树脂层不渗透到多孔质基材中，任一者均可，可根据用途选择。
[0051]多孔质基材的平均厚度优选为50 μ m~3000 μ m。
[0052]多孔质基材的材质包含有机材料和/或无机材料等，期望使用有机纤维。优选的多孔质基材是由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维制成的纺织布和/或无纺布，更优选使用密度的控制比较容易、制造也容易且廉价的无纺布。
[0053]多孔质树脂层可以适合使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，可列举例如，聚乙稀系树脂、聚丙稀系树脂、聚氣乙稀系树脂、聚偏_1，1- 二氣乙稀系树脂、聚讽系树月旨、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂为主成分的树脂的混合物。这里主成分是指该成分含有50重量％以上、优选60重量％以上。有机高分子膜的材质优选使用利用溶液的制膜容易且物理耐久性和/或耐化学性也优异的聚氯乙烯系树脂、聚偏-1，1- 二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂，最优选使用聚偏-1，1- 二氟乙烯系树脂或以其为主成分的树脂。
[0054]这里，作为聚偏-1，1-二氟乙烯系树脂，优选使用偏-1，1-二氟乙烯的均聚物。进而，聚偏-1，1-二氟乙烯系树脂还优选使用与可与偏-1，1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体的共聚物。作为可与偏-1，1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体，可例示四氟乙烯、六氟丙烯和
三氯氟乙烯等。
[0055]对本发明中作为分离膜使用的多孔性膜不特别限定，只要发酵中使用的微生物能够通过即可，但期望不易发生由发酵中使用的微生物的分泌物和/或发酵原料中的微粒造成的堵塞、且过滤性能为长时间稳定地继续的范围。因此，优选多孔性分离膜的平均细孔径为0.01 μ m以上且小于5 μ m。另外，进一步优选如果多孔性膜的平均细孔径为0.01 μ m以上且小于I μ m，则可以兼备微生物会不泄漏的高排除率和高透水性，可以具有更高的精度和再现性地实现长时间保持透水性。
[0056]如果与微生物的大小接近，则有时这些物质直接塞住孔,所以多孔性膜的平均细孔径优选小于I μ m。为了防止微生物的漏出、即排除率降低的不良状况发生，多孔性膜的平均细孔径优选与微生物的大小相比不过大。在使用微生物中细胞较小的细菌等时，作为平均细孔径优选为0.4 μ m以下，如果小于0.2 μ m，则可以更适合地实施。
[0057]另外，有时微生物生产除了作为所期望的生产物的化学品以外的物质，例如，蛋白质和/或多糖类等易凝集的物质，进而，有时由于培养液中的微生物的一部分死亡而生成细胞的破碎物，为了避免这些物质造成的多孔性膜的堵塞，平均细孔径更适合为0.Ιμπι以下。
[0058]如果平均细孔径过小，则多孔性膜的透水性能降低，即使膜不污染也不能有效地运转，因而本发明中的多孔性膜的平均细孔径优选为0.01 μ m以上，更优选为0.02 μ m以上，进一步优选为0.04 μ m以上。
[0059]这里，平均细孔径可以通过测定在倍率10，000倍的扫描型电子显微镜观察中能够在9.2 μ mX 10.4μπι的范围内观察到的全部细孔的直径，并进行平均来求得。平均细孔径或者也可以使用扫描型电子显微镜以倍率10，000倍将膜表面拍摄照片，随机选择10个以上、优选20个以上的细孔测定它们的细孔直径，并进行数平均而求得。在细孔不是圆形时，通过用图像处理装置等求出具有与细孔所具有的面积相等的面积的圆(等价圆)，以等价圆直径作为细孔的直径的方法来求得。
[0060]本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为Ο.?μπι以下。平均细孔径的标准偏差σ越小越好。平均细孔径的标准偏差σ可以将上述的能够在9.2 μ mX 10.4 μ m的范围内观察到的细孔数作为N，将测定的各个直径作为Xk，将细孔直径的平均作为X(ave)，通过下述式(I)算出。
【权利要求】
1.化学品的制造方法，是通过连续发酵来制造化学品的方法，包括:将微生物的培养液用分离膜过滤，将未过滤液保持在或回流至培养液中，在培养液中补加发酵原料，和回收过滤液中的生产物， 所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖，所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法，在体积传氧系数即KLa为5~300小时―1的条件下进行连续发酵。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法，所述发酵原料中所含的五碳糖与六碳糖的比率为1:9~9:1。
4.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法，所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的化学品的制造方法，五碳糖是木糖。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的化学品的制造方法，戊糖还原酶是木糖还原酶。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的化学品的制造方法，五醇脱氢酶是木糖醇脱氢酶。
【文档编号】C12P7/06GK104039969SQ201380005123
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2012年1月13日
【发明者】渡边志绪美, 小林宏治, 矶部匡平, 泽井健司, 罗景洙, 平松绅吾, 山田胜成 申请人:东丽株式会社