用于感测化学品的方法

专利名称：用于感测化学品的方法
技术领域：
本发明涉及用于感测化学品的方法，尤其涉及利用包含压电/热电换能器的化学 感测设备进行免疫测定。
背景技术：
免疫测定是测量生物流体中被分析物存在与否或者更通常地测量被分析物浓度 的测试。它通常涉及抗原对抗体的特异性结合。抗体可以是多株或者单株的，单株抗体具 有许多益处，包括生产可再现性以及对被分析物一个表位结合的抑制。为了提供被分析物 浓度的可量化测度，将应答与已知浓度的标准样品相比较。抗体或抗原的浓度可由多种方 法确定，虽然最常用的一种方法是标记抗原或抗体并且检测标记的存在。免疫测定可以是竞争性或者非竞争性的。在竞争性免疫测定中，未知样品中的抗 原与被标记抗原(所述“报告物”)竞争以与抗体结合，所述抗体通常被固定在固态。随后 通常通过分离并测量结合至固态的被标记抗原来测量结合至抗体位点的被标记抗原的量。 显然应答将与未知样品中抗体的浓度成反比。在相似测定原理中，溶液中的被标记抗体与 固定为固态且存在于样品中的抗原竞争，以给出类似的反比性。在非竞争性免疫测定(也 被称为免疫分析测定)中，未知样品中的抗原与过量的被固定抗体(“捕获”抗体)结合， 由此测量结合抗原的量。与竞争性方法不同，非竞争性方法的结果将与抗原浓度直接成比 例。在所谓的“双位点”免疫分析测定(也被称为“三明治测定”)中，抗原结合至捕获抗体 位点，随后引入被标记抗体，被标记抗体再与结合至捕获抗体的抗原结合。随后测量位点处 被标记抗体的量。在典型的三明治免疫测定中，所关注抗原特异性的抗体附着在聚合物支持物上， 比如聚苯乙烯的薄片上。待测试的一滴样品(例如，细胞提取物或者血清或尿的样品)被 置于薄片上，薄片在抗体-抗原复合物形成之后被清洗。然后加入抗原上的不同位点特异 性的抗体，再次清洗支持物。这第二种抗体携带标记(被标记的报告物)以便能被高灵敏 度地检测。结合到薄片上的第二种抗体的量与样品中的抗原数量成比例。这种测定以及这 种类型测定的其他变化众所周知，参见例如“The Immunoassay Handbook, 2nd Ed. ” David Wild, Ed. , Nature Publishing Group, 2001。这种免疫测定对于大分子量被分析物尤其工作良好，这主要是因为两个或更多个 表位可以被寻址；被分析物和抗体之间的互补性区域相对较大并且被分析物之间出现相对 较大的差异(例如，至少通过肽内的氨基酸)。对于小分子(有时也被称为“半抗原”，是一 种当附至诸如蛋白质的大载体时能够引起免疫应答的小分子)免疫测定，两个表位的缺乏 导致无法形成“三明治”。这为技术的进一步发展提供了动机。一种相对较新的免疫测定技术是所谓的“选择性抗体免疫分析”测定，它被设 计用于改善小分子检测的特异性和敏感性(参见N. Kobayashi和J. Goto，in Advances in Clinical Chemistry, Vol. 36, Ed. H. E. Spiegel 等人，Academic Press, 2001, pages 139-170并且尤其参见第155-158页的section 3. 3)。这一免疫测定同样具有优势，即提供了被分析物浓度和信号之间的直接关系，而不是通常在竞争性免疫测定中常见的反比关系。所述方案基于用多个半抗原标记的大分子掩蔽未被占领的抗体位点以允许随后 对半抗原占领抗体的选择性确定。首先，抗半抗原抗体被固定在(附至)固态支持物上。固 态支持物随后被暴露给含有未知被分析物(半抗原)以及多重接合至所述半抗原的大分子 的样品。被分析物和大分子随后为固态支持物上抗半抗原抗体的结合位点而竞争。被分析 物在大分子之前被引入，或者它们可被同时引入并被允许为表面而竞争，或者在大分子可 逆结合至所述表面的情况下，大分子可在被分析物之前被引入。随后添加与主抗体结合的 被标记次抗体。次抗体与没有结合大分子的主抗体结合。因为没有结合大分子的主抗体的 比例与被分析物的量直接成比例，所以该测度能够确定样品中存在的被分析物的量。该技术已被证明具有极高的敏感性和特异性，但是在当前实践中需要多次培育和 清洗步骤，因为清洗步骤对在确定存在的被标记抗体的量之前去除多余的未结合标记非常 重要。多次清洗显著增加的测定复杂性并因此实质上限制了该技术的应用性。

发明内容
因此，本发明提供一种用于检测样品中的被分析物的方法，包括以下步骤(i)提供包含热电或压电元件和电极的换能器、以及固定在换能器上的第一试剂， 其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，并且所述第一试剂具有能够在被分析物或 者被分析物的衍生物存在时结合第二试剂的结合位点；(ii)引入第二试剂，所述第二试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存 在时结合所述第一试剂的结合位点，并且具有附至其上的标记，所述标记能够吸收电磁辐 射以生成非辐射衰减的能量，其中第一试剂或者第二试剂能够结合被分析物或其衍生物；(iii)将样品暴露于换能器，由此允许被分析物或其衍生物与第一试剂或者第二 试剂结合；(iv)引入能够与被分析物或其衍生物同样结合至第一试剂或者第二试剂的掩蔽 试剂，由此阻止第一试剂对第二试剂的结合；(ν)用电磁辐射照射样品；(vi)将所生成的能量转换为电信号；以及(vii)检测所述电信号，其中步骤(ii)至(iv)能够以任意次序发生。于是，被标记的第二试剂(所述报告物)在被分析物或者被分析物的衍生物存在 且掩蔽试剂不存在时只能与第一(被固定)试剂结合，从而允许被分析物或者其衍生物与 所述掩蔽试剂竞争以与第一试剂或第二试剂结合。由于使用具有压电/热电膜的换能器的 结果，益处在于能够在无需进行分离和清洗步骤的情况下实时检测第二(被标记)试剂的
纟口口。本发明还提供一种套件，包括(i)用于检测样品中的被分析物的设备，所述设备 包括具有热电或压电元件和电极的换能器，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信 号；固定在换能器上的第一试剂，所述第一试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生 物存在时结合第二试剂的结合位点；(ii)第二试剂，所述第二试剂具有能够在被分析物或 者其衍生物存在时结合所述第一试剂的结合位点，并且具有附至其上的标记，所述标记能减的能量；以及，(iii)能够与被分析物或其衍生物同样 结合至第一试剂或者第二试剂的掩蔽试剂，由此阻止第一试剂对第二试剂的结合。还提供 一种用于检测样品中的被分析物的设备，所述设备包括具有热电或压电元件和电极的换 能器，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号；固定在换能器上的第一试剂，所述第 一试剂具有能够结合被分析物或者被分析物的衍生物并且能够在被分析物或者被分析物 的衍生物存在时结合第二试剂的结合位点；可释放地结合第一试剂的掩蔽试剂；电磁辐射 源；以及用于检测所述电信号的检测器。本发明还提供具有热电或压电元件和电极的换能 器的用途，用于检测选择性抗体免疫分析测定中的结合事件。


现在将参考附图描述本发明，其中图1示出了根据WO 2004/090512的设备；图2示出了本发明的方法的图形表达；图3示出了根据本发明的设备；以及图4示出了使用本发明方法的计数相对时间的图。
具体实施例方式本发明的方法提供用于检测样品中的被分析物。作为第一步骤，本发明包括提供 具有热电或压电元件和电极的换能器，所述换能器能够将能量变化转换成电信号并将样品 暴露于换能器。这类换能器是本领域内周知的，参见例如WO 90/13017和WO 2004/090512。 在此方面，图1示出了适于在本发明中使用的化学感测设备1的原理。设备1依靠用电磁 辐射照射物质2时物质2中的发热。设备1包括热电或压电换能器3，它具有电极涂层4、 5。优选情况下，换能器3是膜，例如极化聚偏氟乙烯膜。电极涂层4、5优选地由厚度大约 35nm的氧化铟锡形成的，尽管从Inm的下限至IOOnm的上限中的任何厚度都是可接受的， 但是低于下限时电导率太低，而高于上限时透光率太低(应当不低于95% T)。使用任何适 宜的技术使物质2保持在换能器3上或者接近换能器3，此处示出为附至上电极涂层4。所 述试剂可以是任何适宜的形式，并且可以淀积多种试剂。优选情况下，物质2被吸附在上电 极上，例如经由分子间力(比如离子键、氢键结合或范德瓦尔斯力)的共价耦合或结合。这 种设备的关键特征在于，在受到电磁辐射源6 (比如光，优选情况下是可见光)的照射时物 质2发热。光源可以是例如LED。光源6用适当波长(如补色)的光照亮物质2。尽管不 奢望成为理论上的结合，但是据信物质2吸收光以产生激发态，然后经历非辐射衰减从而 产生能量，由图1中的曲线所示。这种能量的主要形式为热(即环境中的热运动)，尽管也 可能产生其他形式的能量，如冲击波。无论如何，此能量由换能器检测并转换为电信号。对 本发明的设备由测定的具体试剂标定，因此并不需要确定由非辐射衰减所产生能量的确切 形式。除非另外指明，否则本文所用的术语“热”意味着由非辐射衰减所产生的能量。光源 6被定为以照亮物质2。优选情况下，光源6定位成与换能器3和电极4、5基本垂直，并透 过换能器3和电极4、5照亮物质2。光源可以是换能器内的内光源，其中光源是导波系统。 波导可以是换能器本身，也可以是附属于换能器的附加层。照明波长取决于使用的标记；例 如，对于40nm金标记，优选波长为525nm，而对于碳标记，优选波长为650nm。
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物质2所产生的能量由换能器3检测并转换为电信号。电信号由检测器7检测。 光源6和检测器7都在控制器8的控制下。在一个实施例中，光源6产生一系列光脉冲(除非说明特定波长，否则本文所用的 术语“光”意味着任何形式的电磁辐射)，术语为“断续光(chopped light)”。在原理上， 单个闪光，即电磁辐射的一个脉冲，便足以从换能器3产生信号。不过，为了获得可再现的 信号会使用多次闪光，因此实际上需要断续光。施加电磁辐射脉冲的频率可以变化。在下 限处，脉冲之间的时延必须足以确定每个脉冲和电信号生成之间的时延。在上限处，每个 脉冲之间的时延必须不会大到使得记录所述数据所花时间变得不合情理地延长。优选情 况下，脉冲频率从2至50Hz，更优选情况下，5至15Hz，最优选情况下，10Hz。这分别对应于 20-500ms,66-200ms和IOOms的脉冲间时延。此外，所谓的“脉冲间隔”比，即通信号与断 信号的比值，优选情况下是1，尽管在特定情况下可以优选地使用其他比值。以不同调制频 率或不同脉冲间隔比产生调制光的电磁辐射源是本领域内公知的。检测器7确定光源6的 每一个光脉冲与检测器7检测的来自换能器3的对应电信号之间的时延(或者说“相关延 迟”)。申请人已经发现，这种时延是距离d的函数。确定每一个光脉冲与对应电信号之间的时延的任何方法只要提供可再现结果就 都可以使用。优选情况下，测量从每一个光脉冲的起点到检测器7检测到与热吸收对应的 电信号的最大值点间的时延。因此，物质2可以与换能器表面分离并仍然能够检测到信号。另外，不但所述信号 经过能够向换能器3传送能量的中间介质可检测，而且可以区分不同距离d(这已被称为术 语“深度剖析”)，所收到信号的强度与相距换能器3表面具体距离d处物质2的浓度成比 例。图2示出了在根据本发明的选择性抗体免疫分析测定中并入图1的设备1。图中 示出了竖直排列的换能器3，虽然在某些情况下其他定向是可能甚至是有利的。换能器3涂 有图2所示的第一试剂，作为第一抗体9 (被固定的捕获抗体)。样品还包括被分析物10以 及结合了标记12的第二抗体11 (对应于图1中的物质2)。已产生抗被分析物10的第一抗体9，并且所述第一抗体9在样品被引入时选择性 地结合至被分析物10。然而，掩蔽试剂13也并入样品。在此例中，掩蔽试剂13能够结合第 一抗体9。掩蔽试剂13典型地是具有能够结合第一试剂9的多个位点13b的大分子13a。 大分子上的结合位点优选地是与被分析物或其衍生物相同的化学结构的部分。大分子可以是提供与第二试剂11结合的必要位阻并且可被多重接合的任何分 子。例子包括多糖、诸如聚苯乙烯或乳胶的合成聚合物、以及诸如聚(L-赖氨酸)的多肽。 大分子的分子量优选地是被分析物的10倍，更优选地是被分析物的100至1000倍，例如带 有5，000至500，OOODalton的分子量。可以使用的掩蔽试剂的一种具体类型是个体基因型 抗体，该抗体确切识别表面上捕获剂的结合位点。图2示出了与换能器3表面上的多个第一抗体9结合的掩蔽试剂13。然而，其中 有两个第一抗体9被示出为与被分析物10结合。与被分析物10结合的抗体9能够进一步 与附至标记12的第二抗体11结合。第二抗体11具有能够在被分析物或者被分析物的衍 生物存在而掩蔽试剂13不存在时与第一试剂9结合的结合位点，因为掩蔽试剂13原理上 通过位阻来阻滞结合位点。
重要的是，本发明的方法允许在无需分离和清洗步骤的情况下实时检测第二抗体 11与第一试剂9的结合。这是本领域内的一大进步。于是，在优选实施例中，就能够在将 样品暴露于换能器3和照射样品的步骤之间无需从换能器3移除样品的情况下进行测定。 此外，在步骤(ii)至(iv)之间不需要进一步的介入(例如，分离结合的和未结合的第二试 剂)。未结合至表面的第二试剂自由扩散远离表面。优选地，允许第二试剂仅通过扩散 变得与表面分离。图2示出了其中掩蔽试剂结合至第一试剂的一个实施例，虽然其他示例也包括在 本发明的范围内。本发明的一个关键特征是在掩蔽试剂存在时将换能器暴露于样品，并且 在于该掩蔽试剂能够与第一或者第二试剂结合以阻止第一试剂与第二试剂的结合。掩蔽试 剂还与被分析物或其衍生物同样结合至第一或者第二试剂。于是，如果第一试剂能够结合 被分析物或其衍生物，那么第一试剂还将结合掩蔽试剂，而第二试剂将不结合被分析物或 其衍生物或者掩蔽试剂。经适当修正后，这同样适用于第二试剂。通过破坏这一结合以及 与被分析物竞争，掩蔽试剂能够使得与第一试剂结合的第二试剂的量与样品中存在的被分 析物的量成比例。在此方面，掩蔽试剂能够在换能器暴露于样品之前可释放地结合第一或第二试剂 (用掩蔽试剂预培育第一或第二试剂)，或者掩蔽试剂能够与样品基本同时引入。当掩蔽试剂在换能器暴露于样品之前结合第一或第二试剂时，该掩蔽试剂必须可 释放地结合以允许被分析物或其衍生物结合第一或第二试剂。可释放的结合意味着掩蔽试 剂能够结合第一或第二试剂，但是该掩蔽试剂由被分析物或其衍生物代替以结合第一或第 二试剂。当掩蔽试剂与样品基本同时引入时，结合是可释放的，但这不是必须的，因为掩蔽 试剂仍然能够与被分析物或其衍生物竞争以结合第一或第二试剂。当结合是可释放的时， 优选所述掩蔽试剂可逆结合第一或第二试剂，即在结合和非结合状态之间存在平衡。虽然在图2中用第一和第二抗体例示了第一和第二试剂，但是本发明并非仅限于 此。因此，虽然第一和第二试剂优选地是抗体，但是也可以使用其他的试剂，诸如核酸。在一 个优选实施例中，本发明提供一种执行选择性抗体免疫分析测定以检测样品中的被分析物 (有时也被称为“半抗原”，是一种当附至诸如蛋白质的大载体时能够引起免疫应答的小分 子)的方法，包括如下步骤(i)提供包含热电或压电元件和电极的换能器、以及固定在换 能器上的第一抗体，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，并且所述第一抗体能 够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合第二抗体；(ii)引入第二抗体，所述第二 抗体能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合所述第一抗体，并且具有附至其上 的标记，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，其中第一或者第二抗体能 够结合被分析物或其衍生物；(iii)将样品暴露于换能器，由此允许被分析物或其衍生物 与第一或者第二抗体结合；(iv)引入能够与被分析物或其衍生物同样结合至第一或者第 二抗体的掩蔽试剂，由此阻止第一抗体对第二抗体的结合；(ν)用电磁辐射照射样品；(Vi) 将所生成的能量转换为电信号；以及(Vii)检测所述电信号，其中步骤(ii)至(iv)能够以 任意次序发生。优选所述结合是可逆的。图2示出的第一试剂9附至换能器3的表面并且优选地被吸收至换能器上。该表 面还可由其他涂层(例如来自 SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA 的 Stabilcoat)覆
9盖以使得表面稳固。如上参考图2所讨论的，第二试剂11具有附至其上的标记12。标记12能够吸收 由辐射源生成的电磁辐射以生成非辐射衰减的能量。于是，为了检测换能器3附近标记12 的存在，样品由一系列电磁辐射脉冲照射。换能器3将生成的能量转换成电信号，并且电信 号由检测器7检测。标记12可以是能够与由辐射源生成的电磁辐射相互作用以生成非辐射衰减的能 量的任何材料。优选的，标记包括但不限于碳微粒、有色聚合物微粒(例如，有色橡胶)、 染料分子、酶、荧光分子、金属(例如，金)微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核心 材料以及至少一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。在磁性微粒的情况下，电磁辐射是射频辐射。上述提及的所有其他标记利用包 括IR或UV辐射的光。优选地，标记是金微粒或者碳微粒。碳微粒的益处在于它们在所 有关注波长上的吸收完全均勻，并且远没有测定期间最小化其沉降的大多数金属离子那 样密集。金微粒市面有售，并且可以使用公知方法制备(参见例如G.Frens，Nature, 241, 20-22(1973))。对于纳米微粒标记的更详细解释参见US 6，344，272和WO 2007/141581。优选地，本发明使用具有20至1，OOOnm,优选地100至500nm微粒尺寸的微粒。微 粒尺寸是指微粒在其最宽点处的直径。标记12在结合事件已发生时接近换能器。也就是说，标记与换能器表面足够接近 使得换能器能够检测在照射样品时由标记生成的能量。尽管如此，标记和换能器表面的实 际距离将取决于多个变量，诸如标记的尺寸和特性、第一和第二抗体以及被分析物的尺寸 和特性、样品培养基的特性、以及电磁辐射的特性和相应的检测器设置。对于电磁辐射的特 性，本发明的设备可以包括适于生成一系列电磁辐射脉冲的辐射源以及适于确定来自辐射 源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时延的检测器，由此允许精确确定标记相对于 图1讨论的换能器的定位。虽然认为未知样品包含被分析物，但是本发明的测定当然可用于确定被分析物的 存在与否。被分析物优选地是小分子，因此所述测定理想地使用这类分子，虽然本发明并不 限于此。本文使用的术语“小分子”是本领域内的术语并且用于与诸如蛋白质和核酸之类 的大分子相区别。小分子在免疫测定领域内通常被称为“半抗原”，一种当附至诸如蛋白质 的大载体时能够引起免疫应答的小分子，并且包括诸如激素及合成药物的分子。这类小分 子通常具有2，000或以下的分子量，经常具有1，000或以下甚至500或以下的分子量。第 一试剂可适于结合至被分析物本身，虽然被分析物在与第一试剂结合之前可以经历化学反 应或者初始络合事件。例如，被分析物可以在测定的PH条件下质子化/去质子化。于是， 与第一试剂结合的被分析物可以是被分析物本身或者被分析物的衍生物；这两者都位于本 发明的范围内。包含或者不包含所关注被分析物的样品一般将会是流体样品并且通常是生物样 品(因此是含水的)，诸如像是血液、血浆、唾液、血清或尿的体液。样品可以包含悬浮颗粒， 甚至可以是全血。本发明的方法的一个优点在于可以对包含悬浮颗粒的样品执行测定而不 会不恰当地影响测定结果。样品典型地具有微升量级(例如，1-100 μ L，优选地1-10 μ L)。 为了保用流体样品，换能器优选地位于样品室内并且更优选地地位于凹槽(well)内。在一 个优选实施例中，换能器集成到室内，即形成限定室的壁之一。样品可以简单地由表面张力保持，例如在毛细管道内。本发明还提供用于执行本文描述的测定的设备和套件。套件包括用于检测基本参 考图1在本文描述的样品中的被分析物的设备。所述设备包括具有热电或压电元件和电极 的换能器，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号；固定在换能器上的第一试剂，所 述第一试剂具有能够结合被分析物或者被分析物的衍生物的结合位点；掩蔽试剂，在样品 添加之前添加到含有被分析物的样品中或者可释放地结合第一试剂；电磁辐射源；以及用 于检测所述电信号的检测器。套件还包括第二试剂，该第二抗体具有能够在被分析物或其 衍生物存在而掩蔽试剂不存在时与第一试剂结合的结合位点。第二试剂可以在使用之前干 燥附至室的内表面之一，以便在样品引入时被释放。在一个优选实施例中，设备实质上由上 述特征组成。“实质上”意味着无需其他特征就能执行该测定。该设备可以采用手持便携读取器和包含换能器的一次性设备的形式。在实质上封 闭的系统内收集样品，与第二试剂混合，并且置于读取器内，后者会执行样品照射并且检测 得到的电信号。本发明还提供具有热电或压电元件和电极的换能器的用途，用以检测选择性抗体 免疫分析测定中的结合事件。选择性抗体免疫分析测定是涉及在第一抗体结合被分析物或 者被分析物的衍生物时第二抗体结合第一抗体但不结合掩蔽试剂的测定。示例例 1活性压电/热膜生物传感器的制备在如下示例中用作以下示例中感测设备的涂覆在氧化铟锡中的极化聚偏二氟乙 烯双晶压电膜在低湿度环境中在聚苯乙烯溶液(1%甲苯)中浸涂以在氧化铟锡顶上给 出聚苯乙烯层。该双晶压电膜随后在室温下整夜培育以在聚抗生蛋白链菌素溶液(PBS 中 200 μ g/mL,其中 PBS 是包含 2. 7mmol/L KC1、137mmol/L NaCl 和 0. 05 % 吐温的 pH 7.5 lOmmol/L磷酸盐缓冲液)中浸涂。聚抗生蛋白链菌素的制备由Tischer等人(US 5，061，640)描述。为了制备“捕获”表面，用生物素标记的抗睾酮(Ml)培育聚抗生蛋白链菌素表 面，以提供涂覆抗体的表面(Cl)。在室温下在PBS中整夜培育lOug/mL的生物素标记的 抗睾酮(HyTest Ltd, Turku, Finland, Cat # 2T2_biotin, or Accurate Chemical Co, ffestbury, New York, USA, Cat # BHSl 13)并在随后用过量PBS冲洗并在40°C下干燥之前 M Stabilcoat (SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)涂覆。抗体用本领域技术人员已知的方法生物素标记。例如，通过溶解冻干的抗体或者 通过稀释来制备PBS中的5mg/ml抗体溶液。如果该溶液包含其他蛋白质或三羟甲基氨基 甲烷或其他干扰剂，则通过透析或凝胶过滤进行净化。随后在无水DMSO中制备20mmol/L NHS-生物素溶液并且添加15 μ L的NHS-生物素溶液至抗体(ImL)。在室温下培育1小时 并在随后针对包含叠氮化钠(.01%)的PBS透析抗体。用0. 的叠氮化钠和20%的甘油 将生物素标记的抗体稀释至lmg/mL以供在-20°C和+4°C下存储。生物素标记水平应该在 每IgG 1-3生物素的范围内。这能够通过生物素定量来评估，或者对于高生物素标记速率， 通过胺的差异定量来评估。Ml
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报告物结合物的制备碳标记的报告物结合物实质上按照Van Doom等人(US 5，641，689)的描述制备。 为了制备涂覆抗体的报告物结合物(Cl)，室温下用200 μ g/mL聚抗生蛋白链菌素溶液在 5mmol/L磷酸盐缓冲液pH 6. 2中摇动培育ImL of Special Black-4 RCC标称150nm碳微 粒(Degussa，Essen，Germany)整夜，得到涂覆抗生蛋白链菌素的表面。得到的碳结合物(通 过离心、粒化和再悬浮)。随后用Iml的这一涂覆抗生蛋白链菌素的碳微粒悬浮液整夜摇 动培育PBS中抗抗体物种反应的lOug/mL的生物素标记的次单株抗体(M2)，其中该抗体种 用作抗睾酮捕获抗体(Ml)的源。用pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液清洗得到的碳结合 物(C2)3次(通过离心、粒化和再悬浮)并在4°C下暗处存储。为了清楚，如果抗睾酮抗体 (Ml)是单株小鼠抗体，那么次单株抗体(M2)是抗全小鼠抗体反应而产生的山羊抗体(所谓 的“山羊抗小鼠抗体”)。当然，可以使用任何其他的单株和多株的物种对，并且这些是本领 域技术人员周知的。例 3掩蔽试剂的制备为了制备涂覆抗体的掩蔽试剂(MR1)，室温下用30nmol/L的7ci-C6-生物素 标记的睾酮在5mmol/L磷酸盐缓冲液pH 6. 2中整夜摇动培育ImL的涂覆抗生蛋白链菌 素的聚苯乙烯胶乳微粒(标称直径23nm)Bangs Laboratories P/N PS02N/8192 (Bangs Laboratories Inc，Fishers IN，USA)，正如 Luppa 等人描述的那样进行制备(Clin. Chem. 1997，43，2345，)。用上述pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液清洗得到的结合物3次 并在4°C下暗处存储。例 4掩蔽的涂覆抗体的膜的制备为了制备掩蔽的压电膜表面(C3)，在室温下用涂覆抗原的掩蔽试剂(所述MRl)在 PBS中整夜培育一片涂覆抗体的压电膜(如上所述，Cl)，随后用过量PBS清洗该压电膜并 在 40°C干燥前用 Stabilcoat (SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)涂覆。M 5测定——涂覆抗体的压电/热膜传感器和掩蔽试剂如图3所述，制造传感器1以执行测定。传感器1由一片抗体涂覆的压电膜3(如 上所述，C3)和一片透明聚碳酸酯盖膜14制成。上述两膜用间隔物15隔开约500微米的 距离，其中该间隔物15由一片涂覆粘合剂的压敏聚酯膜制成并被冲切形成两个尺寸不等 的室16、17 ；大小约为30 χ 10 χ 0. 5mm的室16用于测定反应而大小为10 χ 10 χ 0. 5mm 的较小的第二室用于控制反应。提供结构用以允许至压电膜顶表面和底表面的电连接，由 此检测生成的电荷。通过用0. lmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和PBS中的睾酮标准品以给出 0. l-100nmol/L最终浓度范围的混合物(通过填充孔18)填充较大的室16来执行测定，其 中三羟甲基氨基甲烷缓冲液包含0. 150mol/LMgCl2和0. 075%吐温20溶液，包含涂有生物 素标记的抗体(C2，如上所述)的150nm胶质碳微粒(最终浓度为0. 0025%固体)，并且其 中所述生物素标记的抗体抗捕获抗体(Ml)反应。控制室17同时填充与测定室相同的反应 混合物，不同之处在于用PBS代替睾酮标准品。入口和出口被密封并将室组件连至测试仪
12器，使得压电膜3垂直于室的侧面定向。随后顺序用四个LED(波长625nm)以断续LED光 照射压电膜，其中三个LED照射测定室表面的不同区域，一个照射控制室的压电膜表面。对 于每个LED脉冲，使用锁定放大器和模数(ADC)转换器测量跨压电膜的电压。ADC信号随时 间的标绘以及ADC计数/min相对于睾酮浓度的关系在图4中示出。
权利要求
一种用于检测样品中的被分析物的方法，包括以下步骤，(i)提供包含热电或压电元件和电极的换能器、以及固定在换能器上的第一试剂，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，并且所述第一试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合第二试剂的结合位点；(ii)引入第二试剂，所述第二试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合所述第一试剂的结合位点，并且具有附至其上的标记，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，其中第一试剂或者第二试剂能够结合被分析物或其衍生物；(iii)将样品暴露于换能器，由此允许被分析物或其衍生物与第一试剂或者第二试剂结合；(iv)引入能够与被分析物或其衍生物同样结合至第一试剂或者第二试剂的掩蔽试剂，由此阻止第一试剂对第二试剂的结合；(v)用电磁辐射照射样品；(vi)将所生成的能量转换为电信号；以及(vii)检测所述电信号，其中步骤(ii)至(iv)能够以任意次序发生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂是抗体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述掩蔽试剂是具有能够结合第一试剂的多个 位点的大分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述大分子上的位点是具有与被分析物或其衍生物 相同的化学结构的部分。
5.如前述任一权利要求所述的方法，其中在将换能器暴露于样品之前，所述掩蔽试剂 可释放地结合第一或第二试剂。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述掩蔽试剂与所述样品被基本同时 引入。
7.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述掩蔽试剂可逆地结合第一或第二试剂。
8.如在前任一权利要求所述的方法，其中标记选自碳微粒、有色聚合物微粒、染料分 子、酶、荧光分子、金属(例如，金)微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核材料以及 至少一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。
9.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述第一试剂吸附在所述换能器上。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一试剂共价结合所述换能器。
11.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述换能器位于样品室内。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述室是凹槽。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述换能器集成至所述室。
14.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述样品包括悬浮颗粒。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述样品是全血。
16.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述辐射源适于生成一系列电磁辐射脉冲， 以及所述检测器适于确定来自辐射源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时延。
17.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述方法在将样品暴露于换能器和照射样 品的步骤之间无需从换能器移除样品的情况下进行。
18.一种套件，包括(i)用于检测样品中的被分析物的设备，所述设备包括具有热电或压电元件和电极的换能器，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号；固定在换能 器上的第一试剂，所述第一试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合第 二试剂的结合位点；(ii)第二试剂，所述第二试剂具有能够在被分析物或者其衍生物存在 时结合所述第一试剂的结合位点，并且具有附至其上的标记，所述标记能够吸收电磁辐射 以生成非辐射衰减的能量；以及，(iii)能够与被分析物或其衍生物同样结合至第一试剂 或者第二试剂由此阻止第一试剂对第二试剂的结合的掩蔽试剂。
19.如权利要求18所述的套件，其中所述第一试剂和所述第二试剂是抗体。
20.如权利要求18或19所述的套件，其中所述掩蔽试剂是具有能够结合第一试剂的多 个位点的大分子。
21.如权利要求20所述的套件，其中所述大分子上的位点是具有与被分析物或其衍生 物相同的化学结构的部分。
22.如权利要求18至21中任一项所述的套件，其中在将换能器暴露于样品之前，所述 掩蔽试剂可释放地结合第一试剂或者第二试剂。
23.如权利要求18至22中任一项所述的套件，其中所述掩蔽试剂可逆地结合第一或第 二试齐LU
24.如权利要求18至23中任一项所述的套件，其中标记选自碳微粒、有色聚合物微 粒、染料分子、酶、荧光分子、金微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核材料以及至少 一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。
25.如权利要求18至24中任一项所述的套件，其中所述第一试剂吸附在所述换能器上。
26.如权利要求18至24中任一项所述的套件，其中所述第一试剂共价结合所述换能器。
27.如权利要求18至26中任一项所述的套件，其中所述设备还包括样品室并且所述换 能器位于所述样品室内。
28.如权利要求27所述的套件，其中所述室是凹槽。
29.如权利要求27或28所述的套件，其中所述换能器集成至所述室。
30.如权利要求18至29中任一项所述的套件，其中所述辐射源适于生成一系列电磁辐 射脉冲，以及所述检测器适于确定来自辐射源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时 延。
31.一种用于检测样品中的被分析物的设备，所述设备包括具有热电或压电元件和 电极的换能器，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号；固定在换能器上的第一试 剂，所述第一试剂具有能够结合被分析物或者被分析物的衍生物并且能够在被分析物或者 被分析物的衍生物存在时结合第二试剂的结合位点；可释放地结合第一试剂的掩蔽试剂； 电磁辐射源；以及用于检测所述电信号的检测器。
32.如权利要求31所述的设备，其中所述第一试剂是抗体。
33.如权利要求31或32所述的设备，其中所述掩蔽试剂是具有能够结合第一试剂的多 个位点的大分子。
34.如权利要求33所述的设备，其中所述大分子上的位点是具有与被分析物或其衍生 物相同的化学结构的部分。
35.如权利要求31至34中任一项所述的设备，其中所述第一试剂吸附在所述换能器上。
36.如权利要求31至34中任一项所述的设备，其中所述第一试剂共价结合所述换能ο
37.如权利要求31至36中任一项所述的设备，其中所述设备还包括样品室并且所述换 能器位于所述样品室内。
38.如权利要求37所述的设备，其中所述室是凹槽。
39.如权利要求37或38所述的设备，其中所述换能器集成至所述室。
40.如权利要求31至39中任一项所述的设备，其中所述辐射源适于生成一系列电磁辐 射脉冲，以及所述检测器适于确定来自辐射源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时 延。
41.具有热电或压电元件和电极的换能器的用途，用于检测选择性抗体免疫分析测定 中的结合事件。全文摘要
本发明涉及一种用于检测样品中的被分析物(10)的方法，包括以下步骤(i)提供包含热电或压电元件和电极的换能器(3)、以及固定在换能器上的第一试剂(9)，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，并且所述第一试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合第二试剂(11)的结合位点；(ii)引入第二试剂，所述第二试剂具有能够在被分析物或者被分析物的衍生物存在时结合所述第一试剂的结合位点，并且具有附至其上的标记(12)，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，其中第一试剂或者第二试剂能够结合被分析物或其衍生物；(iii)将样品暴露于换能器，由此允许被分析物或其衍生物与第一试剂或者第二试剂结合；(iv)引入能够与被分析物或其衍生物同样结合至第一试剂或者第二试剂的掩蔽试剂(13)，由此阻止第一试剂对第二试剂的结合；(v)用电磁辐射照射样品；(vi)将所生成的能量转换为电信号；以及(vii)检测所述电信号，其中步骤(ii)至(iv)能够以任意次序发生。
文档编号G01N33/543GK101981451SQ200980111669
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年4月2日
发明者S·A·罗斯, T·J·N·卡特 申请人:维瓦克塔有限公司