一种酿酒酵母菌的驯化方法
【专利摘要】本发明提供一种酿酒酵母菌的驯化方法为：酿酒酵母菌活化；将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(80～90)：(10～20)；将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(60～70)：(30～40)；以后每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70％。本发明驯化后的酵母菌适应复杂环境，可以代谢五碳糖和六碳糖，不用经过脱毒即可直接进行乙醇发酵，而且保持较高的乙醇生产能力，降低了生产纤维素乙醇的生产成本。
【专利说明】一种酿酒酵母菌的驯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，特别涉及酿酒酵母菌的驯化方法。
【背景技术】
[0002]纤维素乙醇是指以纤维素生物质为原料生产的乙醇。纤维素生物质是由纤维素(30-50% )，半纤维素(20-40% )，和木质素(15-30% )组成的复杂材料，其可以为农作物秸杆、林业加工废料、甘蔗渣等废弃物。
[0003]纤维素乙醇的生产方法为:以纤维素生物质为原料，通过纤维素酶使其中的纤维素水解为单糖，再通过酿酒酵母菌使所生成的单糖发酵生产出含有乙醇的成熟醪液，对醪液进行精馏、脱水就可以得到乙醇。其中，采用的酿酒酵母菌属于酵母菌科，单细胞，卵圆形或球形。虽然酿酒酵母菌形态简单，但是其生理却比较复杂。在纤维素乙醇的生产中，酿酒酵母菌将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧条件下，经过内酶的作用，将单糖分解为二氧化碳和酒精。
[0004]纤维质生物质中的糖以纤维素和半纤维素的形式存在。纤维素中的六碳糖和和玉米淀粉中含有的葡萄糖一样，可以用传统的酵母发酵成乙醇。而半纤维素中含有的糖主要为五碳糖，传统的酵母无法经济地将其转化为乙醇。而且，在将纤维素生物质水解为单糖的过程中，会产生大量的弱酸、糠醛、5-羟甲基糖醛及芳香族化合物，这些物质会抑制酵母菌种在处理后的酶解液中的生长和发酵，导致生产乙醇的能力下降。
[0005]因此驯化酵母菌株，对秸杆等纤维素生物质的水解产物进行发酵，高效代谢五碳糖和六碳糖，对降低纤维素乙醇的生产成本，进行大规模工业化生产具有重大意义。
【发明内容】
[0006]本发明解决的技术问题在于提供一种酿酒酵母菌的驯化方法，驯化得到的菌株可以有效利用发酵糖液中的五碳糖，生产乙醇的能力强。
[0007]本发明公开了一种酿酒酵母菌的驯化方法，包括以下步骤:
[0008](A)酿酒酵母菌活化；
[0009](B)将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(80?90): (10?20)；
[0010](C)将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为￠0?70):(30?40)；以后每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ；
[0011]所述酶解糖液的制备方法为:
[0012]将农作物秸杆进行汽爆预处理，然后添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液；
[0013]所述汽爆预处理的蒸汽压力为1.2?1.8MPa，汽爆预处理的时间为8?15分钟。
[0014]优选的，所述酿酒酵母菌为安琪酿酒干酵母。
[0015]优选的，所述步骤(A)具体为:
[0016]将酿酒酵母菌液体培养基中进行活化，所述活化的温度为35?40°C，活化时间为0.5?1.5小时。
[0017]优选的，所述步骤(B)中，所述培养温度25?35°C。
[0018]优选的，所述步骤⑶中，所述培养时间为8?12小时。
[0019]优选的，所述步骤⑶中，所述培养的PH值为4.0?5.0。
[0020]优选的，所述步骤(C)中，所述玉米糖化醪的制备方法为:
[0021]将玉米粉在液化酶作用下于90?10(TC，液化90?120分钟；然后加入糖化酶，50?60°C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
[0022]优选的，所述混合物中还包括:0.075%的磷酸二铵，0.075%的尿素和0.05%的硫酸镁。
[0023]优选的，所述步骤(C)中，所述扩大培养为2?10代。
[0024]优选的，所述纤维素酶的添加量为预处理产物绝干质量的I?1.5%。
[0025]与现有技术相比，本发明利用经汽爆预处理及酶解得到的酶解糖液作为底物之一，逐渐增加其在培养中的比例，使普通酿酒酵母菌逐渐适应所述酶解糖液的环境，加快对所述酶解糖液的代谢速度。所述酶解糖液中的组分复杂，含有五碳糖、六碳糖及抑制剂等物质，因此用该酶解糖液驯化后的酵母菌适应复杂环境，可以代谢五碳糖和六碳糖，不用经过脱毒即可直接进行乙醇发酵，而且保持较高的乙醇生产能力，降低了生产纤维素乙醇的生产成本。
【具体实施方式】
[0026]为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0027]本发明实施例公开了一种酿酒酵母菌的驯化方法，包括以下步骤:
[0028](A)酿酒酵母菌活化；
[0029](B)将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(80?90): (10?20)；
[0030](C)将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为￠0?70):(30?40)；以后每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ；
[0031]所述酶解糖液的制备方法为:
[0032]将农作物秸杆进行汽爆预处理，然后添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液；
[0033]所述汽爆预处理的蒸汽压力为1.2?1.8MPa，汽爆预处理的时间为8?15分钟。
[0034]本发明利用组份复杂的酶解糖液培养酿酒酵母菌，增加酵母菌对于五碳糖和六碳糖的代谢能力，不用经过脱毒即可直接进行乙醇发酵，而且保持较高的乙醇生产能力，降低了生产纤维素乙醇的生产成本。
[0035]按照本发明，首先对酿酒酵母菌进行活化。所述酿酒酵母菌优选为安琪酿酒干酵母。所述活化的方法优选为:将酿酒酵母菌液体培养基中进行活化，所述活化的温度为35?40°C，活化时间为0.5?1.5小时。本发明对于液体培养基的组成没有特殊限制，选用本领域技术人员熟知的活化培养基即可。
[0036]得到活化后的菌种后，将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母。所述玉米糖化醪制备方法优选为:
[0037]将玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分钟；然后加入糖化酶，50?60°C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
[0038]所述酶解糖液的制备方法为:
[0039]将农作物秸杆进行汽爆预处理，然后添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液；
[0040]所述汽爆预处理的蒸汽压力为1.2?1.8MPa，汽爆预处理的时间为8?15分钟。
[0041]在所述制备酶解糖液的过程中，所述纤维素酶的添加量优选为预处理产物绝干质量的I?1.5%，更优选为1.2%?1.3%。所述酶解时的PH值优选为4.0?5.0，更优选为 4.3 ?4.8。
[0042]按照本发明，培养小酒母的过程中，所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(80?90):(10?20)，优选为90:10，85:15或88:12。所述混合物中，优选的还可以加入营养盐，如0.075%的磷酸二铵，0.075%的尿素和0.05%的硫酸镁。所述培养的温度优选为25?35°C，更优选为28?32°C。所述培养时间优选为8?12小时，更优选为9?10小时。所述培养的PH值优选为4.0?5.0,更优选为4.3?4.8。
[0043]按照本发明，得到所述小酒母后，将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母。所述混合物中，优选的还可以加入营养盐，如0.075%的磷酸二铵，0.075%的尿素和0.05%的硫酸镁。所述多代指两代及两代以上。在扩大培养中使用的酶解糖液与所述培养小酒母过程中使用的酶解糖液相同。在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(60?70): (30?40)，优选为70:30 ;然后在以后每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70%。本发明对每一代扩大培养中，酶解糖液的增加量没有特殊限制，可以根据本领域技术人员的经验适当调节。优选的，每一代扩大培养中，酶解糖液的增加量为玉米糖化醪和酶解糖液重质量的10%，直至所述混合物中的酶解糖液质量为85%?95%。所述扩大培养的代数优选为2?10代。所述扩大培养的温度优选为25?35°C，更优选为28?32°C。所述扩大培养时间优选为8?12小时，更优选为9?10小时。所述扩大培养的PH值优选为4.0?5.0，更优选为4.3?4.8。
[0044]为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的酿酒酵母菌的驯化方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0045]将玉米粉在液化酶作用下于90°C，液化100分钟；然后加入糖化酶，60°C反应35分钟，得到玉米糖化醪。以下实施例均采用所述的玉米糖化醪。
[0046]实施例1
[0047]配置活化培养基:将2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二铵，0.375克尿素，0.25克硫酸镁混合，加水至500ml。
[0048]制备酶解糖液:将I吨农作物秸杆在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分钟，迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1.2%添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4.8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0049]在所述活化培养基中添加干酵母0.5g，摇匀后置38°C水浴锅活化I小时。
[0050]将20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和1ml酶解糖液中，置于30°C水浴锅中，通风培养10小时，得到小酒母。
[0051]将150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.5，置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0052]将150ml第一代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.5，置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母。所述第二代大酒母即可用于发酵。
[0053]采用所述第三代大酒母进行发酵:用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接种量，即25g成熟第二代大酒母接入，置培养箱厌氧发酵> 50小时。在50小时后，葡萄糖全部被代谢，乙醇浓度为62.0g/L，乙醇产率为0.48g/g，达到理论值得92%。五碳糖代谢60%，乙醇浓度0.71g/L，乙醇产率为0.05g/g。
[0054]在相同条件下，用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接种量，即25g活化后的酿酒酵母接入，置培养箱厌氧发酵72小时。五碳糖代谢40%，乙醇产率只有0.36g/g，糖占理论产率的70.1%。
[0055]实施例2
[0056]配置活化培养基:将2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二铵，0.375克尿素，0.25克硫酸镁混合，加水至500ml。
[0057]制备酶解糖液:将I吨农作物秸杆在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分钟，迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1.2%添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4.8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0058]在所述活化培养基中添加安琪酿酒干酵母0.5g，摇匀后置36°C水浴锅活化1.2小时。
[0059]将20克所述活化的酵母加入到85ml玉米糖化醪和15ml酶解糖液中，调整PH为4.5，置于28°C水浴锅中，通风培养12小时，得到小酒母。
[0060]将150ml成熟的小酒母加入到280ml玉米糖化醪和120ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.5，置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0061]将150ml第一代大酒母加入到200ml玉米糖化醪和200ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.5，置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母；
[0062]将150ml第二代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.5，置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第三代大酒母；所述第三代大酒母即可用于发酵。
[0063]实施例3
[0064]配置活化培养基:将2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二铵，0.375克尿素，0.25克硫酸镁混合，加水至500ml。
[0065]制备酶解糖液:将I吨农作物秸杆在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分钟，迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1.2%添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4.8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0066]在所述活化培养基中添加干酵母0.5g，摇匀后置38°C水浴锅活化I小时。
[0067]将20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和1ml酶解糖液中，置于30°C水浴锅中，通风培养10小时，得到小酒母。
[0068]将150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.2，置于28°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0069]将150ml第一代大酒母加入到80ml玉米糖化醪和320ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.2，置于28°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母。
[0070]将150ml第二代大酒母加入到400ml酶解糖液的混合物中，调整PH为4.2，置于28°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第三代大酒母；所述第三代大酒母即可用于发酵。
[0071]第三代大酒母的显微结构:细胞数彡3.0亿/ml，出芽率彡15%，无死亡，个体较大且饱满。
[0072]采用所述第三代大酒母进行发酵:用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接种量，即25g成熟第三代大酒母接入，置培养箱厌氧发酵> 50小时。在50小时后，葡萄糖全部被代谢，乙醇浓度为62.lg/L，乙醇产率为0.46g/g，达到理论值得90%。五碳糖代谢60%，乙醇浓度0.71g/L，乙醇产率为0.05g/g。
[0073]在相同条件下，用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接种量，即25g活化后的酿酒酵母接入，置培养箱厌氧发酵72小时。五碳糖代谢40%，乙醇产率只有0.36g/g，糖占理论产率的70.1%。
[0074]说明未经驯化的酵母菌对组分复杂的酶解糖液的耐受能力较差。以上数据证明，驯化后酵母菌种的酶解糖液耐受能力、五碳糖代谢能力和乙醇产率均有明显提高，驯化后可有效降低细胞质膜上ATP合成酶对H+膜两侧梯度变化的敏感性，这保证了酵母细胞内氧化磷酸化仍能正常使用，使得糖酵解过程顺利进行，提高了细胞的耐受能力。
[0075]以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0076]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1.一种酿酒酵母菌的驯化方法，包括以下步骤: (A)酿酒酵母菌活化； (B)将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(80?90): (10?20)； (C)将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为(60?70):(30?40);以后每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ； 所述酶解糖液的制备方法为: 将农作物秸杆进行汽爆预处理，然后添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液； 所述汽爆预处理的蒸汽压力为1.2?1.8MPa，汽爆预处理的时间为8?15分钟。
2.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌为安琪酿酒干酵母。
3.根据权利要求2所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(A)具体为: 将酿酒酵母菌液体培养基中进行活化，所述活化的温度为35?40°C，活化时间为0.5?1.5小时。
4.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述培养温度25?35。。。
5.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述培养时间为8?12小时。
6.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述培养的PH值为4.0 ?5.0。
7.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(C)中，所述玉米糖化醪的制备方法为: 将玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分钟；然后加入糖化酶，50?60°C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
8.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述混合物中还包括:0.075%的磷酸二铵，0.075%的尿素和0.05%的硫酸镁。
9.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(C)中，所述扩大培养为2?10代。
10.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述纤维素酶的添加量为预处理产物绝干质量的I?1.5%。
【文档编号】C12N1/18GK104450598SQ201410843473
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】生晓东, 刘玉金, 肖伟良, 李学业 申请人:松原光禾能源有限公司