一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产L-鸟氨酸的方法，属于 生物工程和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物 质。同时L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有 重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和 脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以 及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别 是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低 患者血氨浓度。鸟氨酸a-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改 善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和 饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。
[0003] 鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受 二分子NH4+和一分子C0 2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被 水解成鸟氨酸和尿素。
[0004] 工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法以及L-精氨酸水解法。微 生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以 较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世 纪五六十年代就开始鸟氨酸生产的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先 报道了利用谷氨酸棒状杆菌突变株发酵生产鸟氨酸。此后，OkumuraheShibuya等人在这 方面也做了大量的工作，将具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌，以 及具有精氨酸和鸟氨酸以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国 内陈宁、刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通 过硫酸二乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产 量达到9. 85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发 酵生产取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达 异源的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨 酸产量得到提高，最终到14. 8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟 氨酸的产量为24.lg/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等， 成本非常低廉，适合于工业的发展，但发酵周期一般都相对较长，而且发酵的产量较低对于 后期分离需要较高的技术需求。
[0005] L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸包括，碱水解法和酶水解法，特别是酶水解，由于 其反应效率高，产物转专一性高而受到越来越多的重视。近几年，国内有人开始尝试以精氨 酸为底物进行酶转化法生产L-鸟氨酸。北京化工大学徐焘，通过筛选得到一株精氨酸酶活 力较高的苏云金芽孢杆菌，以此细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行L-鸟氨酸生 产，并最终得到43. 57g/LL-鸟氨酸。而后张涛等人提取苏云金芽孢杆菌的精氨酸酶，以精 氨酸为底物，精氨酸酶纯酶作催化剂，并最终得到72.lg/L的鸟氨酸。宋伟等人构建表达外 源精氨酸酶的E.coliBL21，并以重组细胞为催化剂，L-精氨酸为底物，最终得到112. 3g/L 的L-鸟氨酸。然而，无论以产精氨酸酶的菌株作为催化剂，还是以纯化的精氨酸酶为催化 剂转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸，都还存在效率比较低，产量低的问题。特别是用纯化的精 氨酸酶进行转化生产L-鸟氨酸，需要消耗较大的成本在精氨酸酶的分离纯化上，不利于工 业化的应用。
[0006] 本发明通过表达载体pMA5,实现了将来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因 argl成功在安全性生产菌株B.subtilis168中高效表达。以此次获得的具有精氨酸活性 的重组菌全细胞为生物催化剂，以L-精氨酸为底物，进行转化法生产L-鸟氨酸。并通过 对L-精氨酸转化体系的建立和条件优化。最终确定了最佳的L-精氨酸转化条件，实现了 L-鸟氨酸的高效生产。
【发明内容】
[0007] 本发明首先提供了一株产精氨酸酶的重组枯草芽孢杆菌，是将精氨酸酶基因 argl，以pMA5为表达载体，以Bacillus subtilis 168为宿主，构建了基因工程菌株 B.subtilis 168/pMA5_argI〇
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸酶基因来源于Bacilluscereus，序列如 SEQIDNO. 1 所示。
[0009] 本发明还提供了应用所述重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA5_argI全细胞 转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸的方法，是以重组菌全细胞作为生物催化剂，构建了转化法生 产L-鸟氨酸的转化体系；所述转化体系采用pH为9. 0的0. 25-0. 3M碳酸盐缓冲液，含有 0-0. 5mM的Mn2+、100-200g/L的L-精氨酸，转化温度为35-40°C，并适时补加底物L-精氨 酸，使得底物浓度维持在120_200g/L之间。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，转化体系中，全细胞用量为3-5g/L。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述转化体系采用pH为9. 0的0. 25M碳酸盐缓冲 液，含有〇. 5mM的Mn2+、200g/L的L-精氨酸，转化温度为40°C，并适时补加底物L-精氨酸， 使得底物浓度维持在120_200g/L之间。
[0012] 本发明的优点和积极效果是：
[0013] (1)本发明首次在B.subtilis168中克隆表达了来源于Bacilluscereus的精氨 酸酶基因argl，相比出发菌株，精氨酸酶酶活提高了 26. 7倍。
[0014] (2)本发明通过穿梭载体pMA5,在Hpa II启动子控制下，精氨酸酶直接高效表达， 不需要通过IPTG等价格昂贵的诱导剂下进行诱导表达。
[0015] (3)本发明应用重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA5-argI全细胞转化L-精 氨酸生产L-鸟氨酸，在4h内获得了 148. 7g/L的L-鸟氨酸，精氨酸的摩尔转化率达到 100% ;通过补加底物L-精氨酸，在12h内L-鸟氨酸的产量高达378. 9g/L，底物摩尔转化 率达到99. 9%。
【具体实施方式】
[0016] 重组菌株酶活力测定
[0017] 酶活测定方法：配制0. 2M底物L-精氨酸（pH9. 0,0. 2M碳酸盐缓冲液），取0. 9ml 底物溶液，加入〇.lml酶液，40°C反应lOmin。将酶反应液稀释相应的倍数，取lml稀释后 的反应液，用Chinard比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为lmin催化 lumolL-精氨酸转化成L-鸟氨酸所需的酶量。
[0018] Chinard比色法：1ml标准液中依次加入lml的冰醋酸，lml混合酸（讳三酮溶液）， 于沸水浴中反应lh，测定515nm下的吸光度值。
[0019] 实施例1精氨酸酶引物设计
[0020] 根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中argl基因序列，设计精氨酸 酶基因的PCR引物P1和P2。
[0021] P1 :5, -ATCCATATGATGAAAAAAGAAATCTCAG-3'(NdeI)
[0022] P2 :5' -ACCGGGATCCTTATTTTAGT TTTTCACCG-3' （BamH I)
[0023] 实施例2精氨酸酶基因的克隆
[0024] 以Bacilluscereus总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件 为：94°(：预变性，51^11，一个循环；94°(：变性，1111111，56°(：退火，1111111，72°(：延伸，458,35个循 环；72°C终延伸lOmin。PCR扩增体系：模板lyL，上下游引物各0. 4yL，dNTPMix4yL， lOXExTaqBuffer5yL，灭菌的双蒸水37yL，ExTaqDNA聚合酶lyL。采用凝胶回收 试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1. 5mL的 离心管中，-20°C冰箱保存备用。回收产物与pMD18-TVector连接，连接产物转化E.coil