一种原代肝细胞体外复极性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肝脏组织工程学技术领域，尤其涉及一种原代肝细胞体外复极性的方 法。
【背景技术】
[0002] 肝组织工程学在药物筛选、体外支持治疗、以及肝组织生理与疾病模拟模型等领 域中具有重要的基础研究和临床应用价值。具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞是肝 组织工程的重要细胞成分。如何获得具有最近似体内功能的工程化肝组织是该领域研究的 核心目标和成功的关键技术之一。
[0003] 成熟肝细胞在功能和结构上具有与其他上皮细胞不同的复杂极性特征，该极性是 肝细胞发挥生理功能的基础。经酶解离开体内组织内环境后，成熟肝细胞失去极性，原有功 能表型发生迅速减退。在一定的体外条件下，肝细胞恢复并维持其极性，保持较高的功能水 平，并维持较长时间，此现象称为肝细胞复极性。肝细胞复极性包括以下特征：重新出现典 型肝细胞间极性超微结构和功能性胆小管排泌。一般认为，新分离的原代肝细胞只有恢复 细胞极性后方具备正常的细胞功能。因此，通过各种技术和方法处理以恢复细胞极性，是肝 脏组织工程学的重要观察指标和目标。
[0004] 二维和三维培养的原代成熟肝细胞，在适合的技术细节条件下，都有可能发生复 极性现象。由于更接近生理特征，促进三维肝细胞复极性是目前肝组织工程技术研究的着 力点。如肝细胞微球体，作为一种获得较多研究的三维肝组织体，其形成体现了典型的体外 肝细胞自组织过程：新鲜分离的原代肝细胞有自发聚集的趋势，它们会在聚集体的基础上， 逐渐紧凑并重新建立极性结构。目前大多研究通过优化培养基成分，提高氧气供应，改良培 养基质的化学或物理结构以及改进种植方式等手段，使体外肝细胞复极性。
[0005] Ryo Sudo等应用鼠尾胶原三明治构型培养大鼠原代肝细胞，细胞培养液由基本 培养基（DMEM)，20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，25mM碳酸氢钠，30mg/L L-脯氨酸，10 7M地塞 米松，10mM烟酰胺，ImM的抗坏血酸-2-磷酸，10ng/mL表皮细胞生长因子和青霉素链霉素 双抗组成，在肝细胞种植后第72h第一次检测到功能性胆小管对荧光素二乙酸（FDA)的 排泌功能（Sudo R.，Mitaka T.，Ikeda M.，and Tanishita K. (2005) Reconstruction of 3D stacked-up structures by rat small hepatocytes on microporous membranes. The FASEB Journal 19(12) : 1695-7.)。Mark A. Talamini 等用同法培养大鼠原代肝细 胞，在肝细胞种植后48h检测到膜抗原蛋白的非对称性极性分布（Talamini, M. A.，Kappus B. ,and Hubbard A. (1997)Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology 25(1) : 167-72.)这是已有研究报道中肝细胞（结构和功能学）复极性的形成出现最早的时 间（48h-72h)。
[0006] 上述现有技术存在以下主要缺点：
[0007] 1.虽然使原代肝细胞在体外条件下发生了复极性的行为，但不是生理性恢复。例 如，二维单层培养原代肝细胞基本没有形成肝板样结构，形成的囊泡样胆小管片段接种48h 后消失，肝细胞膜区域蛋白特异性分布在培养后1周后基本消失。
[0008] 2.三明治构型培养的原代肝细胞提高了生理性原代肝细胞复极性的能力，肝细 胞形成肝板样结构，伴胆小管网络形成，肝细胞膜区域蛋白呈特异性分布，但提高程度不显 著。例如，三明治培养原代肝细胞在72h时白蛋白合成量为30 y g/106细胞/天，尿素合成 量为120yg/106细胞/天。
[0009] 3.复极性出现的时间晚。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种原代肝细胞体外复极性的方法。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] -种原代肝细胞体外复极性的方法，包括以下步骤：将原代肝细胞悬液通过灌注 种植的方式种植于细胞培养池中，同时对原代肝细胞施加紧凑力，使单位体积细胞密度达 到90%以上，之后用肝细胞表型无血清培养液进行灌注培养。
[0013] 优选地，灌注种植的方法为原代肝细胞悬液流经并滞留于细胞培养池中。
[0014] 优选地，灌注种植时原代肝细胞悬液的流速为0. 02mL/h。
[0015] 优选地，灌注培养时肝细胞表型无血清培养液的流速为0. 02~0. 06mL/h。
[0016] 更优选地，肝细胞紧凑种植后，第lh内以0. 02mL/h的流速对肝细胞进行灌注培 养，第2至4h内以0. 02~0. 03mL/h的流速对肝细胞进行灌注培养，第4h后以0. 04~ 0. 06mL/h的流速对肝细胞进行灌注培养。
[0017] 优选地，所述灌注种植为循环灌注种植。所述循环灌注种植是采用一定量的原代 肝细胞悬液进行灌注种植，使自细胞培养池中流出的原代肝细胞悬液再流入细胞培养池进 行种植的方式。
[0018] 优选地，对原代肝细胞施加紧凑力的具体方法为：在普通倒置光学显微镜下通过 眼科镊蠕动对原代肝细胞施加紧凑力。
[0019] 优选地，肝细胞的培养时间为12h以上。
[0020] 更优选地，肝细胞的培养时间为12h至120h。
[0021] 更进一步优选地，肝细胞的培养时间为12h至48h。
[0022] 更进一步优选地，肝细胞的培养时间为12h至24h。
[0023] 优选地，原代肝细胞悬液的密度为4-6 X 106个/mL。
[0024] 优选地，肝细胞表型无血清培养液包含基础培养基IfepatoZYME SFM(Invitrogen， Life Technologies，USA)、2mM L_ 谷氛醜胺、60iiM HEPES(4_ 轻乙基哌嘆乙横酸）、50iiM 地塞米松和1X青霉素/链霉素双抗。
[0025] 发明人通过对现有技术的分析，认为现有技术之所以存在多种缺点的原因可能 有：肝细胞不能快速形成高密度培养；肝细胞间排列松散，没有形成紧密接触。因此，发明 人对此进行了改进，形成了本发明。本发明原代肝细胞体外复极性的培养方法利用力学紧 凑种植方式种植原代肝细胞后进行循环灌注培养。力学紧凑种植是指利用机械力种植细 胞，使细胞紧密排列，实现细胞的高密度种植的种植方式。所施加的机械力可以使细胞紧 凑，因此该机械力称为紧凑力。本发明采用循环灌注方式紧凑种植原代肝细胞，之后进行循 环灌注培养，称为微流控灌注培养法。
[0026] 与现有技术相比，本发明微流控灌注培养法具有如下有益效果：
[0027] (1)本发明中利用力学紧凑种植原代肝细胞，可以使肝细胞间排列紧凑，形成紧密 接触，肝细胞可以快速形成高密度培养。
[0028] (2)本发明中利用力学紧凑种植原代肝细胞，显著提高了肝细胞群的体外细 胞功能，原代肝细胞在培养72h，白蛋白合成量为150 y g/106细胞/天，尿素合成量为 750 y g/106细胞/天，远远高于现有技术培养原代肝细胞的合成水平。
[0029] (3)本发明对原代肝细胞进行模拟体内肝组织力学特点的力学紧凑方式进行种植 和三维培养，本发明中肝细胞在结构和功能学上的复极性均提前至种植后第12h形成。
【附图说明】
[0030] 图1为效果实施例1中普通显微镜观察图和激光共聚焦荧光显微图。图lA(i)和 图1B⑴分别为对照组和处理组的普通显微镜观察图，图lA(ii)和图lB(ii)分别为对照 组和紧凑力组的荧光标记后的激光共聚焦荧光显微图。肝细胞肝细胞图2为效果实施例1 中肝细胞种植密度柱状图。
[0031] 图3为效果实施例2中肝细胞形状图。图3A为对照组细胞形状图，图3B为处理 组细胞形状图，图3C为种植在具有典型肝细胞正弦曲线的肝细胞切片上的肝细胞形状图。
[0032] 图4为效果实施例2中肝细胞接触距离图。图4A为对照组接触距离图，图4B为 处理组接触距离图。
[0033] 图5为效果实施例2中肝细胞接触面积柱状图。
[0034] 图6为效果实施例3中胆小管排泌FDA情况图。
[0035] 图7为效果实施例4中肝细胞在扫描电镜下的超微结构图。
[0036] 图8为效果实施例5中白蛋白合成量柱状图。
[0037] 图9为效果实施例5中尿素合成量柱状图。
[0038] 图10为效果实施例6中肝细胞蛋白的极性排布图。
[0039] 图11为效果实施例6中肝细胞MRP2/F_actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面 积比。
【具体实施方式】
[0040] 为了更好的理解本发明，下面结合附图和【具体实施方式】作进一步说明。本发明中 所用试剂或仪器均可由市场