所示，紧凑力作用的处理组肝细胞在种植后12h就形成功能性胆小管，并 且伴随着微绒毛和紧密连接的形成，这种超微结构保持至48h以上，进一步确定了重建胆 小管（BC)的存在；相反地，种植后12h的对照组原代肝细胞中没有出现伴随着微绒毛（MV) 和紧密连接（TJ)形成的功能性胆小管结构，仅在种植后的48h出现了散在分布的小管状结 构。以上结果清楚地表明，微流控灌注培养法显著加速了肝细胞群的结构和功能学特征表 型形成。
[0065] 效果实施例5、白蛋白和尿素分泌实验
[0066] 利用5mL注射器收集按照实施例1中方法采用紧凑力处理培养24h、48h、72h、96h 和120h后的肝细胞群培养基，测定肝细胞群合成白蛋白和尿素的功能变化（处理组）。传 统的二维胶原蛋白培养肝细胞作为空白对照组。培养基中白蛋白的浓度使用大鼠白蛋白酶 联免疫吸附试验（ELISA)试剂盒（Bethyl Laboratories, USA)进行定量，尿素浓度则使用 尿素尿素氮试验（BUN)试剂盒（Stanbio Laboratory, USA)进行定量。利用多功能酶标仪 分别测定白蛋白样品在450nm波长，尿素样品在520nm波长的光强吸光值。
[0067] 根据文献报道，三明治法培养原代肝细胞在72h时白蛋白合成量为30yg/106细 胞/天，尿素合成量为120 y g/106细胞/天。本实施例的结果如表1和图8-9所示，处理组 原代肝细胞在培养72h时，白蛋白合成量为150yg/106细胞/天，尿素合成量为750yg/106 细胞/天，远远高于现有技术培养原代肝细胞的合成水平。在接种后培养的三天，紧凑力处 理组肝细胞群的白蛋白合成能力是对照组（二维单层培养）肝细胞的2-10倍，在三天后则 下降至单层培养肝细胞相当的水平。紧凑力处理肝细胞群尿素合成量在接种后培养的5天 中相对稳定（AN0VA，p = 0. 131)，比二维单层培养肝细胞高出近20倍。以上结果清楚表明， 微流控灌注培养法显著提高了肝细胞群的体外功能和活力。
[0068] 表1白蛋白和尿素合成量表
[0069]
[0070] 效果实施例6、肝细胞群极性蛋白的免疫荧光染色及肌动蛋白F-actin的特异性 染色
[0071] 使用实施例1所述方法培养12h、24h和48h的肝细胞群作为处理组，以对比实施 例1所述方法培养相应时间的肝细胞群为对照组，检测肝细胞群极性蛋白的免疫荧光染色 及肌动蛋白F-actin的特异性染色。
[0072] 样品处理方法为：肝细胞群PBS洗涤3次，每次5min后，用3. 7% (w/v)PFA室温 固定30min，PBS洗涤3次，每次洗涤5min ;0. 1 % Triton X-100的PBS室温静置通透肝细 胞30min ;PBS洗涤3次，每次洗涤5min。在显微镜观察下，利用微观钳把细胞团从微孔中 移出。使用2%牛血清白蛋白（BSA)和0. 1% Triton X-100的PBS 4°C封闭过夜，PBS洗涤 3次，每次洗涤5min。所有的一抗抗体覆盖标本表面，4°C孵育过夜或室温作用2h ;PBS洗 涤3次，每次洗涤5min ;所有的二抗抗体覆盖标本表面，37°C避光孵育60min ;PBS避光洗涤 3次，每次洗涤5min。多重耐药相关蛋白MRP2 -抗（M8316, Sigma, USA)的稀释度为1:80， 黏附连接蛋白 E-cadherin-抗（610182, BD Biosciences, USA)的稀释度为 1:100，总黏 附连接蛋白pan-cadherin-抗（C1821，Sigma，USA)的稀释度为1:500,罗丹明标记羊抗兔 二抗（Sigma, USA)的稀释度为 1:200。新鲜稀释 Hoechst33342(H3570，Invitrogen, Life Technologies, USA, lmg/mL)覆盖细胞表面，室温避光静置lOmin ;PBS避光振荡洗涤3次， 每次洗涤5min。激光共聚焦成像焚光显微镜（Zeiss LSM, Germany)进行观察和拍照。利用 ImageJ软件对荧光标记胆小管腔面积进行定量。
[0073] 肌动蛋白F-actin的特异性染色时细胞用前面描述的方法固定。在随机切除的微 通道或原位标记F-actin肌动蛋白。在随机切除的微通道上，100U/mL Alexa fluor 488 phalloidin在二抗孵育时加入，然后按照二抗孵育后的步骤进行操作。原位F-actin染色 以 100U/mL Alexa fluor 594 phalloidin 和 lug/mL 核染色剂 Hoechst 33342 灌注，流速 为0. 5mL/h，作用2h。PBS洗涤lh后，使用激光共聚焦荧光显微镜进行观察和拍照。
[0074] 由图10和图11可知，在相同培养条件下，对照组复极性出现时间为种植后第48h， 而处理组则显著加速至种植后第12h。这一时间较迄今已有文献报道的时间显著缩短。在 12h，我们发现处理组肌动蛋白F-actin提前加强分布于BC范围内并随时间的延长，加强分 布的范围扩大。由MRP2复染的分布特点可以判断，F-actin与BC形成、加速形成和成熟有 密不可分的关系。MRP2/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值，随着培养时 间递增而升高。在检测时间点12h，24h和48h，处理组的MRP2/F-actin荧光标记胆小管腔 面积与肝组织面积的比值分别为5. 0% ±0. 2%，12. 5% ±0. 3%，17. 5% ±0. 4%，对照组 的MRP2/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值分别为1. 5% ±0. 1%，4. 5% ±0. 6%，4. 5% ±0. 3%。处理组的MRP2/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的 比值均约为对照组的三倍。以上结果表明，微流控灌注培养法显著加快了体外肝细胞群在 三维环境下的复极性速度，之后肝细胞极性也得到充分维持。
[0075] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将原代肝细胞悬 液通过灌注种植的方式种植于细胞培养池中，同时对原代肝细胞施加紧凑力，使单位体积 细胞密度达到90%以上，之后用肝细胞表型无血清培养液进行灌注培养。2. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，灌注种植的方 法为原代肝细胞悬液流经并滞留于细胞培养池中。3. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，灌注种植时原 代肝细胞悬液的流速为〇. 〇2mL/h。4. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，灌注培养时肝 细胞表型无血清培养液的流速为〇. 02~0. 06mL/h。5. 根据权利要求4所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，肝细胞紧凑种 植后，第Ih内以0. 02mL/h的流速对肝细胞进行灌注培养，第2至4h内以0. 02~0. 03mL/ h的流速对肝细胞进行灌注培养，4h后以0. 04~0. 06mL/h的流速对肝细胞进行灌注培养。6. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，灌注种植为循 环灌注种植。7. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，对原代肝细胞 施加紧凑力的具体方法为：在普通倒置光学显微镜下通过眼科镊蠕动对原代肝细胞施加紧 凑力。8. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞的 培养时间为12h以上。9. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，原代肝细胞悬 液的密度为4-6 X IO6个/mL。10. 根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的方法，其特征在于，肝细胞表型无 血清培养液包含基础培养基H印atoZYME SFM、2mM L-谷氨酰胺、60yM HEPES、50yM地塞米 松和IX青霉素/链霉素双抗。
【专利摘要】本发明涉及一种原代肝细胞体外复极性的方法，将原代肝细胞悬液通过灌注种植的方式种植于细胞培养池中，同时对原代肝细胞施加紧凑力，使单位体积细胞密度达到90％以上，之后用肝细胞表型无血清培养液进行灌注培养。本发明以力学紧凑种植方式种植原代成熟肝细胞群，肝细胞在结构和功能学上的复极性均提前至种植后第12h形成，加快了体外肝细胞群在三维环境下的复极性速度，可为肝组织工程提供具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105132359
【申请号】CN201510579427
【发明人】汪艳, 杨金连
【申请人】南方医科大学南方医院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月11日