购得，使用的检测方法第都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
[0041] 实施例1、微流控灌注培养法
[0042] 本实施例提供一种原代肝细胞体外复极性的方法，包括以下步骤：将50 y L密度 为5X 106个/mL的原代肝细胞悬液通过循环灌注的方式以0. 02mL/h流速流经并自然滞留 于细胞培养池中。同时在普通倒置光学显微镜下通过眼科镊轻轻蠕动对原代肝细胞群施加 单纯紧凑力，使单位体积细胞密度达到超过90 %。细胞在种植后用肝细胞表型无血清培养 液在37°C、5% C02条件下进行灌注培养。第lh内用肝细胞表型无血清培养液以0. 02mL/ h流速灌注培养，第2至4h内用肝细胞表型无血清培养液以接近接种的低流速（0. 02~ 0. 03mL/h)对细胞进行灌注培养，第4h后，将灌注流速提高至0. 04~0. 06mL/h，为细胞生 长持续供应新鲜的培养液。在灌注培养时，开始使用低流速进行灌注培养，即可以保证细胞 对营养的需求，又便于肝细胞贴壁；在肝细胞贴壁后加大灌注流速，为细胞生长供应充足的 营养，便于细胞快速生长复极性。
[0043] 所述肝细胞表型无血清培养液包含基础培养基IfepatoZYME SFM(Invitrogen， Life Technologies，USA)、2mM L-谷氨酰胺，60 yM HEPES、50 yM地塞米松和IX青霉素 / 链霉素双抗（青霉素l〇〇U/mL，链霉素100 y g/mL)。L-谷氨酰胺为肝细胞培养提供能量，参 与肝细胞的蛋白和核酸合成。ffiPES是细胞培养用的缓冲液，调节细胞培养液的pH值在约 7. 4左右。地塞米松调节肝细胞的分泌功能等，双抗抑制细菌生长，避免细胞污染。
[0044] 本实施例中原代肝细胞的通过以下方式分离获得：参照Selgen两步灌流法，分离 Wistar大鼠原代成熟肝细胞。酶解细胞悬液经两次离心，每次50g离心10min，留取离心细 胞沉淀，用肝细胞表型无血清培养液制备成原代肝细胞悬液。细胞活力（台盼兰染色法） 在90%以上的分离样本可用于接种进行体外复极性实验。
[0045] 对比例1、不施加离心力作用的原代肝细胞体外复极性的方法
[0046] 本实施例提供一种原代肝细胞体外复极性的方法，不施加紧凑力，其他步骤和条 件与实施例1相同，具体包括以下步骤：
[0047] 将50 y L密度为5 X 106个/mL的原代肝细胞悬液通过循环灌注的方式以0. 02mL/h 流速流经并自然滞留于细胞培养池中。细胞在种植后用肝细胞表型无血清培养液在37°C、 5% C02条件下进行灌注培养。第lh内用肝细胞表型无血清培养液以0. 02mL/h流速灌注 培养，第2至4h内用肝细胞表型无血清培养液以接近接种的低流速（0. 02~0. 03mL/h)对 细胞进行灌注培养，第4h后，将灌注流速提高至0. 04~0. 06mL/h，为细胞生长持续供应新 鲜的培养液。
[0048] 效果实施例1、肝细胞种植密度
[0049] 检测实施例1中肝细胞的种植密度（处理组），以对比例1中肝细胞作为对照。具 体测定方法为：
[0050] 用磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤肝细胞3次，每次洗涤5min后，用3. 7% (w/v)多聚甲 醛（PFA)室温固定30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min ;250nmol/mL Sytox Green焚 光染料（Invitrogen, Life Technologies, USA)和 200 y g/mL RNAse (Sigma, USA)标记细胞 核，室温染色30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min。用普通显微镜和激光共聚焦荧光 显微镜观察并拍照得到三维图像。
[0051] 激光共聚焦图像中的细胞核使用Imaris software (version 7. 1.0, Bitplane, Switzerland)中的斑点检测模块鉴定。细胞总数为校正多核肝细胞后的 细胞核总数，如间隔少于20微米的多个细胞核视为一个细胞核。计算每一个共焦量中细胞 数目，获得单位体积内细胞数量，即细胞种植密度。通过检测肝细胞的平均直径，进一步估 计每个培养室中的细胞体积，获得单位空间肝细胞占用比例。结果如图1-2所示。
[0052] 由图1-2可知，在对照组中，细胞种植密度为7. 8X107±4. 5X106个/cm3,高于 常见的肝细胞种植密度IX 106个/cm3,单位空间里细胞占用比例为69. 9 % ±4%，略大于 理论计算单位空间里刚性球体占用比例为63. 4% ;而在紧凑力处理组里，细胞种植密度为 IX 10s±3. 9X106个/cm3,单位空间肝细胞占用比例为93. 1% ±3. 1%，远大于对照组和理 论最大刚性球承载比例。以上结果表明，对种植肝细胞群施加单纯力学紧凑力，实现了肝细 胞在体外的高密度培养。
[0053] 效果实施例2、肝细胞形状和接触面积
[0054]新鲜分离的原代肝细胞以5 y g/mL的Cell Mask Orange (Invitrogen, Life Technologies, USA)染色标记，室温作用15min后，培养基洗涤一次。按照实施例1所述的 方法复极性作为处理组，按照对比例1所述的方法复极性作为对照组。培养48h后观察和 测量获得的肝细胞群的形状和接触面积。
[0055] 样品处理方法如下：弃去细胞培养液，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min ;用3. 7 % (w/v) PFA室温固定30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min。激光共聚焦荧光显微镜观察 上述处理后的肝细胞并拍照得到三维图像。为了观察细胞与细胞之间的接触程度，三维共 聚焦图像利用ImageJ 1.43进行重建。通过测定每个培养室中20对接触细胞的距离，估计 细胞与细胞之间的接触表面积。接触细胞的距离（三维堆叠的高度）通过图像接触部分确 定。假设细胞等长压缩，细胞间的接触表面积以接触高度的平方值计算。结果如图3-5所 不。
[0056] 如图3-4所示，处理组中力学紧凑在肝细胞间传递，细胞个体受到来自周围细胞 的三维挤触，形状发生变化。虽然目前技术手段还不能直接测到细胞群内部紧凑力的准确 大小，但对荧光标记的细胞膜进行显微观察，与对照组相比，处理组多数细胞出现由球形向 方形的变化。体内肝细胞为多角形，相对于对照组的球形细胞，处理组的方形细胞较接近体 内肝细胞的形态。
[0057] 如图4-5所示，力学紧凑处理组细胞间距离是13. 9±0. 3 ym，对照组细胞间距离 是15. 0±0. 2 ym ;力学紧凑处理组细胞间接触面积是200±0. 6 ym2,对照组细胞间接触面 积是100±0. 5 ym2,力学紧凑处理组细胞间接触面积大约是对照组的两倍，差异具有统计 学意义（P < 0. 05)。因此，紧凑力使肝细胞群排列更紧凑，细胞间接触更直接紧密。
[0058] 效果实施例3、胆小管排泌FDA
[0059] 检测实施例1培养12h、24h和48h获得的肝细胞群胆小管排泌FDA的情况（处理 组）。以对比例1为对照组，检测对比例1培养12h、24h和48h获得的肝细胞群的胆小管排 泌FDA的情况。
[0060] 处理组和对照组肝细胞群各样品处理如下：分别分为两份，一份肝细胞群PBS洗 涤3次，每次5min，后用含20 y g/mL FDA的培养基37°C培养细胞40min，用PBS振荡洗涤细 胞3次，每次5min。另一份肝细胞群不染色进行激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照，排除肝 细胞自发荧光的影响。用激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照。FDA定位得到的胆小管腔大 小使用ImageJ软件的阈值和魔法棒功能进行识别和定量。测定各个条件5个以上随机视 野的胆小管大小。
[0061] 本实施例经过5次以上重复实验确认，结果如图6所示，处理组肝细胞群接种后不 超过12h就普遍出现二乙酸荧光素（FDA)排泌现象，而对照组肝细胞群需要48h才出现FDA 排泌现象，与以往报道的三明治三维培养模型中72h才出现FDA排泌现象相比，均有大幅提 前。这可能是因为本实施例中采用微流控灌注培养法培养肝细胞，细胞种植密度比常用的 三明治培养高。
[0062] 效果实施例4、肝细胞群超微结构的观察
[0063] 本实施例进一步对种植后12h和48h的肝细胞群进行了超微结构观察。肝细胞群 用2.5% (w/v)戊二醛固定30min，在显微镜观察下，利用微观钳把细胞团从微孔中移出。 细胞团用1% (W/V)四氧化锇固定，使用浓度梯度（25%，50%，75%，95%，100% )乙醇 脱水，每个浓度作用15min，随后用100%丙酮脱水两次，每次15min。样品用体积比1:1的 丙酮和环氧树脂混合液室温孵育4h，再用体积比1:6的丙酮和环氧树脂孵育过夜。样品包 埋在100%环氧树脂，60°C烘箱内固化24h。利用莱卡EM UC6超薄切片机切片，样品收集在 200目网眼的铜筛中。样品使用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，利用透射电子显微镜观察 并拍照。
[0064] 如图7