混合后匀速滴入金属离子盐溶液 中，以此形成的凝胶球大小较均匀，也不会影响间充质干细胞在凝胶球内的均匀分布。
[0033] 在本发明中，先将磁性氧化物与海藻酸盐A混合均匀，再加入间充质干细胞，当加 入二价金属离子盐溶液之后，可将磁性氧化物和间充质干细胞均匀包裹在海藻酸凝胶球A 内磁性氧化物。优选地，磁性氧化物的颗粒直径为l-l〇〇nm纳米级，直径过大会影响海藻酸 凝胶球的包覆，直径太小也会影响磁运动强度；磁性氧化物可以是Fe 304或Co 304。由于Fe304 来源较广泛，成本低，因此优选选用Fe304，且Fe304的浓度为2-10mg/ml。
[0034] 步骤三中，海藻酸盐B可与海藻酸盐A保持一致，优选为海藻酸钠，且海藻酸钠的 浓度为2 % -10 % W/V ;二价金属离子盐溶液B也可与二价金属离子盐溶液A保持一致，优 选为CaCU容液，且CaCl 2的浓度为1 % -5 % W/V。
[0035] 步骤四中，待凝胶球A和凝胶球B形成之后，分别去除多余的二价金属离子盐溶液 A和B，并用NaCl溶液反复清洗凝胶球A和凝胶球B，再分别用基础培养基清洗，避免二价金 属离子在细胞培养过程中产生毒性作用。
[0036] 然后，再将含有间充质干细胞和磁性氧化物的凝胶球A和含有软骨细胞的凝胶球 B置于细胞培养容器中混合均匀进行共培养，待间充质干细胞转化为软骨细胞后，将凝胶球 A和凝胶球B置于外加磁场中，含有磁性氧化物的凝胶球A在磁场的作用下聚集，并与凝胶 球B分离，从而实现了分离两种共培养细胞的目的。优选地，外加磁场由强力磁铁提供，且 强力磁铁的最大磁能积为35MG0e，当然磁场的实现方式也并不局限于此。
[0037] 进一步地，细胞培养容器可以是静态的细胞培养板，也可以是生物反应器，既能实 现动态培养，也可在不通电的情况下进行静态培养，生物反应器可以是转瓶系统，包括用于 容纳两种共培养细胞悬液的转瓶和用于混合两种细胞悬液的转瓶机；也可以是摇瓶、灌注 系统等。动态培养不仅可以实现大规模地培养细胞，获得足够量的细胞数量，而且还可以更 加精确地控制反应条件，便于未来规模化生产，其次，动态培养可以提高培养过程中传质和 传氧的效率，可以有效克服静态培养的传质极限，通过生物反应器结合三维培养系统，可以 有效地提高间充质干细胞的增殖分化，并提高细胞的活性，生物反应器中动态培养条件剪 切应力在某种程度上能够促进间充质干细胞形成软骨细胞，提高诱导转化率。
[0038] 当然可以理解的是，也可在间充质干细胞与软骨细胞共培养的过程中，将细胞培 养容器置于外加磁场中，使得含有磁性氧化物的凝胶球A能够在磁场中运动，从而形成了 动态培养环境，使得间充质干细胞充分接触凝胶球B中软骨细胞的旁分泌，包括TOGF(血小 板源性生长因子）、BMP (骨形态发生蛋白）、FGF (成纤维细胞生长因子）、TGF- 0 (转化生长 因子-0 )、IGF (胰岛素样生长因子）、CDMP (软骨源性形态发生蛋白）等，不仅可以调节软 骨细胞自身的生长分化，而且可以调控影响间充质干细胞的分化；同时，磁场作用也能够促 进间充质干细胞转化成软骨细胞。由于含有磁性氧化物的凝胶球A在磁场的作用下会聚集 在一起，因此，优选地，磁场可间断外加于细胞培养容器，以避免连续外加磁场，凝胶球A聚 集在一起，影响间充质干细胞分化过程中的呼吸作用，以及对培养基及诱导剂的吸收。
[0039] 进一步地，共培养诱导过程中，本发明所采用的诱导剂中包括TGF-P、地塞米松、 抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。
[0040] 其中，TGF-0 (transforming growth factor-0，TGF-0 转化生长因子)是 一族广泛存在、结构相关、功能相似的多功能活性肽，具有多种功能的多肽生长因子，可以 促进间充质干细胞的增殖与分化，促进细胞外基质的合成，促进胶原产生，刺激软骨细胞的 合成与分泌细胞外基质蛋白，促进骨细胞的增殖。TGF-P有三种异构体，分别为TGF-P1、 0 2和0 3, TGF-P 2、0 3较0 1可更快速有效地促进间充质干细胞向软骨细胞分化，但 TGF-P 2、0 3之间诱导干细胞的水平基本相同。由于TGF-P在骨生长中的生物学功能呈双 向调节作用，既能刺激细胞的增殖分化作用，也能进行抑制作用，一般来说，低浓度TGF-0 起刺激作用，促进细胞的增殖分化；高浓度起抑制作用，因此，优选地，TGF-P的浓度为 5-15ng/ml〇
[0041] 地塞米松，购于Sigma公司，能够刺激碱性磷酸酶、骨钙素和I型胶原等的表达， 显著地增加碱性磷酸酶的活性，碱性磷酸酶是骨形成过程中必须的酶，碱性磷酸酶的表达 情况代表着骨形成的状况，可以激活位于间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，促进间充 质干细胞向软骨细胞分化，同时，提高间充质干细胞向软骨细胞的分化率；优选地，地塞米 松的浓度为7-10mmol/ml。
[0042] 抗坏血酸又称维生素C，是水溶性维生素的一种，参与氧化还原过程，在生物的氧 化和还原过程以及细胞呼吸作用中扮演重要角色，同时，抗坏血酸是胶原合成所必需的，还 可调节ATP酶与ALP活性及非胶原基质蛋白质的合成；抗坏血酸对软骨细胞分化的促进 作用，主要是通过增加胶原的累积，然后增加碱性磷酸酶在软骨细胞中的表达；此外，作为 一种抗氧化剂还可抑制或减少诱导过程中细胞凋亡的产生。优选地，抗坏血酸的浓度为 50-100ug/ml〇
[0043] 甘油磷酸钠可以为软骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙 化，是骨髓基质间充质干细胞产生矿化结节的必要条件；优选地，甘油磷酸钠的浓度为 5-15mmol/ml〇
[0044] ITS+Premix作为一种生长因子加进基础培养基，购于BD公司；其成份包含有牛血 清白蛋白和亚油酸等，能够促进细胞的增殖生长；优选地，ITS+Premix的浓度为50-150ng/ ml 〇
[0045] 进一步地，本发明提供的诱导液还包括胰岛素和转铁蛋白；胰岛素可降低蛋白质 降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，为细胞生长和分化提供能量，促使间充质干细胞处于 低糖环境，保持细胞活性，有利于间充质干细胞向软骨细胞的分化，优选地，胰岛素的浓度 范围为5-10mg/ml ;而转铁蛋白能够干预软骨细胞内离子代谢，促进软骨细胞的生成，优选 地，转铁蛋白的浓度范围为5-10mg/ml。
[0046] 更进一步地，本发明提供的诱导液还包括谷氨酰胺，谷氨酰胺参与蛋白质的合成 和核酸代谢，可作为诱导液中的能量来源，另外，谷氨酰胺通过细胞增容作用，也可促进细 胞的生长和分化；优选地，谷氨酰胺的浓度范围为1-10_〇1/1。
[0047] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0048] 实施例1
[0049] 本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：
[0050] 1、间充质干细胞和软骨细胞源的分离；
[0051] 将空气注入新西兰大白兔耳缘静脉，使其死亡。用75%的酒精涂抹大白兔的四肢， 消毒并减少兔毛的污染。
[0052] 1)间充质干细胞的分离；
[0053] 无菌条件下，剪下兔四肢的股骨和腔骨，除去皮肤组织保留关节处的肌肉结缔组 织，其余部位的肌肉组织剪去。将处理过的组织浸泡在75%的酒精，30min之后取出，用无 菌PBS清洗，放置在超净台中。用无菌手术刀切掉关节处的肌肉，使关节暴露。用骨剪剪 开关节，使骨腔暴露。使用一次性注射器吸取无菌PBS，反复冲洗骨腔，使骨腔内的骨髓都 冲洗到一次性平皿中。将液体转移至无菌的200目的筛网上，过滤除去大组织，获得悬浮 液。将悬浮液缓慢加入到事先装有15ml的Ficoll淋巴分离液的50ml离心管，2790rpm离 心30min。离心结束后，用尖吸管吸取液体中间白色雾状层细胞，将细胞转移至T150大方瓶 后，加入50ml间充质干细胞生长培养基，3天后换液。待细胞融合度达到90%后传代，胰酶 消化3-5min，吸取悬浮液转移至新的方瓶中培养，此细胞记为P2细胞，部分冷冻保存，其余 部分继续传代。
[0054] 2)软骨细胞源的分离；
[0055] 切取兔双侧膝关节软骨，放入培养皿，浸入灭菌1 XPBS中漂洗3次，去除关节软骨 周围的软组织及骨组织，1XPBS再次漂洗。剪碎软骨组织，大小约1~2_3,肉眼可见成乳 糜状，移入l〇ml刻度离心管，lml 0. 25%胰蛋白酶震荡消化3min后，静置2min，吸去上层悬 浊液，1 X PBS漂洗，500转/分离心2分钟，弃上清，加入0. 1 % II型胶原酶lml消化，消化过 程中不断用吸管轻轻吹打，每30分钟取上层悬浊液，转移入另外的离心管中，加入含血清 的培养基终止其消化。原离心管中加入〇. 1% II型胶原酶lml继续消化，最后把收集到的上 层悬浊液集中入一个离心管中lOOOrpm，离心8min，弃上清液，即获得软骨细胞。
[0056] 2、间充质干细胞的传代培养，获取P3代间充质干细胞；
[0057] 当步骤1)中的间充质干细胞融合度达到90%左右时即可消化传代。吸出培养基， 用无菌PBS清洗细胞表面，洗去残留的培养基。加入5ml胰酶，静置5