l洗涤。预先配制工作染液：将2 y L的lmg/ml PI和lmg/ml CAM荧光染料加入 到lml 0. 9% NaCl中混匀。每管加入150-200 yL工作液，轻轻吹打，使凝胶球悬浮于染液 中。将EP管置于37°C，5% 0)2动物细胞培养箱，避光孵育30min。取出EP管，吸出染液， 0. 9% NaCl洗涤凝胶球两次。将凝胶球置于载玻片上，荧光显微镜观察。死细胞在绿色荧 光照射下激发呈红色，活细胞在蓝色荧光照射下激发呈绿色，观察拍照。
[0098] 结果：包裹过程中，CaCl2等化学物质会导致部分细胞死亡。在35天时，荧光显 微镜下均可观察到明亮的绿色，而无红色，由此说明该方法的凝胶球内很少有死亡细胞。
[0099] 检测实验二、MTT (噻唑蓝）检测
[0100] 检测对象：
[0101] 检测组一本发明实施例1-5获得的软骨细胞；
[0102] 对照组一现有技术中，静态二维诱导共培养间充质干细胞获得的软骨细胞。
[0103] 活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为不溶于水，却溶 于DMS0(二甲基亚砜）的甲簪，死细胞则不能。分别对实验组和对照组执行以下操作：取 0、7、14、21、28及35天的3个凝胶球，分别分装在3个EP管中（n = 3)，加入40yL 5mg/ ml的MTT和200 y L新鲜的培养基，并轻轻吹打，使凝胶球悬浮于染液中。避光于37°C，5% 〇)2动物细胞培养箱中孵育4h反应结束后，去上清，将凝胶球砸碎，加入300 y L的DMS0,振 荡，lOOOOrpm高速离心5min。吸取200 y L上清，转移至96孔板，使用酶标仪在490nm处测 吸光值（0D值）。
[0104]表1:
[0105]
[0106] 检测结果：0D值越大，代表溶液中甲簪的含量越高，同时也说明，促使MTT酶解为 甲簪的琥珀酸脱氢酶越多，分泌琥珀酸脱氢酶活细胞的数量较多。由表1中数据可知，本发 明实施例1-5中，0D值均大于对照组，由此说明，本发明提供的干细胞的三维培养方法所获 得细胞活性较强，数量较多。
[0107] 检测实验三、GAG(葡萄糖胺聚糖）含量测定
[0108] 检测对象：
[0109] 实验组一实施例1-5获得的软骨细胞；
[0110] 对照组一现有技术中，静态二维共培养诱导间充质干细胞所获得的软骨细胞。
[0111] 分别对实验组和对照组中的软骨细胞执行以下操作：
[0112] 1)、样品处理：取0、7、14、21、28及35天的凝胶球各9个，平均分成3组置于￡卩 管内（n = 3)。加入300 yL木瓜蛋白酶，60°C水浴过夜，-20°C冷冻保存。使用时，取出样 品，室温融化，振荡，4000rpm离心5min，取上清转移至新EP管。
[0113] 2)、取Chs (硫酸软骨素，共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广 泛存在于动物软骨组织中）标准样品工作液制作标准曲线。
[0114] 制作方法：
[0115] 精密称量硫酸软骨素标准品适量，制成〇.5mg/ml水溶液，取六只比色管一次编 号，0号为空白，加0. 5ml蒸馏水，1-5号管分别吸取上液0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 50ml置 于50ml比色管中，用蒸馏水补至0. 5ml，分别加入硫酸：水（2 :1)的硫酸液各6ml，边加边 摇动，然后置于95°C水中加热60min，取出冷至室温后，测量0D值，如下表2所示和图1所 示，图1中，纵坐标为0D值，横坐标为硫酸软骨素标准品浓度。
[0116]表2 :
[0117]
[0118] 3)、取50yL样品加入到2ml的DMMB(1，9-二甲基甲叉基蓝）溶液，混勾，防止产生 气泡。使用紫外分光光度计在525nm处测0D值，代入标准曲线方程y = 0. 9930X+0. 0041， 标准偏差R > 2 = 0? 9991，算出GAG含量（y g/珠）。
[0119]表3:
[0120]
[0121]-由表3可知，本发明提供的实施例1-5中的0D值均笑于对照组:由此说明，本备明 中软骨细胞中所含有的GAG较多，软骨细胞数量较多，活性较强。
[0122] 综上所述，本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，通过利用海藻酸 凝胶球A包裹磁性氧化物和间充质干细胞，并用海藻酸凝胶球B包裹软骨细胞，同时对凝胶 球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培养，并诱导培养结束后，将培养体 系置于磁场中，还有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下聚集，并与凝胶球B分离， 从而简化了分离两种共培养细胞的过程；同时，凝胶球为间充质干细胞和软骨细胞提供一 个三维动态生长空间，以模拟细胞在体内的生长微环境，扩大了间充质干细胞的生长空间， 以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强 细胞活性；另外，也能够缩短间充质干细胞的诱导培养时间，所获得软骨细胞活性较强，数 量较多。
[0123] 以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体 实施方式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员 在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多 形式，这些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，包括以下步骤： 分别获取间充质干细胞和目的细胞源； 将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，再与除镁离子 以外的二价金属离子盐溶液A混合，至形成凝胶球A ; 将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶 液B混合，至形成凝胶球B ; 用诱导剂对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至 间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离； 其中，磁性氧化物颗粒的直径为l-l〇〇nm。2. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述凝 胶球A的形成过程为：将所述间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A 混合后，匀速加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液中。3. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述凝 胶球A内的间充质干细胞与凝胶球B中的目的细胞源进行共培养之前，还包括采用培养液 清洗凝胶球A和凝胶球B的步骤。4. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述磁 场的最大磁能积为35MG0e。5. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述磁 性氧化物颗粒为Fe3O 4或Co 304颗粒；且所述海藻酸盐A中，磁性氧化物的浓度为2-10mg/ml。6. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述海 藻酸盐A和海藻酸盐B均为海藻酸钠或海藻酸钙；与间充质干细胞混合后，海藻酸盐A的浓 度为2% -10% W/V ;与目的细胞源混合后，海藻酸盐B的浓度为2% -10% W/V。7. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述 二价金属离子盐溶液A和二价金属离子盐溶液B均为氯化钙溶液，且氯化钙的浓度均为 1% -5% ff/V〇8. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述目 的细胞源为软骨细胞源；且对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源 进行共培养的步骤中，所述间充质干细胞与所述软骨细胞源的浓度比为1:1-3:1。9. 根据权利要求7所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述诱 导剂包括 5_15ng/ml 的 TGF-0、7-1 Ommol /1 地塞米松、50-100ug/ml 抗坏血酸、5_15mmol/l 甘油磷酸钠和 50_150ng/ml 的 ITS+Premix。10. 根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，对所述 凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源共培养的过程是在生物反应器中进 行的。
【专利摘要】本发明涉及一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：分别获取间充质干细胞和目的细胞源；将间充质干细胞与含有磁性氧化物包裹于凝胶球A中；将目的细胞源包裹于凝胶球B中；用诱导剂对凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；其中，磁性氧化物颗粒的直径为1-100nm。本发明不仅能够达到简化分离共培养细胞的目的，而且利用海藻酸胶体的三维空间结构，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性。
【IPC分类】C12N5/0775, C12N5/077
【公开号】CN105132367
【申请号】CN201510504338
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳华毓造血干细胞研究有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月17日