内皮祖细胞的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种内皮祖细胞的培养方法，采用人外周血单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，在培养瓶内加入DMEM培养基并置于37℃,5%CO2,95%湿度的培养箱中培养；EPC的消化传代；然后进行EPC的细胞流式分析检测；EPC的免疫荧光检测；细胞增殖实验；单细胞成克隆实验；FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测；体外成管实验。本发明提供的EPC培养方法，简便可行，且可大大降低成本；本发明制备了高纯度的I型鼠尾胶原蛋白，将其包被细胞培养瓶用于EPC的培养，并采用了价格低廉的培养基，成功地从人外周血中培养出EPC，并通过鉴定证实其具有常规方法所培养出的EPC的表型特征和功能。
【专利说明】内皮祖细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物的细胞培养领域，特别涉及一种内皮祖细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPC)是内皮细胞的一种前体细胞，具有增殖、迁移和分化为成熟内皮细胞的潜能，它在体内新生血管形成过程中发挥了重要的作用。Asahara等于1997年首次从成人外周血中分离培养出了 EPC,可在体外分化为内皮细胞，参与缺血组织的新生血管形成。之后的研究进一步证实，这类细胞是起源于骨髓的一种特殊细胞亚型。然而，在健康正常成人中，骨髓或外周血中EPC的含量较少，这使得EPC的分离培养较困难。通常对于EPC的分离培养，主要是将采集的骨髓或外周血通过密度梯度离心法获取单个核细胞，然后接种于特殊物质包被的培养瓶中进行体外诱导培养。目前，用于包被的特殊物质包括纤维连接蛋白、明胶、多聚赖氨酸等，它们能够与细胞表面某些整连蛋白识别与结合，介导细胞的粘附，促进细胞的迁徙、分化及骨架形成，有利于EPC在培养瓶中贴壁和生长。然而，这些用于包被的物质大多价格昂贵，且EPC培养过程中需要大量的生长因子诱导和特殊的内皮细胞培养基，从而大大地增加了 EPC的培养成本，限制其在临床和科研工作中的广泛应用(Asahara等，Science.1997; 275(5302): 964-7.Fadini等，CircRes.2012; 110 (4): 624-37.)。McCloskey等报道，采用鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶培养胚胎干细胞(ESC)，可以将胚胎干细胞诱导分化为高纯度的EPC，它具有内皮细胞的功能，具有成血管特性(McCloskey 等，Tissue Eng.2005; 11 (3-4):497-505)。国内也有研究者将鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶用于EPC的培养。王征宇等将小鼠ESC培养于鼠尾I型胶原蛋白包被的培养瓶中，可以迅速地形成内皮网络，表达内皮细胞的特征(王征宇等，中国医学科学院学报.2005; 27(1):62-6)。王红祥等将自制的鼠尾I型胶原蛋白包被法用于人外周血EPC的培养，并证实其是一种比常用的纤维连接蛋白更节省的培养方法(王红祥等，临床血液学杂志.2008; 21(3): 147-50)。由于自制鼠尾I型胶原蛋白操作简便，价格低廉，是一种较为理想的细胞培养瓶的包被物质。然而，对于自制的鼠尾I型胶原蛋白的纯度尚不清楚。同时，对于采用鼠尾I型胶原蛋白包被法所培养的EPC与常规培养法所培养EPC的功能有无差异尚未可知，鼠尾I型胶原蛋白包被法的有效性有待进一步证实。
[0003]因此，急需一种简便有效地培养内皮祖细胞的方法来克服上述的缺陷。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种内皮祖细胞的培养方法，以解决现有技术中EPC的分离培养较困难和EPC的培养成本高昂的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤:
步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存； 步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶；
步骤c.人外周血单个核细胞的分离；
步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37°C，5%C02,95%湿度的培养箱中培养；
步骤e.EPC的消化传代；
步骤f.EPC的细胞流式分析检测；
步骤g.EPC的免疫荧光检测；
步骤h.细胞增殖实验,观察EPC的增殖能力；
步骤1.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力；
步骤j.FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测EPC摄取FITC-UEA-UDil-acLDL 的能力；
步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶原蛋白、纤维连接蛋白包被和未包被的方法培养的EPC的成管能力。
[0006]进一步的，所述步骤d中阴性对照组采用未包被的培养瓶，阳性对照组中采用纤维连接蛋白包被培养瓶。
[0007]进一步的，所述步骤d 中的 DMEM培养基含 10% FBSjVEGF 10ng/mL,bFGF 5ng/mL,TGF-β I 5ng/mL。
[0008]进一步的，所述步骤f中检测的抗体包括CD34-FITC、KDR-PE, CD133-FITC、CD31-PE、vffF-FITC, CD14-PE、CD45-FITC，统计分析三组中EPC表达特异性标记物的情况。
[0009]进一步的，所述步骤g中检测抗体:⑶34、1?1?、^133、^31、￥1?、^14、^45，在荧光显微镜下观察分析。
[0010]本发明的有益效果是:本发明提供的内皮祖细胞的培养方法，简便可行，且大大降低了 EPC的培养成本；本发明制备了高纯度的I型鼠尾胶原蛋白，将其包被细胞培养瓶用于EPC的培养，并采用了价格低廉的培养基，成功地从人外周血中培养出EPC，并通过鉴定证实其具有常规方法所培养出的EPC的表型特征和功能；实验结果表明，采用本发明提供的培养方法可以成功地培养出EPC，未包被的培养瓶中EPC贴壁困难，生长缓慢，且成簇状生长，而包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶中EPC贴壁容易，生长速度较快，且成片状生长；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC可表达⑶34、KDR、⑶133XD31、vWF，但不表达⑶14和⑶45，经统计分析，⑶34、KDR、⑶133的表达率显著高于阴性对照组(p〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(P>0.05);采用本发明提供的培养方法所培养的EPC的增殖潜能明显高于阴性对照组(P〈0.05)，与阳性对照组的增殖潜能无明显差异(p>0.05);采用本发明提供的培养方法所培养的EPC，在培养一周后，可由单个细胞增殖为一个超过14个细胞以上的克隆体；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC，摄取FITC-UEA-1、Dil-acLDL的能力与阳性对照组相同；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC的体外成管能力明显高于阴性对照组(P〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(p>0.05)。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:未用以及应用鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶7d时细胞贴壁情况。其中，A是未包被的培养瓶培养EPC的细胞贴壁情况图(X 100)；B是包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶培养EPC的细胞贴壁情况图(X 100);
图2 =EPC的流式分析统计结果；
图3:三种培养方法培养EPC增殖曲线；
图4:采用包被I型鼠尾胶原蛋白法所培养EPC的单细胞成克隆分析图；
图5 =FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验鉴定EPC图(X200)，其中，A是FITC-UEA-1胞外吸附图，B是Dil-acLDL内吞图；
图6 =EPC在Matrigel上的体外成管实验图。其中，A是阴性对照组未包被培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X200)，B是包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X 200)，C是包被纤维连接蛋白的培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X 200) ;D是三种方法培养的EPC成管统计分析图。
【具体实施方式】
[0012]为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。
[0013]一种内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤:
步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存；
步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶；
步骤c.人外周血单个核细胞的分离；
步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37°C，5%C02,95%湿度的培养箱中培养；
步骤e.EPC的消化传代；
步骤f.EPC的细胞流式分析检测；
步骤g.EPC的免疫荧光检测；
步骤h.细胞增殖实验,观察EPC的增殖能力；
步骤1.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力；
步骤j.FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测EPC摄取FITC-UEA-UDil-acLDL 的能力；
步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶原蛋白、纤维连接蛋白包被和未包被的方法培养的EPC的成管能力。
[0014]所述步骤d中阴性对照组采用未包被的培养瓶，阳性对照组中采用纤维连接蛋白包被培养瓶。
[0015]所述步骤d 中的 DMEM 培养基含 10% FBS, VEGF 10ng/mL, bFGF 5ng/mL, TGF-β I5ng/mL0
[0016]所述步骤f 中检测的抗体包括 CD34-FITC、KDR-PE, CD133-FITC、CD31-PE、vffF-FITC, CD14-PE、CD45-FITC，统计分析三组中EPC表达特异性标记物的情况。
[0017]所述步骤g中检测抗体:⑶34、KDR、⑶133、⑶31、vWF、⑶14、⑶45，在荧光显微镜下观察分析。
[0018]
实施例
[0019]I型鼠尾胶原蛋白的制备、提纯、检测并包被细胞培养瓶，步骤如下:
a)取大鼠尾洗净，75%酒精浸泡15min，将鼠尾剪开、去掉皮毛并剪成小段，抽出银色的尾腱，将尾腱剪断置于生理盐水中浸泡后，按每克尾腱50ml的比例将尾腱加入到0.1%的醋酸中，摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4°C放置72小时；
b)将上述充分溶解的液体移入无菌离心管中，进行离心，离心条件:4°C，4000rpm，1min ；
C)取上述上清液，分装后储存于4°C保存备用；
d)采用凯氏定氮法检测上述上清液中的胶原蛋白的含量；
e)采用制备的I型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶，包被浓度为6-lOug/cm2。将鼠尾胶原蛋白溶液加到相应的培养器皿中，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面；在室温或37°C结合I?2小时，2-8°C开盖过夜晾干，或者在室温放置I小时后，用PBS漂洗3?4次后直接使用；
f)以上I型鼠尾胶原蛋白的制备、提纯并包被细胞培养瓶的步骤均在无菌操作下完成；包被好的器皿在4-25°C可以保存三个月以上的时间，接种细胞前用无菌的PBS漂洗包被好的培养瓶3-4次。
[0020]采用上述培养方法，我们成功地制备了 I型鼠尾胶原蛋白，通过凯氏定氮法检测其浓度为1.6±0.3mg/ml，证实我们所制备的为高纯度的I型鼠尾胶原蛋白。
[0021]人外周血EPC的培养步骤如下:
a)招募10名健康志愿者，抽取外周血20ml，将外周血与PBS按照1:2稀释，得到稀释后的外周血60ml ；
b)在50ml离心管中加入人淋巴细胞分离液(Ficoll)15ml，取上述稀释后的血液20ml缓缓加入到离心管中，进行密度梯度离心，离心条件:18°C,400g,30min, without brake ；
c)离心后管中液体分为四层:血清层、单个核细胞层、Ficoll层和红细胞层，缓缓吸取单个核细胞层；接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中(阴性对照组采用未包被的培养瓶，阳性对照组中采用纤维连接蛋白包被培养瓶)，培养瓶内加入DMEM培养基(含10% FBS, 10ng/mL VEGF, 5ng/mL bFGF, 5ng/mL TGF-β I)在 37°C，5%C02, 95% 湿度的培养箱中培养；
d)每24h更换培养基，连续一周，于倒置显微镜下观察细胞生长情况；
e)7?10天后，可见EPC克隆出现，待细胞数目长至500以上后，采用胰酶消化传代继续培养扩增。
[0022]如图1所示，采用上述培养方法，我们成功地培养出了 EPC，未包被的培养瓶中EPC贴壁困难，生长缓慢，且成簇状生长，而包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶中EPC贴壁容易，生长速度较快，且成片状生长。
[0023]人外周血EPC的鉴定，步骤如下:
a)细胞流式分析检测:收集第I?2代EPC，将细胞浓度调整至I X 106/ml，用4%多聚甲醒重悬固定40min, 2ml含0.5%BSA的PBS重悬洗漆细胞，1500rpm离心5min,弃上清,力口Λ Iml含人IgG (I μ g/105个细胞)的PBS重悬细胞,冰上放置1min, 1500rpm离心5min,将沉淀细胞用含0.5% BSA的PBS重悬后分装于流式管内，对照管中加入PBS，其余各管分别加入荧光标记的单克隆抗体 CD34-FITC、KDR-PE、CD133-FITC、CD31-PE、vWF-FITC、CD14-PE、⑶45-FITC，冰上放置40min，洗涤细胞两次，各管分别加入400 μ I PBS重悬细胞，进行流式细胞仪检测，统计分析三组中EPC表达特异性标记物的情况；
如图2所示，本实验结果表明，采用上述三种培养方法所培养的EPC可表达CD34、KDR、⑶133、⑶31、vWF,但不表达⑶14和⑶45。经统计分析，⑶34、KDR、⑶133的表达率显著高于阴性对照组(P〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(p>0.05)；
b)免疫荧光检测:取第I?2代EPC进行细胞爬片培养，将每组细胞种植于6孔板盖玻片上，待细胞长至50?60 %融合后，去除培养基，将贴壁细胞用PBS冲洗2遍，采用4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗3遍，10% SDS抗原修复lOmin，再次用PBS冲洗3遍，然后每组细胞分别加入一抗:⑶34、KDR、⑶133、⑶31、vWF、⑶14、⑶45，4°C过夜，PBS冲洗3遍，滴加适量Alexa Fluor 633标记的荧光二抗，室温孵育30min，PBS冲洗3遍，加入4、6_ 二脒基-2-苯基卩引哚,(4、6-diamidino_2-phenylindole,DAPI)浸染5min,然后置于突光显微镜下观察分析；
实验结果表明，三种方法所培养的EPC可表达⑶34、KDR、⑶133、⑶31、vWF，不表达⑶14和 CD45 ；
c)细胞生长曲线测定:分别取各组生长状况良好的第2代细胞，常规行0.05%胰酶消化后接种于96孔板中，将细胞密度调整约为3 X 13/孔，然后置于37°C、5% C02、95%湿度的细胞培养箱内培养。每隔24h在每组中取出5孔细胞加入10 μ I CCK-8，37°C避光孵育3h后，采用酶联免疫检测仪测定450nm波长吸光度，连续测定7天。绘制生长曲线，以时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标；
如图3所示，本实验结果表明，采用I型鼠尾胶原蛋白包被法所培养的EPC的增殖潜能明显高于阴性对照组(未包被组)(P〈0.05)，与阳性对照组(包被纤维连接蛋白组)的增殖潜能无明显差异(p>0.05)；
d)单细胞成克隆实验:取各组中第I?2代EPC重悬于含10%FBSUOng/mL VEGF,5ng/mL bFGF、5ng/mL TGF-β I的DMEM培养基中，进行梯度稀释，然后接种于96孔板中，在倒置显微镜下观察记录只有单个细胞的培养孔。将细胞培养板置于37°C、5% C02、95%湿度的细胞培养箱内培养，隔日更换培养基，并在倒置显微镜下动态观察EPC的克隆形成和细胞生长情况，将形成的细胞克隆进行消化传代，接种至培养瓶中继续培养；
如图4所示，本实验结果表明，采用I型鼠尾胶原蛋白包被法所培养的EPC，在培养一周后，可由单个细胞增殖为一个超过14个细胞以上的克隆体，具有极强的增殖能力和自我更新潜能；
e)FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验:将各组中的EPC进行细胞爬片培养，直至细胞生长至约80%融合，采用PBS冲洗细胞一遍。然后更换含Dil-acLDL (2.5yg/mL)的细胞培养基，置于37°C、5% C02、95%湿度的细胞培养箱内培养3小时。然后将载玻片取出，用4%多聚甲醛室温下固定lOmin，用PBS洗涤3遍。在载玻片上滴加FITC-UEA-1(20 μ g/mL),置于37°C温箱孵育lh。最后滴加DAPI工作液，室温下避光孵育5min。用PBS洗涤3遍，然后将玻片置于荧光显微镜下观察EPC胞外吸附FITC-UEA-1和内吞Dil-acLDL的情况；
如图5所示，本实验结果表明，采用I型鼠尾胶原蛋白包被法所培养的EPC，摄取FITC-UEA-1、Dil-acLDL的能力与阳性对照组(包被纤维连接蛋白组)相同；
f)体外成管实验:将基质胶(Matrigel)置于4°C冰箱过夜，使其变为均一的液态。然后取60 μ I Matrigel液体加入至96孔板中，每组5个复孔，并置于37°C温箱孵育30min，使得Matrigel充分固化。然后取第2?3代EPC以0.05%胰酶消化收集，以I X 15个细胞/孔接种到已经固化的Matrigel上，继续培养8小时。最后，在倒置显微镜下观察是否有管形结构形成，并拍照记录典型图片。每孔随机选取5个200倍镜视野，计算每孔EPC成管形结构的数目，对三组数据进行统计分析。
[0024]如图6所示，本实验结果表明，采用I型鼠尾胶原蛋白包被法所培养的EPC的体外成管能力明显高于阴性对照组(未包被组)(p〈0.05)，与阳性对照组(包被纤维连接蛋白组)的表达率无明显差异(p>0.05)。
[0025]本发明提供的内皮祖细胞的培养方法，简便可行，且大大降低了 EPC的培养成本；本发明制备了高纯度的I型鼠尾胶原蛋白，将其包被细胞培养瓶用于EPC的培养，并采用了价格低廉的培养基，成功地从人外周血中培养出EPC，并通过鉴定证实其具有常规方法所培养出的EPC的表型特征和功能；实验结果表明，采用本发明提供的培养方法可以成功地培养出EPC，未包被的培养瓶中EPC贴壁困难，生长缓慢，且成簇状生长，而包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶中EPC贴壁容易，生长速度较快，且成片状生长；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC可表达⑶34、KDR、⑶133、⑶31、vWF,但不表达⑶14和⑶45，经统计分析，⑶34、KDR、⑶133的表达率显著高于阴性对照组(p〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(p>0.05);采用本发明提供的培养方法所培养的EPC的增殖潜能明显高于阴性对照组(p〈0.05)，与阳性对照组的增殖潜能无明显差异(p>0.05);采用本发明提供的培养方法所培养的EPC，在培养一周后，可由单个细胞增殖为一个超过14个细胞以上的克隆体；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC，摄取FITC-UEA-1、Dil-acLDL的能力与阳性对照组相同；采用本发明提供的培养方法所培养的EPC的体外成管能力明显高于阴性对照组(p〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(p>0.05)。
[0026]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存； 步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶； 步骤c.人外周血单个核细胞的分离； 步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37°C，5%C02,95%湿度的培养箱中培养； 步骤e.EPC的消化传代； 步骤f.EPC的细胞流式分析检测； 步骤g.EPC的免疫荧光检测； 步骤h.细胞增殖实验,观察EPC的增殖能力； 步骤1.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力； 步骤j.FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测EPC摄取FITC-UEA-UDil-acLDL 的能力； 步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶原蛋白、纤维连接蛋白包被和未包被的方法培养的EPC的成管能力。
2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于:所述步骤d中阴性对照组采用未包被的培养瓶，阳性对照组中采用纤维连接蛋白包被培养瓶。
3.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于:所述步骤d中的DMEM培养基含 10% FBS，VEGF 10ng/mL, bFGF 5ng/mL, TGF-β I 5ng/mL。
4.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于:所述步骤f中检测的抗体包括 CD34-FITC、KDR-PE, CD133-FITC、CD31-PE、vWF-FITC、CD14-PE、CD45-FITC，统计分析三组中EPC表达特异性标记物的情况。
5.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于:所述步骤g中检测抗体:⑶34、KDR、⑶133、⑶31、vWF、⑶14、⑶45，在荧光显微镜下观察分析。
【文档编号】C12N5/0789GK104388388SQ201410630234
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】贾瑞鹏, 薛建新, 周六化, 葛余正, 吴然, 吴剑平, 朱佳庚, 曹朴 申请人:贾瑞鹏