一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，所述方法包括胎盘组织的获得、胎盘组织的粗剪、胎盘组织细胞分离、内皮祖细胞洗脱、内皮祖细胞浓缩纯化五个步骤，所述方法和使用的设备简单，操作方便，洗脱出来的内皮祖细胞损伤小，数量多，纯度高，增殖能力强，可以用于临床的移植和对受损血管的修复。
【专利说明】一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法。
【背景技术】
[0002]内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞，在生理或者病理因素刺激下，可以从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。近年来的研究等表明，内皮祖细胞在心血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，而且为缺血性疾病的研究提供了新的思路。
[0003]内皮祖细胞取材方便，在血管再生和心血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。例如，利用内皮祖细胞修复心肌梗死患者的心脏、治疗临床肢体缺血、治疗冠状动脉疾病、改善血管移植物的通畅率、改善糖尿病患者的血管形成能力、定向抑制肿瘤血管生成、作为基因治疗导向载体和靶细胞等等，应用内皮祖细胞治疗心血管疾病将是很有前途的新方法。
【发明内容】
[0004]本发明解决的技术问题是提供了一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，所述方法为从已经灌洗过造血干细胞(从胎盘中灌洗造血干细胞的方法参见本 申请人:提交的发明名称为“一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法”的专利申请中)的胎盘中剪取胎盘的胎儿侧，将其剪碎成小的组织碎块，使用全自动组织处理器处理胎盘组织，使用洗脱液将细胞重悬，通过细胞筛网过滤， 得到的细胞液用淋巴细胞分离液密度梯度离心，生理盐水清洗得到内皮祖细胞，得到的细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
[0005]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，进一步优选的步骤为，所述方法包括胎盘组织的获得、胎盘组织的粗剪、胎盘组织细胞分离、内皮祖细胞洗脱、内皮祖细胞浓缩纯化的步骤，其分别为:
(1)胎盘组织的获得:胎盘灌洗造血干细胞后，将胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，注意不要剪到母亲一侧的组织；
(2)胎盘组织的粗剪:将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5 mm的小块；
(3)胎盘组织细胞分离:将切成小块的胎盘组织转移到含有5mL PEB缓冲液(植物蛋白提取缓冲液)的gentle MACS的C管中，使用全自动组织处理器(gentle MACS Dissociator)处理胎盘组织；
(4)内皮祖细胞洗脱:将步骤(3)处理后的组织，用洗脱液从gentleMACS的C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL,然后关紧瓶盖,轻轻摇动离心管成细胞悬液，去除大的组织块，将70 μ m的细胞过滤网放置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过细胞过滤网；
(5)内皮祖细胞浓缩纯化:将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按2:1-1:2的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入细胞悬液，2200-2500 rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层，生理盐水离心清洗两遍，内皮祖细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
[0006]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法中，内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液的配制是:DMEM/F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15-20 mg/L，肝素钠的浓度是50-75单位/mL，AMD3100的浓度是5-10 mg/L，白蛋白的浓度为38-54 g/L。
[0007]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法中，内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液优选为:DMEM/F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是20 mg/L,肝素钠的浓度是50单位/mL，AMD3100的浓度是10 mg/L,白蛋白的浓度为50 g/L。
[0008]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法中，内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液进一步优选为:DMEM/F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15 mg/L，肝素钠的浓度是75单位/mL，AMD3100的浓度是5 mg/L,白蛋白的浓度为40 g/L。
[0009]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，所述的内皮祖细胞浓缩纯化还可以是:
将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按1:1的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入混合悬液，离心，离心条件:2200-2500 rpm，加速时间600 S，减速时间600 S，离心20-25分钟；离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，加生理盐水混匀，离心，离心条件:1000-1500 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S ，离心15-20分钟；离心结束后去掉上清液，生理盐水吹打沉淀，再离心,离心条件:1000-1500 rpm,加速时间45 S，减速时间45 s,离心15-20分钟,离心结束后,去掉上清液,DMEM培养基重悬沉淀，内皮祖细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
[0010]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，所述的内皮祖细胞浓缩纯化还可以是:在过滤后收集的细胞悬液中加入少量的生理盐水，充分吹打混匀细胞混合液，然后取50 mL离心管，每管加入20 mL的淋巴细胞分离液，移液枪吸取吹打起来的细胞混合液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，沿着管壁将细胞混合液缓缓加入，加的过程一定要注意缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入细胞混合液25 mL ;移液完成后，离心，离心条件:转速2200 rpm，加速时间600 S，减速时间600 S，离心时间20 min ;离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，转移到新的50 mL离心管中，每管20 mL，然后每管加入20mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 s,离心时间20 min ;离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20mL的生理盐水，吹打沉淀，然后离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心时间20 min ;离心结束后，去掉上清，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
[0011]通常采用⑶34、⑶133及KDR/FIk-Ι等几种抗原联合的方式对内皮祖细胞进行鉴定。CD34是分子量110 ku的唾液酸粘蛋白，选择性表达于造血干细胞及某些激活的血管内皮细胞，其功能是作为内皮细胞及造血前体细胞相互作用的粘附分子AD133 (即AC133)是造血干细胞及祖细胞选择性表达的胆固醇结合糖蛋白，分子量为120 ku，它的确切功能目前尚且未知，但CD133的细胞能够分化成多种细胞表型，包括内皮细胞；KDR/Flk-Ι是2型血管内皮生长因子受体。
[0012]采用本申请的方法提取的内皮祖细胞在6X IO6到1.2X IO7个/10 g胎盘，个体差异较小，其中约有0.25%-1.0%为⑶133阳性细胞，而脐血中的⑶133阳性细胞仅为0.03%,说明胎盘组织中含有大量的内皮祖细胞。从胎盘中可以洗脱出内皮祖细胞，经内皮祖细胞成血管实验证明，洗脱出的内皮祖细胞可以形成血管，经细胞培养和流式细胞仪检测，从胎盘中洗脱的内皮祖细胞可以用于临床的移植和对受损血管的修复。
[0013]本发明应用的试剂或药学成份，如生理盐水、培养基(如DMEM培养液)、硝酸甘油、胎牛血清、肝素钠和AMD3100等，均是无菌、无热源，均适用于临床移植的病人。
[0014]在本发明的所有操作步骤，都是药典允许的常规操作方法，包括采用无菌操作、无菌生理盐水洗涤、灭菌，无菌细胞浓缩和纯化等，所应用的试剂或药学成分，如生理盐水、培养基(如DMEM培养液)、硝酸甘油、胎牛血清、肝素纳和AMD3100等均是符合我国卫生机构的要求，操作完毕后做常规病毒，细胞检查及细菌、霉菌培养，只有合乎要求的内皮祖细胞才能应用于临床。
[0015]本发明所要求保护的制备方法的优点:
(1)本发明方法和使用的设备非常简单，操作方便，且胎盘来源丰富，供者无痛苦；
(2)本发明方法从胎盘中洗脱出来的内皮祖细胞损伤小，数量多，纯度高，增殖能力强，能更好的满足临床需要。
【专利附图】
【附图说明】
`[0016]图1:通过实施例一方法从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞流式细胞仪检测结果。
[0017]图2:从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞成血管实验结果。
[0018]图3:通过实施例二方法从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞流式细胞仪检测结果。
[0019]图中，图1是指通过实施例一方法从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞流式细胞仪检测结果，细胞计数的结果为I X IO7个细胞，结果表明从胎盘中洗脱内皮祖细胞CD34阳性的比例是15.74%，⑶133阳性的比例是0.8%。目前国际上普遍将⑶34阳性和⑶133阳性的细胞认为是内皮祖细胞，所以流式细胞仪的检测结果证明使用该方法从胎盘中获得了内皮祖细胞，而且比例高达0.8%。
[0020]图2是指通过实施例一方法从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞在甲基纤维素半固体培养基中体外培养，内皮祖细胞有成血管的生长分化趋势，表明在CD34阳性和CD133阳性的细胞是内皮祖细胞，具有增殖能力而且能够分化成血管。
[0021]图3是指通过实施例二方法从胎盘中洗脱得到的内皮祖细胞流式细胞仪检测结果，结果表明从胎盘中洗脱内皮祖细胞⑶34阳性的比例是30.74%，⑶133阳性的比例是
0.74%ο
【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。[0023]本发明涉及的技术方案为提供了一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法。
[0024]本发明所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法包括:
(O胎盘组织的获得:胎盘灌洗造血干细胞后，将胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，重为10 g的胎盘组织，胎盘是由胎儿部分和母亲部分构成的，胎儿部分在靠近胎儿侧，与母亲部分有海绵层相隔，剪胎盘组织的时候，注意不要剪到母亲一侧的组织；
(2)胎盘组织的粗剪:将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5mm的小块；
(3)胎盘组织细胞分离:使用全自动组织处理器(gentleMACS Dissociator)处理胎盘组织，将切成小块的胎盘组织转移到含有5 mL PEB缓冲液的gentle MACS的C管中，拧紧C管盖子,倒置在gentle MACS分离器上,开机并选择gentle MACS程序m_impTumor_01,运行，程序结束后，把C管从gentle MACS分离器中取下来；
(4)内皮祖细胞洗脱:配制洗脱液，洗脱液使用DMEM/F12培养液加入肝素钠、硝酸甘油、AMD3100、白蛋白、胎牛血清配制，将步骤(3)处理后的组织，用提前预热到37°C的洗脱液从gentle MACS的C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL，然后关紧瓶盖，轻轻摇动离心管成细胞悬液，去除大的组织块，将70 μ m的细胞过滤网放置于50mL离心管上，将细胞悬液通过细胞过滤网；
(5)内皮祖细胞浓缩纯化:将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按1:1的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入混合悬液，离心，离心条件:2200 rpm,加速时间600 S，减速时间600 s,离心20分钟；离心结束后，收集中间白膜层，到新的离心管中，加生理盐水混匀，离心，离心条件:1500rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心15分钟；离心结束后去掉上清液，生理盐水吹打沉淀，再离心，离心条件:1500 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心15分钟，离心结束后，去掉上清液，DMEM培养基重悬沉淀，内皮祖细胞细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
[0025]实施例一:从胎盘中洗脱内皮祖细胞
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5 mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签，条码。胎盘储运过程中的温度保持4-10 °C，在24小时内运送到实验室。
[0026]到实验室后将条码和标签都输入电脑中，将胎盘取出来，小心的用镊子整体取出，平缓放置于已经提前消毒处理的胎盘冲洗盒中，展开胎盘，将胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况。
[0027]将胎盘用无菌生理盐水清洗，清洗掉胎盘上的血凝块及积血，消毒后，将胎盘的目前面、胎儿面及脐带横截面拍照存档，然后将从胎盘中灌洗造血干细胞。
[0028]将灌洗完造血干细胞的胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，重为10 g的胎盘组织，将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5 mm的小块，使用美天妮全自动组织处理器(gentle MACS Dissociator)处理胎盘组织，将切成小块的胎盘组织转移到含有5 mL PEB缓冲液(植物蛋白提取缓冲液)的gentle MACS的C管中，拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS分离器上,开机并选择gentle MACS程序m_impTumor_01,运行,程序结束后,把C管从gentle MACS分离器中取下来，取洗脱液提前预热到37 °C，洗脱液的配制为:使用500mL的DMEM/F12培养液加FBS 50 mL使FBS的浓度为10%，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支，肝素钠注射液(2 mL:12500单位)2支，AMD3100 (A5602，5mg/瓶)I瓶，白蛋白25 g配制而成，制得的洗脱液DMEM/F12培养液中FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是20 mg/L,肝素钠的浓度是50单位/mL，AMD3100的浓度是10 mg/L,白蛋白的浓度为50 g/L。
[0029]将处理后的组织，用洗脱液从C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL，然后关紧瓶盖，轻轻摇动离心管，然后去除大的组织块，将70 μ m的细胞过滤网放置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过细胞过滤网，将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞按1:1的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入混合悬液，离心，离心条件:2200 rpm，加速时间600 S，减速时间600 s,离心20分钟，离心时慢加速慢减速。离心结束后，收集中间白膜层，到新的离心管中，加生理盐水混匀，离心，离心条件:1500 rpm,加速时间45 S，减速时间45 s,离心15分钟；离心结束后去掉上清液，生理盐水吹打沉淀，再离心，离心条件:1500 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心15分钟，离心结束后，去掉上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，对得到的内皮祖细胞进行细胞计数和流式细胞仪检测，检测结果中:10 g胎盘细胞计数获得的细胞个数为I X IO7个，⑶133阳性的比例达到0.8%，内皮祖细胞含量高(结果见说明书附图1)。
[0030]对得到的内皮祖细胞进行内皮祖细胞成血管实验，内皮细胞在体外甲基纤维素半固体培养基中培养，很快会出现生长分化成血管趋势，这证明得到的CD34和CD133阳性的细胞是内皮祖细胞，而且具有生长增殖和分化成血管的能力(结果见说明书附图2)。
[0031]实施例二:从胎盘中洗脱内皮祖细胞
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5 mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签，条码。胎盘储运过程中的温度保持4-10 °C，在24小时内运送到实验室。
[0032]到实验室后将条码和标签都输入电脑中，将胎盘取出来，小心的用镊子整体取出，平缓放置于已经提前消毒处理的胎盘冲洗盒中，展开胎盘，将胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况。
[0033]将胎盘用无菌生理盐水清洗，清洗掉胎盘上的血凝块及积血，消毒后，将胎盘的目前面、胎儿面及脐带横截面拍照存档，然后将从胎盘中灌洗造血干细胞。
[0034]将灌洗完造血干细胞的胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，重为10 g的胎盘组织，将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5 mm的小块，使用美天妮全自动组织处理器(gentle MACS Dissociator)处理胎盘组织，将切成小块的胎盘组织转移到含有5 mL PEB缓冲液(植物蛋白提取缓冲液)的gentle MACS的C管中，拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS分离器上,开机并选择gentle MACS程序m_impTumor_01,运行,程序结束后,把C管从gentle MACS分离器中取下来，取洗脱液提前预热到37 °C，洗脱液的配制为:使用500mL的DMEM/F12培养液加FBS 50 mL使FBS的浓度为10%，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)l.5支，肝素钠注射液(2 mL:12500单位)3支，AMD3100 (A5602，5 mg/瓶)0.5瓶，白蛋白20 g配制而成，制得的洗脱液DMEM/F12培养液中FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15 mg/L，肝素钠的浓度是75单位/mL，AMD3100的浓度是5 mg/L,白蛋白的浓度为40 g/L。
[0035]将处理后的组织，用洗脱液从C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL，然后关紧瓶盖，轻轻摇动离心管，然后去除大的组织块，将70 μ m的细胞过滤网放置于50 mL离心管上,将细胞悬液通过细胞过滤网，
在过滤后收集的细胞悬液中加入少量的生理盐水，充分吹打混匀细胞混合液，然后取50 mL离心管，每管加入20 mL的淋巴细胞分离液，移液枪吸取吹打起来的细胞混合液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，沿着管壁将细胞混合液缓缓加入，加的过程一定要注意缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入细胞混合液25 mL ;移液完成后，离心，离心条件:转速2200 rpm，加速时间600 S，减速时间600 S，离心时间20 min ;离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，转移到新的50 mL离心管中，每管20 mL，然后每管加入20mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 s,离心时间20 min ;离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理盐水，吹打沉淀，然后离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 s,离心时间20 min ;离心结束后，去掉上清，用20 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，流式细胞仪检测。检测结果显示⑶34阳性的比率达30.74%，⑶133阳性的比率0.74%，说明内皮祖细胞的含量 非常高(结果见说明书附图3)。
【权利要求】
1.一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，从已经灌洗过造血干细胞的胎盘中剪取胎盘的胎儿侧，将其剪碎成小的组织碎块，使用全自动组织处理器处理胎盘组织，使用洗脱液将细胞重悬，通过细胞筛网过滤，得到的细胞液用淋巴细胞分离液密度梯度离心，生理盐水清洗得到内皮祖细胞，得到的细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
2.根据权利要求1所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法具有胎盘组织的获得、胎盘组织的粗剪、胎盘组织细胞分离、内皮祖细胞洗脱、内皮祖细胞浓缩纯化的步骤，其分别为: (1)胎盘组织的获得:胎盘灌洗造血干细胞后，将胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，注意不要剪到母亲一侧的组织； (2)胎盘组织的粗剪:将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5 mm的小块； (3)胎盘组织细胞分离:将切成小块的胎盘组织转移到含有5mL PEB缓冲液的gentleMACS的C管中，使用全自动组织处理器(gentle MACS Dissociator)处理胎盘组织； (4)内皮祖细胞洗脱:将步骤(3)处理后的组织，用洗脱液从gentleMACS的C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL,然后关紧瓶盖,轻轻摇动离心管成细胞悬液，去除大的组织块，将70 μ m的细胞过滤网放置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过细胞过滤网； (5)内皮祖细胞浓缩纯化:将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按2:1-1:2的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入细胞悬液，2200-2500 rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层，生理盐水离心清洗两遍，内皮祖细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
3.根据权利要求1或2所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述的内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液的配制是:DMEM /F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15-20 mg/L，肝素钠的浓度是50-75单位/mL，AMD3100的浓度是5_10 mg/L,白蛋白的浓度为38-54 g/L。
4.根据权利要求1或2所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述的内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液的配制是:DMEM/F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是20 mg/L，肝素钠的浓度是50单位/mL，AMD3100的浓度是10 mg/L，白蛋白的浓度为50 g/L。
5.根据权利要求1或2所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述的内皮祖细胞洗脱使用的洗脱液的配制是:DMEM/F12培养液中加入胎牛血清(FBS)、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15 mg/L，肝素钠的浓度是75单位/mL，AMD3100的浓度是5 mg/L,白蛋白的浓度为40 g/L。
6.根据权利要求1或2所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述的内皮祖细胞浓缩纯化还可以是:将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按1:1的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入混合悬液，离心，离心条件:2200-2500 rpm,加速时间600 S，减速时间600 s,离心20-25分钟；离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，加生理盐水混匀，离心，离心条件=1000-1500 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心15-20分钟；离心结束后去掉上清液，生理盐水吹打沉淀，再离心，离心条件:1000-1500rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心15-20分钟，离心结束后，去掉上清液，DMEM培养基重悬沉淀，内皮祖细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
7.根据权利要求1或2所述的从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述的内皮祖细胞浓缩纯化还可以是:在过滤后收集的细胞悬液中加入少量的生理盐水，充分吹打混匀细胞混合液，然后取50 mL离心管，每管加入20 mL的淋巴细胞分离液，移液枪吸取吹打起来的细胞混合液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，沿着管壁将细胞混合液缓缓加入，加的过程一定要注意缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入细胞混合液25 mL ;移液完成后，离心，离心条件:转速2200 rpm,加速时间600 s,减速时间600 s,离心时间20min;离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，转移到新的50 mL离心管中，每管20 mL，然后每管加入20 mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心时间20 min ;离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理盐水，吹打沉淀，然后离心，离心的条件:转速1000 rpm，加速时间45 S，减速时间45 S，离心时间20 min;离心结束后，去掉上清，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，内皮祖细胞进`行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。
【文档编号】C12N5/0735GK103756957SQ201410039060
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】戴晓宇, 李栋 申请人:山东省齐鲁干细胞工程有限公司