一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：采集外周血、分离收集得到单个核细胞、加入培养液进行细胞培养、用贴壁细胞和非贴壁细胞的混合物进行培养。根据本发明家禽内皮祖细胞的分离培养方法，可从家禽外周血中分离培养出大量EPCs。
【专利说明】一种分罔培养家禽内皮祖细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及家禽组织与细胞培养工程领域，特别是一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法。
【背景技术】
[0002]内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类具有分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与胚胎期血管发生，也参与出生后血管新生和血管内皮损伤后的修复过程。当血管内皮受损时，体循环中的EPCs在多种因子的作用下迁移到特定的位点进行分化增生，促进血管修复。EPCs的血管修复作用及定向迁移作用使其在心血管疾病治疗领域及基因靶向治疗领域显示出了广泛的应用前景，是生物医学领域研究的热点之一。
[0003]目前，家禽已成为生物医学研究领域的一类重要试验动物，相关研究为医学研究提供了重要的比较医学知识。目前已有从家禽骨髓细胞中分离培养EPCs的报道，但最新的科学研究表明，从骨髓细胞中分离培养的疑似EPCs的细胞并不是真正意义上的EPCs。
[0004]对哺乳动物的研究发现，通过培养外周血单个核细胞可获得EPCs。目前常用的方法是:利用淋巴细胞分离液富集外周血单个核细胞，用含有胎牛血清和多种生长因子的EGM-2或EGM-2MV培养基稀释细胞，在37°C、5% CO2条件下培养，24h后彻底去除未贴壁细胞，继续培养后可获得EPCs。也有研究表明培养非贴壁细胞可获得EPCs。但经我们多次探索后发现，单纯培养贴壁细胞或非贴壁细胞均难以成功获得家禽EPCs，表明分离培养哺乳动物EPCs的方法并不适用于分离培养家禽EPCs。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供`一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法。
[0006]一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)选取20日龄健康肉鸡，翅下静脉采集外周血；
(2)用L-DMEM培养基按体积比1:1稀释外周血后，再按体积比1:1缓慢滴加到鸡淋巴细胞分离液中，2000 rpm离心15min后弃上清液,收集得到单个核细胞；
(3)将收集到的单个核细胞用L-DMEM培养基离心洗涤1-2次，收集细胞，用EGM-2培养基重悬细胞并计数；所述EGM-2培养基含有体积百分比为10%的胎牛血清、100 IU/mL双抗以及血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1 ;
(4)分别将单个核细胞按5X IO7个/孔、I X IO7个/孔和I X IO6个/孔的量种植于用50 u g/ml浓度的鼠尾胶原蛋白预先包被过的6孔细胞培养板中，置39°C、5% CO2培养箱中进行原代培养；每24h半量换液一次；5天后每24 h换液一次,7天后每48h换液一次直到传代。
[0007]本发明对家禽内皮祖细胞的分离、培养、纯化等过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明家禽内皮祖细胞的分离培养方法，用贴壁细胞和非贴壁细胞的混合物进行培养，可从家禽外周血中分离培养出大量EPCs。所建立的家禽内皮祖细胞模型可用于家禽血管修复机制、细胞的发育与代谢等相关研究，并为这些研究提供了便利。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是单个核细胞初始接种量对分离培养EPCs的影响示意图。其中，A.5X IO7个 / 孔(200X); B.1XlO7 个 / 孔(100X) ; C.1XlO6 个 / 孔(200X)。
[0009]图2是EPCs细胞形态学观察图。其中A.3d后细胞大部分贴壁并开始出现梭形细胞(100X) ; B.细胞呈克隆性生长(100X) ; C.7 d后出现大量梭状细胞(100X) ; D.10 d后细胞呈现典型铺路石样外观(100X)。
[0010]图3是EPCs细胞双荧光染色结果图。A.阴性对照；B.Dil-ac-LDL阳性细胞；C.FITC-UEA-1 阳性细胞；D.Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1 双阳性细胞(B 和 C 叠加)。
[0011]图4是EPCs表面标志物检测结果图。A: CD31、CD133和VEGFR-2 mRNA的表达；B: CD34 mRNA 的表达。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0013]实施例1 I材料与方法
1.1实验动物
20日龄健康AA肉鸡。
`[0014]细胞培养板的处理
实验组培养板用50 y g/ml浓度的鼠尾胶原蛋白进行包被，对照组培养板不经过包被直接使用。
[0015]外周血单个核细胞的分离
于肉鸡翅下静脉采集外周血20ml，EDTA抗凝，用L-DMEM培养基按体积比1:1稀释后，再按1:1体积比缓慢叠加到鸡淋巴细胞分离液上层。2000 rpm离心15min后,收集单个核细胞。
[0016]诱导生长及初始种植细胞浓度对EPCs生长的影响
将收集到的单个核细胞用L-DMEM培养基离心洗涤1-2次(1500rpm、每次5min)。收集细胞，用含有10% (v/v)胎牛血清、100 IU/mL双抗(100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素)以及血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-KIGF-1)的EGM-2培养基(EGM-2 BulletKit ;生产厂家:美国Lonza公司，产品货号:CC-3162)重悬细胞并计数。
[0017]分别将单个核细胞按5 X IO7个/孔、I X IO7个/孔和I X IO6个/孔的量种植于预先处理好的6孔细胞培养板中，置39°C、5% CO2培养箱中进行原代培养。每24h半量换液一次，换液时从培养箱中取出培养板，静置3~5min后,用移液器小心移除培养基上层1/2的液体，以保留未贴壁细胞。5d后每24 h换液一次，7d后每48h换液一次直到传代。
[0018]鉴定
1.5.1形态学观察分别于培养后第3、7、10和14d，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
[0019]和FITC-UEA-1 摄取试验
EPCs 具有摄取 Dil acetylated low density lipoprotein (Dil-ac-LDL)和 FlTOOxytropislectin I (FITC-UEA-1)的能力，根据这一特性可鉴定EPCs。取第2代细胞经0.25%胰酶消化后重新种植于24孔板，待细胞贴壁后弃掉培养基，加入10 u g/ml Dil-ac-LDL于39°C下孵育4h。弃掉液体，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15min。弃掉液体，用PBS洗3次，加入IOii g/ml FITC-UEA-1常温下孵育lh，荧光显微镜下观察染色情况并拍照。
[0020]表面标志物检测
目前认为，CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体_2 (VEGFR-2)可作为鉴定EPCs的表面标志。CD31是内皮细胞的特异性表面标志，这一标志也常用于鉴定EPCs。本实验观察了培养细胞是否表达上述表面标志。收集第2代细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA第一链，以cDNA为模板扩增CD31、CD34、CD133和VEGFR-2基因(引物序列见表1)。PCR反应总体积为20iU，反应体系为:10XPCR Buffer 2W、dNTP Mix(IOmM) 0.5耵、MgCl (25mM) 1.2耵、ddH20 13.叫1、上下游引物各 0.5耵、cDNA 模板 1耵、0.5UM Taq 酶 0.4W。反应条件:94°C预变性 5min ;94°C变性 30s ;55~58°C退火 30s ；72°C延伸30s ；35个循环；72°C延伸5min ;4°C保存。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Tanon凝胶成像系统观察并拍照。
[0021]表1.PCR引物序列
【权利要求】
1.一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)选取20日龄健康肉鸡，翅下静脉采集外周血； (2)用L-DMEM培养基按体积比1:1稀释外周血后，再按体积比1:1缓慢滴加到鸡淋巴细胞分离液中，2000 rpm离心15min后弃上清液,收集得到单个核细胞； (3)将收集到的单个核细胞用L-DMEM培养基离心洗涤1-2次，收集细胞，用EGM-2培养基重悬细胞并计数；所述EGM-2培养基含有体积百分比为10%的胎牛血清、100 IU/mL双抗以及血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1 ; (4)分别将单个核细胞按5 X IO7个/孔、I X IO7个/孔和I X IO6个/孔的量种植于用，50 u g/ml浓度的鼠尾胶原蛋白预先包被过的6孔细胞培养板中，置39°C、5% CO2培养箱中进行原代培养；每24h半量换液一次；5天后每24 h换液一次,7天后每48h换液一次直到传代。
【文档编号】C12N5/071GK103484423SQ201310308919
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】谭勋, 毕师诚 申请人:浙江大学