专利名称：酪氨酸酶活性调整剂、其制法及含该调整剂的外用制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括具有酪氨酸酶抑制或促进活性的化合物作为活性成分的酪氨酸酶活性调整剂；并涉及包括该调整剂的外用制剂。本发明还涉及制备该化合物的方法。
具体地说，本发明涉及具有酪氨酸酶抑制活性的新型熊果苷酯化合物，包括该化合物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂，并涉及包括该抑制剂的外用制剂。此外，本发明涉及包括十一碳烯酸、其盐或酯衍生物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂，并涉及包括该抑制剂的外用制剂。另外，本发明还涉及包括抗坏血酸或其衍生物作为活性成分的酪氨酸酶活性促进剂以及包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂。本发明也涉及用酶制备酯化合物的方法，该方法适用于制备酪氨酸酶抑制剂或促进剂。
背景技术：
在具有酪氨酸酶抑制活性的化合物中，通常使用诸如熊果苷和曲酸的天然物质作为化妆品和其它领域的美白剂(例如，Journal of thePharmaceutical Society of Japan，112(4)，pp.276-282，1992；Journalof the Pharmaceutical Society of Japan，115(8)，pp.626-632，1995；BIO INDUSTRY，11(4)，206，1994；和Biosci.Biotech.Biochem.，61，11，pp.1926-1928，1997)。然而，当用于皮肤外用制剂如化妆品时，上述化合物的缺点在于它们具有高的亲水性并因此具有差的皮肤吸收性。因此，需要开发具有更高疏水性的熊果苷衍生物或其它化合物。苯酚部分被酯化的熊果苷衍生物是已知的美白剂(日本待审专利No.1999-71225)。此外，通过将熊果苷的6位转变为羟基酯得到的化合物是已知的美白化妆品(日本待审专利No.1993-194181)。而且，已报道了利用脂肪酶通过熊果苷与肉桂酸乙烯酯的酯交换反应选择性酯化熊果苷的6位得到的化合物(Bioscience Biotechnology andBiochemistry，61，11，pp.1926-1928，1997)。然而，还没有证实熊果苷衍生物的酪氨酸酶抑制活性和基于该活性的皮肤美白效果，而且还没有得到具有令人满意的效果的熊果苷衍生物。
十一碳烯酸是从人体皮肤中得到的C11不饱和脂肪酸，并起到皮肤清洁剂的重要作用。商业上是通过蓖麻油的热解来生产该酸。已知十一碳烯酸及其盐及衍生物具有抗菌作用，而且据报道可用作皮肤清洁剂(日本待审专利No.2002-114669)。最近已开发海藻糖酯作化妆品原料(日本待审专利No.2001-278752和No.1993-137994)。但是还没有报道十一碳烯酸、其盐和酯衍生物的酪氨酸酶抑制活性。
同时，已知作为变老现象的白发是由于缺少转移到角化细胞中的黑色素所致。因此，研究人员主要研究了酪氨酸酶活性促进组分和黑素生成促进组分以开发白发抑制剂。具体地说，研究人员已试图从天然产物和各种其它物质的提取物中发现白发抑制活性，并试图利用各种化合物作为活性成分。例如，日本待审专利No.1995-316048建议了ω-烷氧羰基烷基铵，其盐，ω-烷氧羰基烷基三烷基铵及其盐作为黑素生成促进剂是有效的。也推荐腺苷衍生物(日本待审专利No.1994-305940)和二氢羽扇醇衍生物(日本待审专利No.2002-3381)。然而，上述化学品的安全性没有保证。日本待审专利No.1993-78222建议了一种包括日本黄连属的水或乙醇提取物作为活性成分的白发抑制剂。日本待审专利No.1995-285874建议了一种包括贝类如海扇、贻贝、牡蛎等提取物的黑素生成促进剂。日本待审专利No.1999-124318建议了一种包括至少选自问荆(Equisetum arvense L.)、金银花(Lonicerajaponica Thunb.)、香茶菜(Plectranthus japonicus)、葡萄(Vitis viniferaL.)、丝瓜(Luffa cylindrica Roem.)、接骨木(Sambucus nigra)、悬钩子(Rucus aculeatus L.)、枣(Zizyphus jujuba)和其提取物之一作为活性成分的白发抑制剂。日本待审专利No.1995-316026建议了一种包括至少一种选自Tricholomataceae、Hydnaceae、Polyporaceae、Fistulinaceae、Mucronoporaceae、Helvellaceae、Strophariaceae和Agaricaceae族担子菌类培养液和细胞提取物的黑素生成促进剂发用制剂。日本待审专利No.1999-189541公开了卡瓦胡椒(Pipermethysticum)和其提取物具有黑素生成促进效果。此外，在genusSpyridia和Dictyota dichotoma的海藻提取物(日本待审专利No.1998-330218)，人参(Panax ginseng C.A.Meyer)、Panax notoginseng、丹参(Salvia miltiorrhiza)、Yucca elephantipes、枇杷(Eriobotrya japonicaLindley)、金银花(Lonicera japonica)和Sarsaparilla的提取物(日本待审专利No.2001-288098)以及无花果(Ficus carica)、桑树(Morusalba)和其提取物(日本待审专利No.2002-47130)证实有黑素生成促进效果。但是，植物和动物提取物的生产受原材料可供量的限制，而且提取物具有原材料浓度不稳定的缺点，导致性能不可靠。因此，需要开发具有充分的酪氨酸酶活性促进效果和黑素生成促进效果的合成化合物。
在食品工业中，通过使用疏水性醇和脂肪酸作为原材料已将用于制备上述酯化合物的酶催化酯化反应应用于实践中(Bioindustry，19，pp.62-71(2002))。然而，当使用在疏水性溶剂中较难溶的亲水性化合物作原材料时，反应的收率低，因此难以将该反应用于实际生产过程中。日本待审专利No.1996-245680报道了利用可溶于有机溶剂的酶在辛烷、己烷等有机溶剂中制备蔗糖酯的方法。然而，由于蔗糖较难溶于上述有机溶剂，因此该方法不能得到高的收率。但糖和嘌呤核苷高度溶于DMSO、DMF等有机溶剂。例如，蔗糖在DMSO中的溶解度为约40％(Advance of Carbohydrate Chemistry andBiochemistry，27，pp.85-125(1972))。嘌呤核苷如鸟苷溶解在含50％或更多DMSO的DMF中。然而，人们认为诸如DMF和DMSO的非质子有机溶剂的使用常常容易使水解酶失活，从而难以进行反应(日本待审专利No.1997-271387和No.1996-9987)。因此寻求即使在其中亲水性化合物高度溶解的溶剂中也表现出高活性的酶。目前已发现芽孢杆菌和链霉菌由来的蛋白酶在DMF或类似溶剂中表现出高活性(Journal ofAmerican Chemical Society，110，pp.584-589(1988))。然而，至今仍未发现在能够溶解糖和核苷的溶剂中保持高活性的酶。
发明内容
本发明涉及包括具有酪氨酸酶抑制或促进活性的化合物作为活性成分的酪氨酸酶活性调整剂；包括该活性调整剂的外用制剂；以及适用于制备该化合物的酯化方法。本发明详述如下。
I.本发明的第一优选实施方案提供了熊果苷酯，其具有比熊果苷显著高的酪氨酸酶抑制活性并具有改进的皮肤吸收性；及其制备方法。
本发明人进行了大量研究，结果发现在熊果苷的6位引入疏水性取代基提高了熊果苷的抑制活性。本发明人基于上述发现进行了深入研究并完成了本发明。
本发明提供了如下的熊果苷酯化合物，酪氨酸酶活性抑制剂，和外用制剂，以及制备熊果苷酯化合物的方法。
1-1.式(1)表示的熊果苷酯化合物式(1) 其中，Ra为疏水基。
1-2.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(2)表示式(2)
其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-3.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(3)表示式(3) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-4.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(4)表示式(4) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-5.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(5)表示
式(5) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-6.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(6)表示式(6) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基；R2为烷基或芳基。
1-7.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(7)表示式(7) 其中，R1、R3、R4和R5各自独立地为单键，亚烷基或亚芳基X表示重复单元数并且为1-6。
1-8.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(8)表示式(8)
其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-9.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(9)表示式(9) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-10.根据1-1项所述的熊果苷酯化合物，其由式(10)表示式(10) 其中，R1为单键，亚烷基或亚芳基。
1-11.酪氨酸酶抑制剂，包括根据1-1至1-10项所述的熊果苷酯化合物中的至少一种作为活性成分。
1-12.皮肤外用制剂，包括根据1-11项所述的酪氨酸酶抑制剂。
1-13.制备熊果苷酯化合物的方法，包括进行熊果苷与式(11)至(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反应步骤；更具体地说，制备式(1)至(10)之一表示的熊果苷酯化合物的方法，包括进行熊果苷与式(11)至(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反应步骤式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(15)
A-OCO-R1-COO-R2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；R2为烷基或芳基；式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自独立地为单键，亚烷基或亚芳基；X表示重复单元数并且为1-6。
式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；1-14.根据1-13项所述的方法，其中酯化反应在酶催化剂存在的条件下进行。
1-15.根据1-13项所述的方法，其中酯化反应在化学催化剂存在的条件下进行。
1-16.根据1-13至1-15中任一项所述的方法，其中在进行酯化反应的同时进行脱水处理。
1-17.根据1-13至1-16中任一项所述的方法，其中在进行酯化反应后接着进行如下步骤使用非极性有机溶剂从反应混合物中萃取和分离未反应的羧酸衍生物；以及然后加入过量的水以萃取和分离未反应的熊果苷并沉淀熊果苷酯化合物。
本发明的第一实施方案详述如下。
本发明的熊果苷酯化合物是通过在熊果苷的6位引入疏水基得到的化合物，更具体地说，包括式(1)至(10)表示的化合物。
本发明的熊果苷酯化合物可通过用羧酸化合物酯化熊果苷制得。在说明书和权利要求书中，有时将羧酸、二羧酸、和羧酸及二羧酸的衍生物统称为“羧酸化合物”。
熊果苷酯化合物的制备详述如下。
式(2)化合物通过使熊果苷与式(11)表示的羧酸或羧酸衍生物反应可合成式(2)的化合物式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构也没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基(isopropylene)和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(11)表示的羧酸衍生物的例子包括丙烯酸衍生物和10-十一碳烯酸衍生物。
式(3)化合物通过使熊果苷与式(12)表示的羧酸或羧酸衍生物反应可合成式(3)的化合物式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(12)表示的羧酸衍生物的例子包括甲基丙烯酸衍生物。
式(4)化合物通过使熊果苷与式(13)表示的羧酸或二羧酸衍生物反应可合成式(4)的化合物式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(13)表示的二羧酸衍生物的例子包括衍生自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸的化合物；以及衍生自(邻-、间-、对-)苯二甲酸和其它二羧酸的化合物。上述化合物的具体例子包括己二酸二乙烯酯。
式(5)化合物通过使熊果苷与式(14)表示的二羧酸或其衍生物反应可合成式(5)的化合物式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有6至21个碳原子，优选8至12个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(14)表示的二羧酸及其衍生物的例子包括辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸；(邻-、间-、对-)苯二甲酸和其它二羧酸；以及衍生自上述二羧酸的化合物。
式(6)化合物可通过使熊果苷与式(15)表示的羧酸或二羧酸衍生物反应合成式(6)的化合物式(15)A-OCO-R1-COO-R2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；R2为烷基或芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基可以是诸如亚苯基。
R2为烷基或芳基。烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其具体例子包括甲基、乙基和其它直链烷基；异丙基和其它支链烷基。芳基可以是如苯基。
式(15)表示的二羧酸衍生物的例子包括衍生自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸的化合物；以及衍生自(邻-、间-和对-)苯二甲酸及其它二羧酸的化合物。
式(7)化合物可通过使熊果苷与式(16)表示的羧酸或其衍生物反应合成式(7)的化合物式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自独立地为单键，亚烷基或亚芳基；X表示重复单元数并且为1-6。
亚烷基具有1至21个，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(16)表示的羧酸及其衍生物的例子包括壬烯二酸、肉豆蔻脑酸、十五碳烯酸、棕榈油酸、十六碳三烯酸、十七碳烯酸、十七碳二烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳烯酸和衍生自上述羧酸的化合物。
式(8)化合物可通过使熊果苷与式(17)表示的羧酸或其衍生物反应合成式(8)的化合物式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(17)表示的羧酸衍生物的具体例子包括衍生自新戊酸的化合物等。
式(9)化合物可通过使熊果苷与式(18)表示的羧酸或其衍生物反应合成式(9)的化合物
式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(18)表示的羧酸衍生物的具体例子包括衍生自苯甲酸的化合物。
式(10)化合物可通过使熊果苷与式(19)表示的羧酸或其衍生物反应合成式(10)的化合物式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
亚烷基具有1-16个碳原子，优选2-8个碳原子。其结构没有限制，可以是直链、支链、环状或其它结构。亚烷基的具体例子包括亚甲基、亚乙基和其它直链亚烷基；乙基亚乙基、亚异丙基和其它支链亚烷基；等。亚芳基包括亚苯基等。
式(19)表示的羧酸衍生物的具体例子包括衍生自丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸和二十四烷酸的化合物。
优选在酶催化剂或化学催化剂的存在下进行上述熊果苷与式(11)至(19)之一表示的化合物的酯化反应。
可用的酶催化剂包括诸如脂肪酶、蛋白酶、酯酶和其它已知的酶催化剂。具体例子包括葱头假单胞菌(Pseudomonas capacia)由来的脂肪酶；Candida anterctica由来的脂肪酶；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)由来的蛋白酶；链霉菌属(Streptomyces sp.)由来的蛋白酶等。在上述酶催化剂中，特别优选Candida anterctica由来的脂肪酶和枯草芽孢杆菌由来的蛋白酶。
可用的化学催化剂包括诸如酸、碱、吡啶衍生物和其它已知的催化剂。具体例子包括对甲苯磺酸、醇钠、烷氧基钛、二甲基氨基吡啶、盐酸、硫酸、乙酸锌、吡啶、4-吡咯烷基吡啶、二环己基氨基甲酸等。
由于上述酯化反应对熊果苷的6位具有优先选择性，因此优选在酶催化剂存在的条件下进行上述酯化反应。特别优选使用Candidaanterctica由来的脂肪酶和枯草芽孢杆菌由来的蛋白酶的反应。
当使用酶催化剂制备熊果苷酯化合物时，反应温度为0-100℃，优选30-50℃，反应时间为1-340小时，优选24-170小时。可用的溶剂包括二甲基甲酰胺，二甲亚砜、吡啶、丙酮、二噁烷和其它溶剂，这些溶剂可单独或组合使用。也可使用用作起始原料的羧酸、二羧酸或其衍生物作溶剂。反应混合物中熊果苷的浓度为1-40重量％，优选1-10重量％。酶与反应混合物的比为0.1-20重量％，优选0.1-1重量％。优选使用相对于1mol熊果苷为约0.5-约10mol，更优选约1-约5mol的羧酸、二羧酸或其衍生物。
当使用化学催化剂制备熊果苷酯时，反应温度为0-100℃，优选40-50℃，而反应时间为1-48小时，优选1-24小时。可用溶剂包括二甲基甲酰胺，二甲亚砜、吡啶、丙酮和二噁烷，这些溶剂可单独或组合使用。反应混合物中熊果苷的浓度为1-40重量％，优选1-10重量％。化学催化剂与反应溶剂的比为0.1-5重量％，优选0.1-1重量％。优选使用相对于1mol熊果苷为约0.5-约10mol，特别优选约1-约5mol的羧酸、二羧酸或其衍生物。
在本发明中，用作起始原料的羧酸、二羧酸或其衍生物优选具有游离末端羧基。具有游离末端羧基的化合物的优点在于该化合物便宜而且酯化反应的副产物只有水。也就是说，使用酯化合物作为起始原料的反应可能会产生着色物质，因此需要进行精制处理，例如柱色谱法，而使用具有游离末端羧基的化合物的反应不会产生上述问题。
由于酯化反应是可逆的，因此优选在熊果苷与具有游离末端羧基的化合物进行酯化反应的同时对该反应的副产物水进行脱水以有效进行酯化。脱水方法没有限制，可适当地使用任何已知方法。所用方法的例子包括减压脱水、干燥惰性气流脱水、通过在诸如分子筛的有机物质上选择性吸水的脱水。对小型反应而言，利用分子筛脱水简单并且是优选的。对于分子筛的形状没有限制，可以是粉末状、小球状等。所用分子筛的比相对于总反应混合物为0.1-50重量％，优选1-20重量％。
反应后进行已知的适当分离和精制处理，以从反应产物中分离已经在熊果苷的6位引入疏水基的化合物，从而得到本发明的熊果苷酯化合物。
可用的分离和精制方法包括已知的色谱法，例如高效液相色谱法、凝胶过滤色谱法等。可以适当地选择柱子类型、流动相及其它条件。
也可使用液-液萃取，基于溶解度差别的分级沉淀和其它分离方法。例如，使用非极性有机溶剂从酯化反应混合物中萃取和分离未反应的羧酸衍生物，然后加入过量的水以萃取和分离未反应的熊果苷并同时沉淀熊果苷酯化合物。需要时可重复上述由萃取、分离和沉淀组成的方法，然后收集沉淀，得到本发明的熊果苷酯化合物。
可用的非极性有机溶剂包括诸如环己烷、乙醚、石油醚等，其中优选环己烷。
“过量的水”是指相对于用作起始原料的熊果苷化合物重量为约20倍重量的水。
使用如此得到的式(1)至(10)之一表示的熊果苷酯化合物作为活性成分可得到酪氨酸酶抑制剂。
该酪氨酸酶抑制剂包括一种或多种式(1)至(10)表示的熊果苷酯化合物。
可通过已知方法从一种或多种式(1)至(10)的熊果苷酯化合物或从一种或多种该化合物与适当载体的混合物配制酪氨酸酶抑制剂。
可将本发明的酪氨酸酶抑制剂添加到化妆品、皮肤外用制剂、医药、食品、鱼贝类养殖用饲料等，也可用于食品处理。例如，可将酪氨酸酶抑制剂添加到化妆品中以得到具有皮肤美白效果的化妆品。此外，也可将它添加到食品中或用于处理食品表面以防止食品因黑素生成而变色。
酪氨酸酶抑制剂也可用于外用制剂中。具体地说，其可适当地适用于皮肤外用制剂，优选皮肤美白用外用制剂。
本发明的皮肤外用制剂包括一种或多种式(1)至(10)表示的熊果苷酯化合物。
可通过已知方法将酪氨酸酶抑制剂与适当载体的混合物进行配制得到该外用制剂。
该外用制剂可含有多种通常用于外用制剂的其它成分，例如水性组分、粉末组分、保湿剂、表面活性剂、防腐剂、增稠剂、紫外线吸收剂、香料等。
外用制剂的剂型可以是诸如软膏剂、霜剂、乳液、搽剂、洗剂等。
外用制剂含有酪氨酸酶抑制有效量的熊果苷酯化合物。熊果苷酯化合物的比相对于整个外用制剂为约0.001-约10重量％，优选约0.005-约5重量％。
可将该外用制剂以合适的量每天一次或多次施用于诸如脸、颈、臂和手的身体部位上，所述部位容易具有或具有疤、雀斑等或可能被或已被晒黑。
本发明的熊果苷酯化合物由于引入疏水基而具有改进的皮肤吸收性能，而且比熊果苷具有显著高的酪氨酸酶抑制活性。此外，该熊果苷酯化合物具有大概是基于其糖酯结构的抗多种微生物的抗菌作用；大概是由于其酚羟基基团消除性能；和大概是由于酯部分的疏水性和熊果苷部分的亲水性的表面化作用。
由于上述特性，本发明的熊果苷酯化合物可有效地用作化妆品、医药和其它领域中的酪氨酸酶抑制剂或皮肤外用制剂及其它制剂中的活性成分。
II.本发明的第二优选实施方案提供了包括十一碳烯酸、其盐或其衍生物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂；以及包括该酪氨酸酶抑制剂的外用制剂，特别是包括该酪氨酸酶抑制剂的皮肤美白用化妆品。
本发明人进行了大量研究并发现十一碳烯酸、其盐及其糖酯具有酪氨酸酶抑制活性，并进行了进一步的研究。
本发明提供了以下的酪氨酸酶抑制剂和外用制剂。
2-1.酪氨酸酶抑制剂，包括式(20)表示的十一碳烯酸、其盐、和/或其酯衍生物式(20) 其中，Rb为氢或从糖除去一个羟基得到的糖残基。
2-2.根据2-1项所述的酪氨酸酶抑制剂，其中Rb为从糖除去一个羟基得到的糖残基。
2-3.根据2-1项所述的酪氨酸酶抑制剂，其包括十一碳烯酸和/或其盐，其中Rb为氢。
2-4.包括根据2-1至2-3中任一项所述酪氨酸酶抑制剂的外用制剂。
2-5.根据2-4项所述的外用制剂，其是皮肤美白用化妆品。
本发明的第二实施方案详述如下。
十一碳烯酸、其盐或其衍生物十一碳烯酸及其盐是已知的。
十一碳烯酸的盐的例子包括十一碳烯酸与钠、钾、锂和其它碱金属的盐；与钙、镁和其它碱土金属的盐；与铜、二乙醇胺、铵、二甲基胺、三甲基胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、硬脂基二甲基胺等的盐。
可通过在选自水、醇(甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等)、THF、醚、乙腈等的一种或多种溶剂中将十一碳烯酸与碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、其它金属氢氧化物或胺混合制备上述盐。
Rb为氢或为从糖除去一个羟基得到的糖残基。当Rb为糖残基时，Rb-OH为单糖、二糖、三糖、糖醇或其它糖。
Rb-OH表示的糖的例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、核糖、树胶醛醣、木糖、鼠李糖和其它单糖；麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、海藻糖、异曲二糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、sambubiose、新桔皮糖和其它二糖；麦芽三糖、异麦芽三糖、纤维三糖、蜜三糖、龙胆三糖和其它三糖；以及丙三醇、赤藻糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、纤维醇和其它糖醇。优选的糖包括蔗糖和海藻糖。
根据在日本待审专利No.2000-65290中所述的方法在酶催化剂存在的条件下使十一碳烯酸甲酯、十一碳烯酸乙酯等酯与糖残基进行反应，从而实现酯交换反应，得到本发明的十一碳烯酸酯。
可用作催化剂的酶的例子包括芽孢杆菌由来的蛋白酶、Candidaanterctica由来的脂肪酶。
通过使用选自十一碳烯酸、其盐、及其酯衍生物的化合物或至少上述两种化合物的混合物作为活性成分可得到酪氨酸酶抑制剂。
可通过已知方法对选自十一碳烯酸、其盐及其酯衍生物中的至少一种化合物单独或与适当的载体混合进行配制来制备该酪氨酸酶抑制剂。
此外，可将该酪氨酸酶抑制剂添加到皮肤美白用化妆品、医药、食品、鱼贝类养殖用饲料等，或用于食品处理。酪氨酸酶抑制剂抑制酪氨酸酶活性，从而抑制了黑素生成，因此当添加到化妆品时，其提供了具有皮肤美白效果的化妆品。另外，也可将酪氨酸酶抑制剂添加到因黑色素生成而易于变色的食品中或用于处理该食品的表面以防止变色。十一碳烯酸是原本获自皮肤的物质，因此它的安全性已经得到证实。通过摄取含十一碳烯酸或其盐的食品可期待无安全性问题的皮肤美白效果。
在外用制剂中可使用包括选自式(20)表示的十一碳烯酸、其盐、十一碳烯酸糖酯中的至少一种化合物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂。
该外用制剂优选用于皮肤，特别是作为皮肤美白用化妆品，而且可通过已知制剂技术来制备。
该外用制剂可含有其它常用成分，例如水性组分、粉末组分、保湿剂、表面活性剂、防腐剂、增稠剂、紫外线吸收剂、香料等。
该外用制剂含有酪氨酸酶抑制有效量的十一碳烯酸、其盐、和/或十一碳烯酸糖酯，即相对于全部外用制剂的比通常为约0.001-约10重量％，优选约0.005-约5重量％，更优选约0.01-约3重量％，特别优选约0.1-约1重量％。
该外用制剂的剂型可以是如软膏剂、霜剂、乳液、搽剂、洗剂或其它剂型。
可将该外用制剂以适当的量每天一次或多次施用于诸如脸、颈、臂和手的身体部位上，上述部位容易具有或具有疤、雀斑等或可能被或已被晒黑。
基于如下发现完成了本发明，即十一碳烯酸与二糖的酯具有显著改进的酪氨酸酶抑制活性，该酯的作用机理与熊果苷的机理不同，从而提供了具有酪氨酸酶抑制活性的酪氨酸酶抑制剂。具体地说，酪氨酸酶活性催化了由一元酚到1，2-二酚(儿茶酚)的羟基化反应和由儿茶酚到邻醌的氧化反应，其中熊果苷有效抑制了一元酚的羟基化反应，而十一碳烯酸糖酯却是抑制了儿茶酚的氧化反应。也就是说，十一碳烯酸糖酯具有与熊果苷不同的酪氨酸酶抑制机理。更具体地说，熊果苷如图6所示对苯酚底物比对儿茶酚底物显示出更高的抑制活性，而十一碳烯酸糖酯如图5所示对苯酚底物和儿茶酚底物均显示出抑制活性。图9说明了上述机理。
可将具有上述活性的包括十一碳烯酸、其盐和/或酯衍生物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂有效地用于化妆品和医药领域中的外用制剂，特别是皮肤外用制剂和皮肤美白用外用制剂。
III.本发明的第三优选实施方案提供了包括抗坏血酸或其衍生物作为活性成分的酪氨酸酶活性促进剂；包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂，特别是具有改善或防止白发的显著效果的外用制剂。
本发明人发现抗坏血酸和抗坏血酸衍生物在低浓度下具有优异的酪氨酸酶活性促进效果，并进行了进一步的深入研究。
本发明包括如下的酪氨酸酶活性促进剂和包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂。
3-1.酪氨酸酶活性促进剂，包括抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分。
3-2.根据3-1项所述的酪氨酸酶活性促进剂，其中抗坏血酸衍生物为选自由抗坏血酸脂肪酸酯；抗坏血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的盐；抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；和抗坏血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的盐所组成的组中的至少一种。
3-3.包括3-1或3-2项所述酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂。
3-4.头发用外用制剂，包括3-1或3-2项所述的酪氨酸酶活性促进剂，并且优选用于防止或改善白发的外用制剂。
3-5.皮肤外用制剂，包括3-1或3-2项所述的酪氨酸酶活性促进剂，而且优选用于使皮肤变黑或治疗皮肤白斑病的外用制剂。
3-6.根据3-3至3-5中任一项所述的外用制剂，其中抗坏血酸和抗坏血酸衍生物的总含量相对于全部外用制剂为0.00001-10重量％。
3-7.根据3-3至3-5中任一项所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括抗坏血酸作为活性成分，并且其中抗坏血酸的含量相对于全部外用制剂为0.0001-1重量％。
3-8.根据3-3至3-5中任一项所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括选自由抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸葡糖苷所组成的组中的至少一种化合物作为活性成分，并且其中所述至少一种化合物的含量相对于全部外用制剂为0.001-10重量％。
3-9.根据3-3至3-5中任一项所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括选自由抗坏血酸脂肪酸酯，抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯，和抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯所组成的组中的至少一种化合物作为活性成分；并且其中所述至少一种化合物的含量相对于全部外用制剂为0.00001-0.1重量％。
本发明的第三实施方案详述如下。
本发明的酪氨酸酶活性促进剂包括抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分。在酪氨酸酶活性促进剂中，抗坏血酸和抗坏血酸衍生物可单独或组合使用。
抗坏血酸是生物体内的水溶性抗氧化剂，也称为维生素C。抗坏血酸作用于生物体内或细胞内各种部位的多种目标分子。抗坏血酸包括L-抗坏血酸和D-抗坏血酸，其中本发明使用L-抗坏血酸。
本发明所用抗坏血酸衍生物包括在其2-、3-、5-和6-羟基位具有一个或多个取代基并具有酪氨酸酶活性促进效果的那些。
抗坏血酸衍生物的具体例子包括抗坏血酸脂肪酸酯；抗坏血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的盐；抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；抗坏血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的盐；等。特别优选的是在生物体内吸收后产生抗坏血酸的那些。
对上述抗坏血酸衍生物中的脂肪酸，特别是对抗坏血酸脂肪酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯、抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯和抗坏血酸硫酸酯的脂肪酸酯中的脂肪酸的类型没有限制，包括饱和及不饱和脂肪酸以及直链和支链脂肪酸。对脂肪酸部分的碳原子数也没有限制，通常为1-24，优选8-20，更优选10-18。
抗坏血酸脂肪酸酯的例子包括使脂肪酸与抗坏血酸的2-、3-、5-和6位中的至少一个羟基反应得到的酯。上述酯的例子包括抗坏血酸-6-棕榈酸酯，抗坏血酸-2，6-棕榈酸酯，抗坏血酸-6-硬脂酸酯，等。
抗坏血酸磷酸酯的例子包括使抗坏血酸的2位羟基与磷酸酯化得到的抗坏血酸-2-磷酸酯。
抗坏血酸磷酸酯的盐的例子包括碱金属盐，碱土金属盐和其它抗坏血酸磷酸酯的盐。具体例子包括抗坏血酸-2-磷酸酯钠，抗坏血酸-2-磷酸酯镁，等。
抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的例子包括使抗坏血酸磷酸酯中的羟基与脂肪酸进一步酯化得到的化合物，例如抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸酯，抗坏血酸-2-磷酸-6-月桂酸酯，抗坏血酸-2-磷酸-6-硬脂酸酯，等。
抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐的例子包括抗坏血酸-2-磷酸酯-6-棕榈酸酯的钠盐，抗坏血酸-2-磷酸酯-6-月桂酸酯的镁盐，等。
抗坏血酸葡糖苷的例子包括抗坏血酸-2-葡糖苷，其中葡萄糖是通过糖苷键连接到抗坏血酸的2位羟基上的。
抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯的例子包括使抗坏血酸葡糖苷与脂肪酸进一步酯化得到的化合物，例如抗坏血酸-2-葡糖苷-6-棕榈酸酯，抗坏血酸-2-葡糖苷-6-硬脂酸酯，抗坏血酸-2-葡糖苷-6-月桂酸酯，等。
抗坏血酸硫酸酯的例子包括使抗坏血酸的2位羟基与硫酸酯化得到的抗坏血酸-2-硫酸酯。
抗坏血酸硫酸酯的盐的例子包括碱金属盐，碱土金属盐和其它抗坏血酸硫酸酯的盐。
抗坏血酸硫酸酯的脂肪酸酯的例子包括使抗坏血酸硫酸酯的羟基与脂肪酸进一步酯化得到的化合物，例如抗坏血酸-2-硫酸酯-6-棕榈酸酯，抗坏血酸-2-硫酸酯-6-硬脂酸酯，抗坏血酸-2-硫酸酯-6-月桂酸酯，等。
在上述化合物中，优选抗坏血酸脂肪酸酯、抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯、抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯，这是由于它们高度稳定而且具有优异的酪氨酸酶活性促进效果。
在本发明的酪氨酸酶活性促进剂中使用有效量的抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分从而得到优异的酪氨酸酶活性促进效果。
酪氨酸酶使用酪氨酸作为底物催化酪氨酸的羟基化反应和所得DOPA的氧化反应。在羟基化反应中抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物用作氢供体，从而促进了酪氨酸酶的活性。
包括抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物的酪氨酸酶活性促进剂通过经皮吸收到达头发根部并作用于黑素细胞从而显示出优异的黑素生成促进效果。
具有该机理的含抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分的酪氨酸酶活性促进剂显示出优异的黑素生成促进效果。
可通过已知方法将抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物单独或与适当的载体混合配制成制剂，得到本发明的酪氨酸酶活性促进剂。
此外，酪氨酸酶活性促进剂可用作外用制剂的成分。可通过已知方法混合酪氨酸酶活性促进剂和所需成分和/或适当的载体制备该外用制剂。
该外用制剂具有优异的酪氨酸酶活性促进效果和/或优异的黑素生成促进效果，因此可将其用作如头发或皮肤外用制剂。其也可用作治疗帕金森氏病的外用制剂，该制剂作用于诸如黑质的黑素细胞。
头发用外用制剂的具体例子包括用于防止或改善白发或者使头发成褐色的外用制剂。
头发用外用制剂的类型没有限制，可以是诸如洗发水、洗发露(hairrinse)、护发剂、卷发剂、发乳、养发剂、发胶、护发素、染发剂、增发剂等。外用制剂的形态没有限制，可以是诸如液体状、乳液状、膏状、凝胶状、固体状或其它形状。
皮肤外用制剂的具体例子包括用于治疗白斑病，或用于使皮肤呈棕褐色或黑色的外用制剂。
皮肤外用制剂的类型没有限制，可以是诸如洗液、乳液、清洁膏、营养膏、化妆底液、粉底、浴液、手霜、腿霜、洗面奶、沐浴皂、沐浴露等。外用制剂的形态没有限制，可以是诸如洗液状、液体状、膏状、凝胶状、乳液状、固体状或其它形状。
该外用制剂可含有有效提高酪氨酸酶活性促进剂效力的助剂或已知添加剂。上述助剂和添加剂包括诸如液体石蜡，凡士林和其它烃；巴西棕榈蜡，日本蜡和其它的蜡；橄榄油，荷荷芭油和其它的油或脂肪；棕榈酸十八烷醇酯，新戊二醇二异辛酸酯和其它酯；硬脂酸，棕榈酸和其它高级脂肪酸；十六烷醇，十八烷醇和其它高级醇；非离子型、阴离子型、阳离子型和两性表面活性剂；天然和合成香料及色料；对羟基苯甲酸酯，葡萄糖酸氯己定和其它防腐剂；维生素E，维生素P和其它维生素；BHT和其它抗氧化剂；苯甲酮，氨基苯甲酸和其它紫外线吸收剂；乙醇，丙醇和其它醇；柠檬酸盐，乙酸盐和其它pH调节剂；适用于本制剂目的应用的药用成分；等。
该外用制剂含有酪氨酸酶活性促进有效量的酪氨酸酶活性促进剂，用量可根据使用方式和成分类型而适当调节。
当将该外用制剂用于头发时，酪氨酸酶活性促进剂的含量相对于全部外用制剂优选为约0.00001-约10重量％，优选约0.0001-约0.1重量％。当将该外用制剂用于皮肤时，酪氨酸酶活性促进剂的含量相对于全部外用制剂为约0.00001-约10重量％，优选约0.0001-约0.1重量％。
当酪氨酸酶活性促进剂包括抗坏血酸作为活性成分时，抗坏血酸的含量相对于全部外用制剂为约0.0001-约1重量％，优选约0.001-约1重量％，更优选约0.01-约1重量％，进一步优选约0.1-约1重量％。抗坏血酸几乎不通过皮肤吸收，因此为将细胞内抗坏血酸浓度调节至据信为有效量的10-4M或更低，适当的抗坏血酸浓度大概占该全部组合物(酪氨酸酶活性促进剂)的约0.0001-约1重量％。
当酪氨酸酶活性促进剂包括选自抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸葡糖苷中的至少一种化合物作为活性成分时，所述至少一种化合物相对于全部外用制剂为约0.001-约10重量％，优选约0.01-约10重量％，更优选约0.01-约1重量％，进一步优选约0.1-约1重量％。抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸葡糖苷比抗坏血酸具有更高的稳定性，而且与抗坏血酸相比具有改进的皮肤渗透性和/或皮肤吸收性。因此，为将细胞内抗坏血酸磷酸酯/抗坏血酸葡糖苷浓度调节至据信为显著活化效果的有效量的10-2M至10-4M，适当的抗坏血酸磷酸酯/抗坏血酸葡糖苷浓度大概占全部组合物(酪氨酸酶活性促进剂)的约0.001-约10重量％。
当酪氨酸酶活性促进剂包括选自抗坏血酸脂肪酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯和抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯中的至少一种化合物作为活性成分时，所述至少一种化合物相对于全部外用制剂为约0.00001-约0.1重量％，优选约0.0001-约0.1重量％，更优选约0.001-0.1重量％，进一步优选约0.01-0.1重量％。抗坏血酸脂肪酸酯和抗坏血酸衍生物是高度稳定的而且具有相当高的皮肤渗透性。因此，为将细胞内抗坏血酸脂肪酸酯/抗坏血酸衍生物浓度调节至据信为有效量的10-4M或更低，适当的抗坏血酸脂肪酸酯/抗坏血酸衍生物浓度大概占全部组合物(酪氨酸酶活性促进剂)的约0.00001-约0.1重量％。
本发明提供了使用抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分的具有优异酪氨酸酶活性促进活性或优异的黑素生成促进活性的酪氨酸酶活性促进剂和外用制剂，其中抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物具有很高的安全性并能够低成本生产。
目前抗坏血酸和抗坏血酸衍生物已用作黑素生成抑制剂，但本发明人发现抗坏血酸和抗坏血酸衍生物可用作酪氨酸酶活性促进剂和酪氨酸酶活性促进制剂及外用制剂的活性成分。
本发明的酪氨酸酶活性促进剂是高度安全的，并能够以低成本的生产，而且显示出优异的酪氨酸酶活化效果和黑素生成促进效果。此外，包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂也显示出优异的酪氨酸酶活化效果和黑素生成促进效果。
可将该酪氨酸酶活性促进剂和包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂有效地用于化妆品、医药和其它领域以促进酪氨酸酶活性或黑素生成。例如，可将它们用作头发用外用制剂以防止或改善白发，或作为皮肤外用制剂以使皮肤变黑或治疗皮肤白斑病。
IV.本发明的第四优选实施方案提供了在能够溶解糖类和核苷的溶剂中用酶制备酯的方法。
本发明人发现在非质子有机溶剂中Candida antarctica由来的A型脂肪酶具有很高的活性。本发明人进一步发现使用蔗糖作为底物能够使反应具有特别的选择性，并在上述发现的基础上进行了深入研究。
本发明也提供了如下制备酯的方法。
4-1.制备酯的方法，包括在非质子有机溶剂中、在Candidaantarctica由来的A型脂肪酶存在下用脂肪酸和/或其衍生物酯化含羟基化合物。
4-2.根据4-1项所述的方法，其中非质子有机溶剂选自由二甲基甲酰胺，二甲亚砜，二甲基甲酰胺与二甲亚砜的混合物所组成的组。
4-3.根据4-1或4-2项所述的方法，其中含羟基化合物选自由糖类、核苷类、糖醇类和含羟基氨基酸所组成的组中的至少一种。
4-4.根据4-3项的方法，其中含羟基化合物是糖类。
4-5.根据4-1项的方法，其中含羟基化合物是蔗糖，并且其中酯是式(21)表示的化合物式(21)
其中，Rc为C1-24脂肪酸残基。
本发明的第四实施方案详述如下。
根据本发明第四实施方案制备酯的方法包括在非质子有机溶剂中在Candida antarctica由来的A型脂肪酶的存在下用脂肪酸和/或其衍生物酯化含羟基化合物。
本实施方案所用“酯化”是指酯的合成，包括酯化反应和酯交换反应。具体地说，酯化包括羧酸与醇的反应(R′-COOH+R″-OH R′-COO-R″)；和酯与醇的反应(R′-COO-R″+R-OH R′-COO-R)。
脂肪酶在本发明方法中，使用Candida antarctica由来的A型脂肪酶作为酶催化剂。
Candida antarctica由来的脂肪酶被分为A型和B型。本发明人发现A型脂肪酶是在非质子有机溶剂中具有很高活性的优异酶催化剂。
根据本发明，即使使用几乎不溶于有机溶剂的含羟基化合物作为底物进行反应时，也能以高收率得到产品。
A型脂肪酶可由发酵后的脂肪酶通过诸如凝胶过滤获得。或者，通过重组DNA技术由基因编码A型脂肪酶制备A型脂肪酶。A型脂肪酶的用量相对于溶剂和脂肪酶的总量为约0.1-约20重量％，优选约0.1-约10重量％。
可以适当地选择使用A型脂肪酶的反应温度，其通常为约10-约100℃，优选约30-约50℃。
非质子有机溶剂本发明方法在非质子有机溶剂中进行。
该非质子有机溶剂的类型没有限制，可以是诸如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基异丙酰胺、甲酰胺、二甲亚砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二丙亚砜或其混合溶剂。
在上述溶剂中，二甲基甲酰胺、二甲亚砜和其混合溶剂能得到高的收率，因此是优选的。特别优选二甲亚砜。各溶剂在混合溶剂中的比可以适当选择，但该混合溶剂优选含至少60％，更优选至少80％的二甲亚砜。
含羟基化合物本发明所用的含羟基化合物没有限制，只要它含有至少一个羟基。该化合物的例子包括糖类，核苷类，糖醇类，含羟基氨基酸，等。
糖类的例子包括天然糖和合成糖，例如单糖、寡糖、多糖和其水解产物，等。也可使用上述糖类的取代产物和衍生物，例如氨基糖、硫糖、糖醛酸、等。此外，也可使用其溶剂化物。
单糖的例子包括葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，抗坏血酸，和其它的C2-8，优选C5-7化合物。
寡糖的例子包括海藻糖及其二水合物；蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖和其它二糖；蜜三糖和其它三糖；甘露寡糖，麦芽寡糖，和其它寡糖；等。
多糖的例子包括纤维素，淀粉，壳多糖，壳聚糖，透明质酸，甘露聚糖，木聚糖，支链淀粉，等。
在上述糖中，优选单糖和寡糖，其中特别优选二糖。具体地说，优选葡萄糖、海藻糖和蔗糖，特别优选蔗糖。
核苷类的例子包括其中脱氧核糖或核糖与腺苷，鸟苷，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶连接的化合物，和上述化合物的衍生物。
糖醇类的例子包括丙三醇，赤藻糖醇，阿糖醇，木糖醇，山梨糖醇，甘露醇，纤维醇，等。
含羟基氨基酸的例子包括丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，等。
反应溶剂中含羟基化合物的浓度为约0.01M至约1M，优选约0.1M至约0.5M。
脂肪酸或其衍生物可以适当选择本发明所用脂肪酸或其衍生物的类型。
脂肪酸的例子包括饱和或不饱和脂族单羧酸，二羧酸和分子中具有3个或更多个羧基的多羧酸。脂肪酸中合适的碳原子数通常为1至24，优选6至18。
脂族单羧酸的例子包括己酸，山梨酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈油酸，棕榈酸，硬脂酸，异硬脂酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，十五烷酸，二十烷酸，二十二烷酸，decosenoic acid，花生四烯酸，蓖麻油酸，二羟基硬脂酸，等。在上述单酸中，优选棕榈酸、硬脂酸、己酸、辛酸和月桂酸。
二羧酸的例子包括己二酸，癸二酸等。在上述二酸中，优选饱和或不饱和脂族二羧酸，特别是己二酸，这是因为可通过将上述二羧酸转变成二乙烯酯得到可聚合单体。
脂肪酸衍生物的例子包括使上述脂肪酸与醇、脂肪酸的酸酐等反应得到的脂肪酸酯。脂肪酸酯的例子包括脂肪酸的乙烯酯，低级烷基酯，卤代低级烷基酯等。在上述酯中，优选乙烯酯，这是由于乙烯基在酯交换反应中可用作优异的离去基团。
如本文所用，“低级烷基”是指C1-6直链或支链烷基，“卤代低级烷基”是指用至少一个卤(例如，氟、氯或溴)原子取代的低级烷基。脂肪酸衍生物的具体例子包括上述脂肪酸的乙烯酯，甲酯，乙酯，三氟乙酯和三氯乙酯，以及己二酸和癸二酸的二乙烯酯。
从反应性的角度来看，特别优选己酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，豆蔻酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯，硬脂酸乙烯酯，十一酸乙烯酯，油酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯。
上述脂肪酸及其衍生物可单独或组合使用。此外，上述脂肪酸及其衍生物可以被羟基、羰基、苯基、卤原子和/或其它取代基取代。
脂肪酸及其衍生物的浓度可以适当地选择，通常相对于每摩尔含羟基化合物为约1-10mol，优选约1.2-约4mol。
蔗糖酯当在本发明制备酯的方法中使用蔗糖作含羟基化合物时，得到蔗糖2位上的仲羟基被选择性酯化的化合物。
具体地说，当在非质子有机溶剂中在Candida antarctica由来的A型脂肪酶存在下用脂肪酸或其衍生物酯化蔗糖时，得到下式的化合物 其中，Rc为C1-24脂肪酸残基。
可从上述溶剂中适当地选择非质子有机溶剂，其中优选二甲基甲酰胺，二甲亚砜和其混合物，更优选二甲亚砜。
可从上述和其它脂肪酸及其衍生物中适当地选择需要的脂肪酸及其衍生物。从反应性的角度来看，特别优选己二酸二乙烯酯，己酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯。
实践中所用蔗糖酯是通过使用化学催化剂的方法制备的并且为单-、二-和三酯的混合物。而且，在上述蔗糖酯中，蔗糖1′-、6-和6′-位上的伯羟基被脂肪酸酯取代。因此，蔗糖酯具有低的亲水性，并不能充分溶于水或在水中乳化。相比之下，根据本发明可以高收率地得到2位羟基被选择性酯化的单酯。此外，无需复杂步骤即可得到仅2位的仲羟基被选择性酯化的高纯度蔗糖酯。
可将由本发明方法得到的2位羟基被选择性酯化的蔗糖酯有利地用作食品、化妆品、洗发水、护发素、医药、农药、清洁剂和其它领域中的乳化剂、表面活性剂等。
即使在使用高水溶性化合物作为起始原料时，本发明方法也能有效地制备酯。具体地说，本发明方法可有利地用于制备难以合成的酯和需要用酶选择性反应制备的酯。
图1是表示利用各种浓度的分子筛制备熊果苷酯时熊果苷转化率(反应率)随时间变化的测量结果的曲线图。该分析是利用HPLC进行的。
图2表示利用各种浓度的分子筛制备熊果苷酯时熊果苷转化率(反应率)随时间变化的测量结果的曲线图。该分析是利用HPLC进行的。
图3是表示熊果苷和实施例1中所得熊果苷酯化合物对得自蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性的评价结果的曲线图。
图4是表示熊果苷和实施例1中所得熊果苷酯化合物对小鼠黑素瘤细胞黑素生成抑制效果的评价结果的曲线图。
图5是表示实施例2-1和2-4中分别用焦儿茶酚和苯酚作为底物时十一碳烯酸海藻糖酯的酪氨酸酶抑制活性的测量结果的曲线图。“-ο-儿茶酚”表示用儿茶酚作为底物的测量结果，而“-·-苯酚”表示用苯酚作为底物的测量结果。
图6是表示比较例2-1和2-3中分别用儿茶酚和苯酚作为底物时熊果苷的酪氨酸酶抑制活性的测量结果的曲线图。“-ο-儿茶酚”表示用儿茶酚作为底物的测量结果，而“-·-苯酚”表示用苯酚作为底物的测量结果。
图7是表示实施例2-1和2-3以及比较例2-2的结果的曲线图，其中用儿茶酚作为底物测量酪氨酸酶抑制活性。
图8是表示实施例2-5和比较例2-4的结果的曲线图，其中用苯酚作为底物测量酪氨酸酶抑制活性。
图9是图示说明熊果苷和十一碳烯酸的酪氨酸酶抑制活性的图。熊果苷主要抑制单酚的羟基化反应，而十一碳烯酸则抑制儿茶酚的氧化反应。
图10是表示抗坏血酸和抗坏血酸衍生物的酪氨酸酶活性促进率的图表。
图11是表示反应的酯变换率的一组曲线图，该反应是通过向0.25M蔗糖和1M己二酸二乙烯酯的DMF或DMSO溶液中加入Candidaantarctica由来的A型脂肪酶(CAL-A)或Candida antarctica由来的B型脂肪酶(CAL-B)并将混合物在40℃保持24小时进行的。“ο”表示用A型脂肪酶的反应变换率，而“·”表示用B型脂肪酶的反应变换率。
图12-A是表示反应的蔗糖酯变换率的曲线图，该反应是通过向0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由DMF和DMSO以各种比组成的混合溶剂中加入Candida antarctica由来的A型脂肪酶(CAL-A)，然后在30℃搅拌24小时进行的。图12-B是表示反应的蔗糖酯变换率的曲线图，该反应是通过向0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由DMF和DMSO以各种比组成的混合溶剂中加入Candida antarctica由来的B型脂肪酶(CAL-B)，然后在30℃搅拌7天进行的。
图13是表示反应的酯变换率的曲线图，该反应是通过向0.25M麦芽糖和1M己二酸二乙烯酯在二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)的溶液中加入10mg/ml的Candidaantarctica由来的A型脂肪酶(CAL-A)，然后在40℃搅拌24小时进行的。
本发明的最佳实施方式以下实施例和比较例是为了进一步详细说明本发明，而决不是限制本发明的范围。
实施例1-1将枯草芽孢杆菌由来的蛋白酶(0.5g，由Nagase ChemteX公司制造)加入到72.6ml含6.8g熊果苷、21g 10-十一碳烯酸乙烯酯和3.8g水的二甲基甲酰胺溶液中，然后在30℃和130rpm的条件下搅拌1周。转化率为80％。产品的TLC分析表明基本上仅形成单酯。将酶催化反应混合物过滤以去除酶粉末，然后将滤液减压浓缩去除DMF。将该浓缩液加入到填充有100g硅胶的柱中并用8∶1的氯仿和乙醇洗脱。收集产品并浓缩得到6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷的晶体。收率为62％。13C-NMRδ101.6(C1)，76.4(C2)，73.2(C3)，70.1(C4)，73.7(C5)，63.4(C6)，115.5，117.7，150.2152.4(苯酚)，172.8(C＝O)，114.6，138.9(CH＝CH2)，24.4，28.3，28.5，28.7，33.2，33.6(CH2)。元素分析计算值为C23H34O8C，63.01；H，7.76，测量值C，63.16；H，7.75。
用类似方法使各种脂族羧酸乙烯酯与熊果苷在枯草芽孢杆菌由来的蛋白酶存在下反应。结果如表1-1所示。
表1-1使用枯草芽孢杆菌由来的蛋白酶的熊果苷酯合成
实施例1-2将熊果苷(2.8g)和己二酸二乙烯酯(9.5g)溶解在40.5ml吡啶中并加入5g链霉菌属由来的碱性蛋白酶(由Toyobo Co.Ltd.制造)，然后在30℃和130rpm的条件下搅拌4天。产品的TLC分析表明仅有单酯形成。将酶催化反应混合物过滤以去除酶粉末，然后将滤液减压浓缩以去除吡啶。将该浓缩液加入到填充有100g硅胶的柱中并用4∶1的己烷∶乙酸乙酯洗脱。收集产品并浓缩得到6-O-(乙烯基己二酰基)熊果苷的晶体。分离收率为85％。H-NMRδ1.556(4H，m，-CH2CH2-)，2.320(2H，m，-COCH2-)，2.430(2H，t，-CH2CO-)，3.12-3.29(3H，m，H-2，3，4)，3.508(1H，m，H-5)，4.070(1H，q，H-6)，4.310(1H，dd，H-6)，4.640(1H，dd，＝CH2)，4.675(1H，d，H-1)，4.900(1H，dd，＝CH2)，5.11-5.32(3H，m，OH-2，3，4)，6.66(2H，m，Φ)，6.83(2H，m，Φ)，7.21(1H，q，-CH＝)。
此外，在其它与上面相同的条件下在DMF，DMSO或N-甲基-2-吡咯烷酮中进行反应。作为起始原料的熊果苷迅速酯化，TLC分析检测到在上述溶剂中单酯是主要产物。但是与在吡啶中不同，也产生了二酯、三酯和四酯。
实施例1-3将1g 4-吡咯烷吡啶(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.制造)加入到76.2ml含6.8g熊果苷和21g 10-十一碳烯酸乙烯酯的DMF溶液中，然后在80℃和130rpm的条件下搅拌24小时。产品的TLC分析表明产生了单酯、二酯、三酯和多酯。将反应混合物减压浓缩以去除DMF，然后加入到填充有100g硅胶的柱中，并用8∶1的氯仿∶甲醇洗脱。收集所制得的单酯并浓缩得到6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷的晶体。收率为10％。13C-NMRδ101.6(C1)，76.4(C2)，73.2(C3)，70.1(C4)，73.7(C5)，63.4(C6)，115.5，117.7，150.2152.4(苯酚)，172.8(C＝O)，114.6，138.9(CH＝CH2)，24.4，28.3，28.5，28.7，33.2，33.6(CH2)。元素分析计算值C23H34O8C，63.01；H，7.76，测量值C，63.06；H，7.81。
用类似方法使各种脂族羧酸乙烯酯与熊果苷在4-吡咯烷吡啶的存在下反应。结果如表1-2所示。
表1-2使用4-吡咯烷吡啶的熊果苷酯的合成
实施例1-4将熊果苷(0.3g)和己二酸二乙烯酯(1g)溶解在4ml DMF中并向其中加入10mg二甲基氨基吡啶，然后在80℃搅拌3小时。产物的TLC分析表明形成了单酯、二酯、三酯和四酯。将反应混合物减压浓缩以去除DMF。然后加入到填充有100g硅胶的柱中并用8∶1的氯仿∶甲醇洗脱。收集单酯并浓缩得到6-O-(乙烯基己二酰基)熊果苷的晶体。收率为21％。
实施例1-5将熊果苷(327mg)和10-十一碳烯酸(885mg)溶解在锥形烧瓶中的4.0ml 1，4-二噁烷/DMSO(＝9∶1)混合溶剂中。在加入0.4g的4A活化分子筛后加入40mg Candida anterctica由来的固定化脂肪酶(由Novozymes制造)，然后在40℃和130rpm的条件下搅拌1周。通过使用微波炉的简单方法将分子筛活化。具体地说，将4A分子筛置于已在微波炉中加热1分钟的烧瓶中，然后立即使用真空泵减压冷却至室温；该方法进行三次。酶催化反应产物的TLC分析表明仅有单酯产生。将该酶催化反应混合物过滤以去除酶和分子筛，然后将滤液减压浓缩。向浓缩液中加入甲醇(4ml)和水(2.5ml)后再加入己烷(5ml)以将未反应的十一碳烯酸萃取到己烷层。该己烷萃取进行6次，然后使用蒸发器浓缩水层。向浓缩液中加入8ml水以形成白色沉淀，然后通过离心分离去除上清液。进行3次上述水萃取以去除DMSO和未反应的熊果苷。收集白色沉淀并减压干燥，得到287g粉末。
用100％乙酸乙酯精制后产物的TLC分析证实未反应的10-十一碳烯酸已被去除且只有单酯化合物形成。对精制后的产物进行NMR分析，发现其与实施例1-1中得到的酯化合物相同，即6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷。
酯的收率为91％。本实施例所用方法未使用硅胶柱精制，因此简单易行。
实施例1-6将熊果苷(33mg)和10-十一碳烯酸(89mg)溶解在锥形烧瓶中的4.0ml 1，4-二噁烷中。在加入0-15重量％的4A活化分子筛后加入40mg Candida anterctica由来的固定化脂肪酶(由Novozymes制造)，然后在40℃和130rpm的条件下搅拌1周。该分子筛已用与实施例1-5相同的方法活化。通过HPLC分析检测熊果苷转化率随时间的变化。HPLC分析的条件如下设备Shimazu LC-10，柱TSK gel Amide-80，流动相溶剂乙腈/水(＝90∶10)，流速1.0ml，检测示差折射。
结果如图1所示。用作脱水剂的分子筛的加入显著提高了熊果苷的转化率(反应率)。分子筛浓度越高，则转化率越高。
实施例1-7使用与实施例1-6相同的方法进行酶催化反应，除了熊果苷的用量为55mg至872mg(0.05M至0.8M)和所用10-十一碳烯酸的摩尔数是熊果苷的4倍之外。通过HPLC分析测量熊果苷转化率随时间的变化。结果如图2所示。熊果苷浓度越高，则反应率越高。然而，熊果苷浓度高于0.6M时不会进一步提高反应率。
评价1利用脯氨酸评价酪氨酸酶抑制活性通过使用脯氨酸的方法(Analytical Biochemiatry，179，375-381，1989)测量本发明熊果苷酯化合物的酪氨酸酶抑制活性。将40μl的溶解在pH 7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的0.794M L-脯氨酸，40μl的0.037M 1，2-二羟基苯和1.41ml实施例1-1所得的6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷的各种浓度溶液之一在吸光度测量用试管中搅拌。加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，然后在525nm下搅拌10秒检测吸光度随时间的变化。除了使用熊果苷代替6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷外，重复上述步骤。结果如图3所示。
图3表明通过酯化熊果苷6位碳上的羟基得到的化合物比未酯化熊果苷具有显著改进的酪氨酸酶抑制活性。
评价2利用小鼠黑素瘤细胞评价黑素生成抑制效果将小鼠黑素瘤B16细胞(3.6×105)加入到含15ml的补充有10％FCS的D-MEM培养基的75cm2培养瓶中，在含5％二氧化碳的气体中于37℃培养过夜以使细胞粘连。将培养基换成15ml的含熊果苷的0.1％DMSO溶液或含实施例1-1所得6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷的的0.1％DMSO溶液之一的补充有10％FCS的D-MEM培养基。在相同条件下继续培养两天后，再次将培养基换成15ml含0.1％DMSO溶液的培养基并在相同条件下继续培养两天。培养后，回收细胞并测量细胞的湿重。在测量细胞湿重后，将细胞小粒悬浮于总体积为700μl的MilliQ水中。对细胞悬浮液超声粉碎15分钟，然后与700μl的6N氢氧化钠水溶液混合以完全溶解细胞并提取黑色素。然后测量在405nm处的吸光度。以405nm处的吸光度/细胞湿重(μg)表示每个细胞产生的黑色素。将未加入熊果苷或熊果苷十一碳烯酸酯时每个细胞产生的黑色素看作100％，测量在各种浓度下熊果苷十一碳烯酸酯或熊果苷的黑素生成抑制效果。结果如图4所示。
图4表明当用黑素瘤细胞测试时熊果苷十一碳烯酸酯的黑素生成抑制效果比熊果苷高约100倍。
实施例2-1用脯氨酸(Analytical Biochemiatry，179，375-381，1989)测量十一碳烯酸糖酯的酪氨酸酶抑制活性。具体地说，将溶解在pH 7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的0.749M L-脯氨酸(40μl)，0.037M焦儿茶酚和1.41ml的各种浓度之一的海藻糖十一碳烯酸酯(Tre-Unde)溶液(40μl)在吸光度测量用试管中搅拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下搅拌3分钟后测量吸光度的变化，证实对酪氨酸酶的抑制。结果如图5所示。
实施例2-2用与实施例2-1相同的方法测试十一碳烯酸(Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并证实其抑制了酪氨酸酶活性。结果如图7所示。
实施例2-3用与实施例2-1相同的方法测试蔗糖十一碳烯酸酯(Suc-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并证实其抑制了酪氨酸酶活性。结果如图7所示。
比较例2-1用与实施例2-1相同的方法并使用焦儿茶酚作为底物测试熊果苷的酪氨酸酶抑制活性，并证实其抑制了酪氨酸酶活性。结果如图6所示。
比较例2-2用与实施例2-1相同的方法测试海藻糖二(十一碳烯酸)酯(Tre-di-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并证实其没有抑制酪氨酸酶活性。结果如图7所示。
实施例2-4通过使用焦儿茶酚的改进方法，利用苯酚作为底物检测十一碳烯酸糖酯的酪氨酸酶抑制活性。具体地说，将40μl溶解在pH 7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的0.749M L-脯氨酸，40μl 0.037M苯酚和1.41ml的各种浓度的海藻糖十一碳烯酸酯(Tre-Unde)的溶液在测量吸光度用试管中搅拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(衍生自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下搅拌15分钟测量吸光度的变化，结果证实吸光度的增加被抑制，即酪氨酸酶被抑制。结果如图5所示。
实施例2-5用与实施例2-4相同的方法测试蔗糖十一碳烯酸酯(Suc-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，结果证实其抑制了酪氨酸酶活性。结果如图8所示。
比较例2-3用与实施例2-4相同的方法测试熊果苷的酪氨酸酶抑制活性，结果证实其抑制了酪氨酸酶活性。结果如图6所示。
比较例2-4用与实施例2-4相同的方法测试海藻糖油酸酯(Tre-Ole)的酪氨酸酶抑制活性，结果证实其没有抑制酪氨酸酶活性。结果如图8所示。
实施例3-1在脯氨酸的存在下用苯酚作为底物，使用抗坏血酸和抗坏血酸衍生物作为测量酪氨酸酶活性促进作用的被测物质。
苯酚是被酪氨酸酶羟基化的，此时需要氢供体。所得焦儿茶酚被酪氨酸酶氧化形成邻醌。在脯氨酸的存在下定量测量所形成的邻醌的量以测定酪氨酸酶活性。
具体地说，该测量是如下进行的。将40μl溶解在pH 7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的0.749M L-脯氨酸，40μl的0.037M苯酚和1.41ml各种浓度的被测物质的溶液之一在测量吸光度用试管中搅拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下搅拌15分钟测量吸光度的变化以测定酪氨酸酶活性。
酪氨酸酶活性促进率是以受抑制或促进的酪氨酸酶活性相对于未加入被测物质时显示的酪氨酸酶活性的百分比来表示的。100％的酪氨酸酶活性促进率表示酪氨酸酶活性比未加入被测物质时的活性提高了2倍。
在被测物质中，抗坏血酸是L-抗坏血酸(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number016-04805)，抗坏血酸衍生物是下式表示的抗坏血酸-2-葡糖苷(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number074-04581)、抗坏血酸-2-磷酸酯[抗坏血酸磷酸酯镁盐(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number013-12061)]、和抗坏血酸-6-棕榈酸酯(Wako PureChemical Ind.Ltd.，Number011-13662)。
图10表示测量结果。
如图10所示，抗坏血酸在10-3M至10-1M的浓度下表现出酪氨酸酶抑制活性，而在10-4M和更低的浓度下显示出酪氨酸酶活性促进作用。
抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸脂肪酸酯在10-4M和更低的浓度下显示出酪氨酸酶活性促进作用。
抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸葡糖苷在10-2M至10-4M浓度下表现出酪氨酸酶活性促进作用。
实施例4-1将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)加入到0.25M蔗糖和1M己二酸二乙烯酯的二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)溶液中至浓度为10mg/ml，然后在40℃反应24小时以测定酯转化率。反应混合物的HPLC分析证实蔗糖已基本定量地转化为酯。HPLC的分析条件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脱液乙腈/水(3/1)检测示差折射比较例4-1除了使用Candia anterctica由来的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyoCAL-B)代替Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)之外，重复实施例4-1的步骤以测定酯变换率。
图11表示实施例4-1和比较例4-1的酯变换率。图11表明在DMF和DMSO中，A型脂肪酶比B型脂肪酶的活性高。特别是在DMSO中活性非常的高。
实施例4-2将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyo)(10mg/ml)加入到0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由各种比的DMF和DMSO组成的混合物中，然后在30℃反应24小时以测定蔗糖酯变换率。反应混合物的HPLC分析证实蔗糖已基本定量地转化为酯。HPLC的分析条件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脱液乙腈/水(3/1)检测示差折射比较例4-2将Candia anterctica由来的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyo)(10mg/ml)加入到0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由各种比的DMF和DMSO组成的混合物中，然后在30℃搅拌7天以测定蔗糖酯变换率。反应混合物的HPLC分析证实蔗糖已基本定量地转化为酯。HPLC的分析条件与实施例4-2相同。
图12表示实施例4-2和比较例4-2的酯变换率。图12表明在DMF和DMSO的混合溶剂中A型脂肪酶(CAL-A)比B型脂肪酶(CAL-B)的活性高。特别是混合溶剂的DMSO比越高，则A型脂肪酶所表现出的活性就越高。
实施例4-3将麦芽糖(0.25M)和己二酸二乙烯酯(1M)溶解在二甲基甲酰胺、二甲亚砜或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中并加入10mg/ml Candiaanterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)，然后在40℃搅拌24小时以测定酯变换率。反应混合物的HPLC分析证实麦芽糖已基本定量地转化为酯。HPLC的分析条件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脱液乙腈/水(3/1)检测示差折射比较例4-3除了使用Candia anterctica由来的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyoCAL-B)代替Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)之外，重复实施例4-3的步骤以测定酯变换率。
图13表示实施例4-3和比较例4-3的酯变换率。图13表明当使用麦芽糖时，A型脂肪酶与B型脂肪酶不同，A型脂肪酶在各种非质子有机溶剂中均表现出显著的活性。
实施例4-4将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)悬浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和10.7g(0.5M)己酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。将该酶催化反应混合物在30℃和130rpm的条件下搅拌24小时。在与实施例4-1相同的条件下进行反应混合物的HPLC分析，结果证实蔗糖已基本定量地转化为酯。
反应混合物的TLC分析证实仅有一种反应产物形成。从反应混合物中过滤出不溶物并利用蒸发器减压浓缩滤液，然后将浓缩液加入到硅胶柱(氯仿∶甲醇＝12∶1)中以分离和精制酯从而得到6.5g白色晶体(收率79％)。13C NMR分析证实已经形成了在蔗糖2位引入己酸残基的蔗糖2-己酸酯。13C NMR(DMSOd6)δ88.70(C1)，72.99(C2)，70.05(C3)，69.83(C4)，72.56(C5)，60.31(C6)，61.14(C1′)，104.23(C2′)，75.3(C3′)，82.63(C4′)，73.75(C5′)，62.32(C6′)实施例4-5将Candia anterctica由来的A型脂肪酶Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)悬浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和12.8g(0.5M)辛酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。将该酶催化反应混合物在30℃和130rpm的条件下搅拌24小时。在与实施例4-1相同的条件下进行反应混合物的HPLC分析，结果证实蔗糖已基本定量地转化为酯。从反应混合物中过滤出不溶物并将滤液浓缩，然后将浓缩液在填充有100g硅胶的柱中用氯仿∶甲醇(12∶1，v/v)洗脱得到6.8g白色晶体(收率68％)。13C NMR分析证实形成了在蔗糖2位引入辛酸残基的蔗糖2-辛酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.71(C1)，72.96(C2)，70.05(C3)，69.85(C4)，72.55(C5)，60.35(C6)，61.13(C1′)，104.25(C2′)，75.27(C3′)，82.62(C4′)，73.80(C5′)，62.39(C6′)实施例4-6将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)悬浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和15g(0.5M)癸酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。将该酶催化反应混合物在30℃和130rpm的条件下搅拌3天。在与实施例4-1相同的条件下进行反应混合物的HPLC分析，结果证实蔗糖已基本定量地转化为酯。用与实施例4-5相同的方法分离产物，得到6.0g白色晶体(收率64％)。13C NMR分析证实形成了在蔗糖2位引入癸酸残基的蔗糖2-癸酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.72(C1)，72.94(C2)，70.07(C3)，69.86(C4)，72.53(C5)，60.34(C6)，61.21(C1′)，104.30(C2′)，75.27(C3′)，82.59(C4′)，实施例4-7将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)悬浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和17g(0.5M)月桂酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。将该酶催化反应混合物在30℃和130rpm的条件下搅拌3天。在与实施例4-1相同的条件下进行反应混合物的HPLC分析，结果证实蔗糖已基本定量地转化为酯。用与实施例4-5相同的方法分离产物，得到6.9g白色晶体(收率70％)。13C NMR分析证实形成了在蔗糖2位引入月桂酸残基的蔗糖2-月桂酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.80(C1)，72.95(C2)，70.10(C3)，69.88(C4)，72.55(C5)，60.33(C6)，61.19(C1′)，104.30(C2′)，75.31(C3′)，82.62(C4′)，73.83(C5′)，62.35(C6′)实施例4-8将Candia anterctica由来的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(250mg)悬浮在25ml的2.14g(0.25M)蔗糖和5g(1M)己二酸二乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。将该酶催化反应混合物在30℃和130rpm的条件下搅拌2天。在与实施例4-1相同的条件下进行反应混合物的HPLC分析，结果证实蔗糖已基本定量地转化为酯。用与实施例4-5相同的方法分离产物，得到2.6g白色晶体(收率81％)。13C NMR分析证实形成了在蔗糖2位引入己二酸乙烯酯残基的蔗糖2-己二酸乙烯酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.70(C1)，72.99(C2)，70.05(C3)，69.83(C4)，72.56(C5)，60.31(C6)，61.14(C1′)，104.28(C2′)，75.30(C3′)，82.63(C4′)，73.75(C5′)，62.32(C6′)，23.49，32.76，33.18(-CH2-)，98.12，141.26(-C＝C-)，170.33，172.62(-C＝O)比较例4-4除了使用爪哇毛霉(Mucor javanicus)由来的脂肪酶(脂肪酶M)、黑色曲霉(Aspergillus niger)由来的脂肪酶(脂肪酶A′)或Candidacylindracea由来的脂肪酶(脂肪酶AY)代替Candia antarctica由来的脂肪酶(脂肪酶A)之外，重复实施例4-8的步骤以测定蔗糖酯变换率。
表4-1表示使用在实施例4-8和比较例4-4中的各种酶转变成蔗糖2-己二酸乙烯酯的变换率。
表4-1
如表4-1所示，Candia anterctica由来的A型脂肪酶比得自其它微生物的脂肪酶具有显著高的变换率。
工业实用性本发明提供了包括具有酪氨酸酶抑制或促进活性的化合物作为活性成分的酪氨酸酶活性调整剂，以及包括该该调整剂的外用制剂。本发明还提供了制备该化合物的方法。
具体地说，本发明提供了具有酪氨酸酶抑制活性的新型熊果苷酯化合物，包括该化合物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂，以及包括该抑制剂的外用制剂。
此外，本发明还提供了包括十一碳烯酸、其盐和/或其酯衍生物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂，和包括该酪氨酸酶抑制剂的外用制剂。
此外，本发明还提供了包括抗坏血酸和/或其衍生物作为活性成分的酪氨酸酶活性促进剂，和包括该酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂。
本发明也提供了用酶制备酯的方法，该方法适用于制备酪氨酸酶抑制剂或促进剂。
本发明的新型熊果苷酯化合物由于在熊果苷的6位羟基引入了疏水基而具有比熊果苷更高的酪氨酸酶抑制活性。疏水基的引入也改进了该化合物的皮肤吸收性。而且，该化合物具有大概基于糖酯结构的抗多种微生物的抗菌作用；大概由于其酚羟基的自由基消除性能；和大概基于酯部分的疏水性和熊果苷部分的亲水性的表面活性作用。
包括该化合物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂和包括该抑制剂的外用制剂显示出显著的酪氨酸酶抑制效果，并因此可将其有效地用于皮肤外用制剂、皮肤美白用化妆品和化妆品及医药领域中的添加剂等。
本发明的一个实施方案是基于以下发现十一碳烯酸和二糖的酯通过与熊果苷不同的作用机理极大抑制了酪氨酸酶活性。具体地说，酪氨酸酶催化了由一元酚到1，2-二酚(儿茶酚)的羟基化反应和由儿茶酚到邻醌的氧化反应，而熊果苷有效抑制了一元酚的羟基化反应，而十一碳烯酸、其盐和其酯衍生物抑制了儿茶酚的氧化反应。
特别是十一碳烯酸的酯衍生物由于引入了疏水基而改进了皮肤吸收性。此外，该酯衍生物具有大概由于十一碳烯酸基团的抗多种微生物的抗菌作用，以及大概由于酯部分的疏水性和熊果苷部分的亲水性的表面活性作用。
包括具有上述性能的十一碳烯酸、其盐和/或其酯衍生物作为活性成分的酪氨酸酶抑制剂和包括该抑制剂的外用制剂可有效地用于化妆品、皮肤美白用化妆品以及化妆品或医药领域中的添加剂等。
本发明的另一实施方案是基于以下发现抗坏血酸和抗坏血酸衍生物具有优异的酪氨酸酶活性促进作用和优异的黑素生成促进作用。
尽管目前已将抗坏血酸和抗坏血酸衍生物用作黑素生成抑制剂，但本发明人发现抗坏血酸和抗坏血酸衍生物具有酪氨酸酶活性促进作用和黑素生成促进作用。
抗坏血酸和抗坏血酸衍生物不仅安全，而且可以低成本生产。
包括具有上述优点的抗坏血酸和/或其衍生物作为活性成分的酪氨酸酶活性促进剂以及包括该促进剂的外用制剂不仅安全，可低成本的生产，而且具有优异的酪氨酸酶活化作用和优异的黑素生成促进作用。
酪氨酸酶活性促进剂和包括该促进剂的外用制剂适用于化妆品和医药领域，例如防止或改善白发的头发用制剂或外用制剂；使皮肤变黑或治疗皮肤白斑病的皮肤用制剂或外用制剂；等。
本发明也提供了制备酯的酶催化法，该方法可使用含羟基化合物作为起始原料并且能够以高收率制备酯。
目前，酶催化的酯交换反应主要在疏水性有机溶剂中进行，而根据本发明，当使用特定的酶时，酶催化的酯交换反应可在诸如DMSO的非质子有机溶剂中进行。这就可能用含羟基化合物作为起始原料在含羟基化合物具有很高溶解度的溶剂中以高收率得到酯。
此外，当在本发明方法中使用蔗糖作为含羟基化合物时，就会得到蔗糖2位的羟基被选择性酯化的酯。
目前所得蔗糖脂肪酸酯主要是1′-，6-和/或6′-位伯羟基被酯化得到的单酯，二酯和三酯的混合物。在本发明中，可以高收率得到2位仲羟基被选择性酯化的蔗糖单酯化合物。
由本发明方法得到的蔗糖酯具有高亲水性和优异的溶解性、乳化性和稳定性等，并可作为乳化剂、表面活性剂等适用于食品、化妆品、洗发水、洗发露、医药、农药、清洁剂和其它领域。
本发明方法是使用几乎不溶于疏水性有机溶剂的含羟基化合物作为起始原料制备酯的优异方法；而且是制备难以合成和/或需要选择性酶催化反应的酯的方法。
权利要求
1.式(1)表示的熊果苷酯化合物式(1) 其中，Ra为疏水基。
2.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(2)表示式(2) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
3.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(3)表示式(3) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
4.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(4)表示式(4) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
5.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(5)表示式(5) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
6.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(6)表示式(6) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基；R2为烷基或芳基。
7.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(7)表示式(7) 其中，R1、R3、R4、和R5各自独立地为单键、亚烷基或亚芳基；X表示重复单元数并且为1-6。
8.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(8)表示式(8) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
9.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(9)表示式(9) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
10.根据权利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(10)表示式(10) 其中，R1为单键、亚烷基或亚芳基。
11.酪氨酸酶抑制剂，包括权利要求1-10所述熊果苷酯化合物中的至少一种作为活性成分。
12.皮肤外用制剂，包括权利要求11所述的酪氨酸酶抑制剂。
13.制备熊果苷酯化合物的方法，包括进行熊果苷与式(11)-(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反应步骤式(11)-(19)式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(15)A-OCO-R1-COO-R2其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；R2为烷基或芳基；式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自独立地为单键，亚烷基或亚芳基；X表示重复单元数并且为1-6；式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基；式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A为氢或取代或未取代烷基或乙烯基；R1为单键，亚烷基或亚芳基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中酯化反应在酶催化剂存在的条件下进行。
15.根据权利要求13所述的方法，其中酯化反应在化学催化剂存在的条件下进行。
16.根据权利要求13所述的方法，其中在进行酯化反应的同时进行脱水处理。
17.根据权利要求13所述的方法，其中在酯化反应步骤后接着进行如下步骤用非极性有机溶剂从酯化反应混合物中萃取和分离未反应的羧酸衍生物；以及然后加入过量的水以萃取和分离未反应的熊果苷并沉淀熊果苷酯化合物。
18.酪氨酸酶抑制剂，包括式(20)表示的十一碳烯酸、其盐和/或其酯衍生物式(20) 其中，Rb为氢或从糖除去一个羟基得到的糖残基。
19.根据权利要求18所述的酪氨酸酶抑制剂，其中Rb为从糖除去一个羟基得到的糖残基。
20.根据权利要求18所述的酪氨酸酶抑制剂，其包括十一碳烯酸和/或其盐，其中Rb为氢。
21.包括权利要求18所述酪氨酸酶抑制剂的外用制剂。
22.根据权利要求21所述的外用制剂，其是皮肤美白用化妆品。
23.酪氨酸酶活性促进剂，包括抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物作为活性成分。
24.根据权利要求23所述的酪氨酸酶活性促进剂，其中抗坏血酸衍生物为选自由抗坏血酸脂肪酸酯；抗坏血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的盐；抗坏血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；和抗坏血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的盐所组成的组中的至少一种。
25.包括权利要求23所述酪氨酸酶活性促进剂的外用制剂。
26.根据权利要求25所述的外用制剂，其是头发用外用制剂。
27.根据权利要求25所述的外用制剂，其是皮肤用外用制剂。
28.根据权利要求25所述的外用制剂，其中抗坏血酸和抗坏血酸衍生物的总含量相对于全部外用制剂为0.00001-10重量％。
29.根据权利要求25所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括抗坏血酸作为活性成分，并且其中抗坏血酸的含量相对于全部外用制剂为0.0001-1重量％。
30.根据权利要求25所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括选自由抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸葡糖苷所组成的组中的至少一种化合物作为活性成分，并且其中所述至少一种化合物的含量相对于全部外用制剂为0.001-10重量％。
31.根据权利要求25所述的外用制剂，其中酪氨酸酶活性促进剂包括选自由抗坏血酸脂肪酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯和抗坏血酸葡糖苷的脂肪酸酯所组成的组中的至少一种化合物作为活性成分，并且其中所述至少一种化合物的含量相对于全部外用制剂为0.00001-0.1重量％。
32.制备酯的方法，包括在非质子有机溶剂中、在Candidaantarctica由来的A型脂肪酶存在下用脂肪酸或其衍生物酯化含羟基化合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中非质子有机溶剂选自由二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基甲酰胺与二甲亚砜的混合物所组成的组。
34.根据权利要求32所述的方法，其中含羟基化合物选自由糖类、核苷类、糖醇类和含羟基氨基酸所组成的组中的至少一种。
35.根据权利要求34所述的方法，其中含羟基化合物为糖类。
36.根据权利要求32所述的方法，其中含羟基化合物为蔗糖，并且其中酯为式(21)表示的化合物式(21) 其中，Rc为C1-24脂肪酸残基。
全文摘要
本发明公开了含具有酪氨酸酶抑制或促进活性的化合物作为活性成分的酪氨酸酶活性调整剂，含该调整剂的外用制剂，以及制备上述化合物的方法。
文档编号C07H15/203GK1703419SQ20038010123
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月10日
发明者常盘丰, 北川优, 吉野贤二, 柳谷周作, 乐隆生, 户谷哲造, 嵨川博巳 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 东洋纺织株式会社