一种以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法及应用与流程

本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法及应用。

技术背景

酚类化合物属芳香化合物类。其中常见的苯酚是染料、造纸、医药、农药等行业的生产原料和中间体，但其对人体的毒害作用也不可忽视。苯酚对人体任何组织都有显著腐蚀作用，与细胞原浆中蛋白质接触时可发生化学反应，形成不溶性蛋白质，而使细胞失去活力。近年来，随着我国化工行业的迅猛发展，对苯酚的需求量越来越大，含酚废水的排放量也在不断增加。在美国，国家安全局已将苯酚列为优控污染物，对于我国来说，含酚废水处理同样也是污水处理的常规任务之一。

利用固定化酶降解酚类物质是近年来兴起的一种生物降解方法。相较于物理或化学法降解酚类化合物，该类方法更为绿色无毒。将酶固定在相应载体上，极大的解决了循环利用问题，降低了成本并且提高了其热稳定性、贮存稳定性。然而由于载体、酶种以及交联的方式不同，在该领域对应的固定化酶活性以及其温度、PH耐受性也不尽相同，多数固定化方法并不能完全兼顾上述三个条件。因此，如何选择合适的酶种、固定基质以及据此采用的交联方法成为酶固定化降解酚类化合物领域的一大难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法及应用，利用该方法将酪氨酸酶固定在聚丙烯腈微球上，能够有效去除污水中的微量酚类物质，并且该方法可保证固定化酪氨酸酶的活性，同时其温度、PH耐受性均维持在一个比较高的水平。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法，首先制备可修饰的聚丙烯腈微球，然后进行微球表面改性形成席夫碱并引入醛基，使其能与酪氨酸酶最大限度结合，将酪氨酸酶固定在聚丙烯腈微球表面。

聚丙烯腈微球含有可与强碱、强酸连续反应进而羧基化的腈基官能团。通过氢氧化钠、浓盐酸、乙二胺、戊二醛等一系列反应试剂处理后，聚丙烯腈微球可变为含有甲亚胺特性基团的席夫碱。

本发明所述以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法，具体包括以下步骤：

1)将聚丙烯腈溶于N-N二甲基甲酰胺中形成均相溶液，采用相转化法利用蠕动泵制备聚丙烯腈微球；

2)在45-50℃下，将聚丙烯腈微球浸泡于8-10wt％的氢氧化钠溶液中1-1.5h，然后取出聚丙烯腈微球并用蒸馏水浸泡洗涤，接着在室温下用0.1M盐酸浸泡2-2.5h羧化聚丙烯腈微球，然后将部分羧化的聚丙烯腈微球浸泡于8-10wt％的乙二胺溶液中1-1.5h使其酰胺化，得到改性后的聚丙烯腈微球；

3)将上述改性后的聚丙烯腈微球与8-10wt％的戊二醛溶液在4℃下避光接触1h；

4)最后将聚丙烯腈微球与酪氨酸酶-磷酸缓冲液接触反应进行固定化，得到固定于聚丙烯腈微球上的固定化酪氨酸酶。

所述步骤1)，聚丙烯腈与N-N二甲基甲酰胺的质量比为1:4。

所述步骤2)，酰胺化反应的温度为20-40℃。

所述步骤4)的酪氨酸酶-磷酸缓冲液的pH＝8。

所述步骤4)的固定化时间为8-24h，固定化温度为20-40℃。

优选的，所述步骤4)的固定化时间为16h，固定化温度为25℃。

所述步骤4)的固定化过程，控制反应体系的pH为4-9，以调节酶的催化活性，从而进一步控制固定化酪氨酸酶对酚类化合物的去除效果。

优选的，所述步骤4)的固定化pH为8。

进一步，所述步骤4)，通过控制固定化时间和固定化温度，可以调节固定化酪氨酸酶的浓度，使其浓度为0.5-5mg/ml.

本发明所述的固定化酪氨酸酶用于降解酚类化合物，在氧气作用下，利用固定于聚丙烯腈微球上的酪氨酸酶催化酚类化合物形成不溶于水的高聚物，从而达到有效去除酚类物质的目的。

使用时，将固定有酪氨酸酶的聚丙烯腈微球浸入含有酚类化合物的水溶液中，并于30-50℃环境条件下进行污染物降解。本发明的固定化酪氨酸酶，在氧气作用下即可完成对酚类化合物的降解，而一般过氧化物酶则需额外引入H₂O₂作为氧化剂催化反应。

本发明采用以上技术方案，首先将聚丙烯腈微球初步改性使其羧基化，然后经过一系列反应引入可与酪氨酸酶共价结合的醛基，并将酪氨酸酶固定在聚丙烯腈微球上，达到降解酚类化合物的目的。本发明是利用改性后聚丙烯腈微球表面的醛基和酪氨酸酶表面上的氨基酸残基进行共价结合，这种方式对酶本身的活性位点多数没有作用，但对酶的空间结构做出不可逆的修饰，使得其活力、稳定性、选择性都有较大提升，而且在与载体结合的程度上也比较紧密。结合在聚丙烯腈微球上的酪氨酸酶在氧气作用下可将酚类化合物催化变为醌类化合物，后者在水溶液中不稳定，经一系列酶催化和非酶催化反应，自身聚合或与其他物质(有机胺类化合物等)聚合反应形成不溶于水的大分子物质而沉淀。

本发明的显著优点在于，制备的固定化酪氨酸酶具有高效的类化合物去除率。以苯酚为例，本发明的固定化酪氨酸酶在一定范围浓度的苯酚降解率可达到90％以上。常见的过氧化物酶在降解酚类物质时，一般需要引入H₂O₂作为氧化剂，而本发明的固定化酪氨酸酶只需要加大自然溶氧，便可完成反应。本发明制备的固定化酶体系热稳定性好，温度、PH耐受性强，可在更大范围操作条件内满足对酚类化合物的降解需求。经实验测算，酪氨酸酶-聚丙烯腈体系具有良好的可重复利用性，对于大规模生物技术应用，本发明能够带来可观的经济效益，同时也符合当前国际绿色除污、环保除污的发展趋势。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明：

图1为聚丙烯腈微球固定化酪氨酸酶的原理示意图；

图2为聚丙烯腈微球改性前后的傅里叶变换红外光谱图(FTIR)；A为改性前聚丙烯腈微球，B为戊二醛改性后聚丙烯腈微球；

图3为酪氨酸酶固定于聚丙烯腈微球前后的X射线能量色散谱图(EDS)；A为固定前的聚丙烯腈微球；B为固定后的聚丙烯腈微球；

图4为酪氨酸酶固定于聚丙烯腈微球前后的扫面电子显微图像(SEM)：A为固定前的聚丙烯腈微球；B为固定后的聚丙烯腈微球，固定浓度1.79mg/cm²；

图5为游离酪氨酸酶及固定化酪氨酸酶对温度的耐受性对比图；

图6为游离酪氨酸酶及固定化酪氨酸酶对PH的耐受性对比图；

图7为游离酪氨酸酶及固定化酪氨酸酶的热稳定性对比图；

图8为游离酪氨酸酶及固定化酪氨酸酶的操作稳定性示意图。

具体实施方式

以下本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法，包括以下步骤：

1)将2g聚丙烯腈溶于8g N-N二甲基甲酰胺中形成均相溶液，采用相转化法利用蠕动泵制备聚丙烯腈微球；

2)在50℃下，将聚丙烯腈微球浸泡于10wt％的氢氧化钠溶液中1h，然后取出聚丙烯腈微球并用蒸馏水浸泡洗涤，接着在室温下用0.1M盐酸浸泡2h羧化聚丙烯腈微球，然后将部分羧化的聚丙烯腈微球浸泡于10wt％的乙二胺溶液中1h使其酰胺化(反应温度为25℃)，得到改性后的聚丙烯腈微球；

3)将上述改性后的聚丙烯腈微球与10wt％的戊二醛溶液在4℃下避光接触1h；

4)最后将聚丙烯腈微球与配置好的pH＝8的酪氨酸酶-磷酸缓冲液接触反应进行固定化，固定化时间16h，固定化温度为25℃，得到固定于聚丙烯腈微球上的固定化酪氨酸酶。

制备得到的固定有酪氨酸酶的聚丙烯腈微球，直接浸入含酚的水溶液中，降解污染物，最佳的底物浓度为2g/ml。

实施例2

以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法，包括以下步骤：

1)将聚丙烯腈溶于N-N二甲基甲酰胺中形成均相溶液，采用相转化法利用蠕动泵制备聚丙烯腈微球；

2)在45℃下，将聚丙烯腈微球浸泡于8wt％的氢氧化钠溶液中1.5h，然后取出聚丙烯腈微球并用蒸馏水浸泡洗涤，接着在室温下用0.1M盐酸浸泡2.5h羧化聚丙烯腈微球，然后将部分羧化的聚丙烯腈微球浸泡于8％的乙二胺溶液中1.5h使其酰胺化(反应温度为20℃)，得到改性后的聚丙烯腈微球；

3)将上述改性后的聚丙烯腈微球与8wt％的戊二醛溶液在4℃下避光接触1h；

4)最后将聚丙烯腈微球与配置好的pH＝4的酪氨酸酶-磷酸缓冲液接触反应进行固定化，固定化时间为8h，固定化温度为40℃，得到固定于聚丙烯腈微球上的固定化酪氨酸酶。

制备得到的固定有酪氨酸酶的聚丙烯腈微球，直接浸入含酚的水溶液中，降解污染物。

实施例3

以聚丙烯腈微球为载体固定化酪氨酸酶的方法，包括以下步骤：

1)将聚丙烯腈溶于N-N二甲基甲酰胺中形成均相溶液，采用相转化法利用蠕动泵制备聚丙烯腈微球；

2)在50℃下，将聚丙烯腈微球浸泡于10wt％的氢氧化钠溶液中1.2h，然后取出聚丙烯腈微球并用蒸馏水浸泡洗涤，接着在室温下用0.1M盐酸浸泡2.2h羧化聚丙烯腈微球，然后将部分羧化的聚丙烯腈微球浸泡于8wt％的乙二胺溶液中1.2h使其酰胺化(反应温度为40℃)，得到改性后的聚丙烯腈微球；

3)将上述改性后的聚丙烯腈微球与10wt％的戊二醛溶液在4℃下避光接触1h；

4)最后将聚丙烯腈微球与配置好的pH＝9的酪氨酸酶-磷酸缓冲液接触反应进行固定化，固定化时间为24h，固定化温度为20℃，得到固定于聚丙烯腈微球上的固定化酪氨酸酶。

制备得到的固定有酪氨酸酶的聚丙烯腈微球，直接浸入含酚的水溶液中，降解污染物。

实施例4

固定化酪氨酸酶对苯酚降解率的测定

对不同酚类化合物降解率的测定以苯酚为例，利用4-APP分光光度法来测定苯酚的浓度，并根据固定化酪氨酸酶处理前后苯酚浓度的变化确定降解率。

具体操作方法为：用移液枪吸取700μl碳酸氢钠溶液(0.25M)，100μl的苯酚样品溶液，100μl 4-氨基安替比林溶液(20.8mM，溶解在0.25M的碳酸氢钠溶液中)，100μl的铁氰化钾溶液(83.4mM，溶解在0.25M的碳酸氢钠溶液中)，在试管中混合均匀避光条件下反应10min后，用分光光度计测定溶液的吸光度值A₅₁₀。以苯酚浓度为横坐标，A₅₁₀为纵坐标，绘制A510-[C]标准曲线。

将本发明制备的固定有酪氨酸酶的聚丙烯腈微球浸入苯酚溶液中(0.1M，PBS)。于35℃振荡培养箱中进行污染物降解12h，10000r/min离心10min后取上清液，测定固定化酪氨酸酶处理前后的样品溶液在510nm处的吸光度值并与标准曲线比较，即可计算出苯酚的浓度。并根据如下公示计算苯酚的降解率(η)：

其中：C₀：反应前溶液中的苯酚浓度(mg/L)；

C_s:反应后溶液中的苯酚浓度(mg/L)。

经计算，在实验确定的最优控制条件下，苯酚降解率可达到92％，非常高效。

实施例5

固定化酪氨酸酶及游离酪氨酸酶的温度、PH耐受性

不同温度条件，温度、pH对固定化酪氨酸酶酶活性的影响采用相对活性进行计量。计算公式如下：

其中：μ_p：酶的相对活性％；

v_max：实验中选取不同温度及PH条件下绝对酶活最大值为v_max；

v_p：操作条件下的绝对酶活。

在20-60℃范围内，考察酪氨酸酶固定化前后对温度的耐受性以及其最适温度，以温度为横坐标，酶的相对活性为纵坐标。如图5所示，实验结果表明，在20-60℃内，游离酪氨酸酶相对活性随温度改变较显著，在35℃达到峰值随后又急速下降；而固定化酪氨酸酶虽整体趋势与前者相似，但在30-50°C范围内，酶的相对活性基本维持不变且保持在90％以上，说明经聚丙烯腈做载体固定后的酪氨酸酶对温度耐受性能显著提高，故在实际操作过程中，只需把操作温度维持在30-50℃内便可，不必苛求一个绝对特定的温度，减少了成本消耗。

而在pH 4-9操作区间内，以pH为横坐标，酶的相对活性为纵坐标。如图6所示，实验结果表明，游离酪氨酸酶与固定酪氨酸酶的最适pH均为7，但在小幅度偏出最适pH的条件下，固定化酪氨酸酶的相对酶活性降幅明显小于游离酪氨酸酶，这说明固定化酪氨酸酶的pH耐受性要优于游离酪氨酸酶，在实际操作时，体系pH允许有轻微的波动而不致严重减弱酶的活性。

实施例6

固定化酪氨酸酶及游离酪氨酸酶的热稳定性

在50℃和60℃，两个温度梯度条件下考察固定化及游离酪氨酸酶的热稳定性。以时间为横坐标，残留活性为纵坐标，制图。如图7所示，50℃下，两种形式的酶进行热处理120min后，固定化酪氨酸酶的残留活性基本维持不变，仍接近100％，而游离酪氨酸酶的活性却下降高达30％；60℃下，固定化酪氨酸酶120min后残留活性仍保持在50％以上，而游离酪氨酸酶75min左右就已经完全失活。由于酶固定化后可以大幅减小其构象柔性，固定化酶的热稳定性往往优于游离酶，针对特定的酪氨酸酶，将其固定在经过改性的聚丙烯腈载体表面后，这种现象尤为明显，酶的热稳定性得到极大的提高。

实施例7：

固定化酪氨酸酶的操作稳定性

为衡量固定酶是否易于分离回收，实验通过测算其操作稳定性评价酶的重复利用性能的好坏。酪氨酸酶催化底物反应结束后，将聚丙烯腈小球从反应体系中回收。用0.1M，pH7.0的PBS清洗后使酶活性恢复，然后加入到新的反应体系进行酶催化实验，测定酶的残留活性，重复操作10次。固定化酶的残留活性(％)计算公式如下：

其中：μ_n：酶残留活性：％；

ν₀：酶固定化以后的初始活性；

v_n：n次操作后固定化酶的活性。

如图8所示，实验表明，在利用固定化酪氨酸酶进行5次降解后，酶的残留活性仍可维持在70％以上，而在操作处理10次后，其残留活性依然保持在40％左右，说明本发明方法制备的聚丙烯腈固定化酪氨酸酶微球重复利用性很高。