真菌来源的半乳糖苷酶TlGal27S及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及真菌来源的半乳糖苷酶TlGal27S及其基因和应用。

背景技术：

糖苷水解酶按照其氨基酸序列一级结构的相似性和疏水基团可分为133个家族，其中α-半乳糖苷酶被划分到4、27、32、36、57、97和110七个不同的糖苷水解酶家族。研究最多的α-半乳糖苷酶主要分布在27和36两个家族中。植物、动物、酵母和大多数丝状真菌来源的α-半乳糖苷酶多数属于27家族，而36家族的α-半乳糖苷酶多数来源于细菌和少数的真菌。这两个家族与31家族一起形成GH-D超家族。酶的初级结构决定其高级结构以及分子机制反映出不同家族的酶在分子结构和机制上的不同特点。

α-半乳糖苷酶在饲料、食品、造纸、化学和医疗等行业都有广泛的应用。在饲料行业中，豆粕以及其他豆类饼粕是动物饲料的主要蛋白质原料，但其中存在大量抗营养因子即α-半乳糖苷寡糖类，单胃动物不能吸收利用，当这些物质经过大肠消化时，会被发酵产生大量气体，导致动物出现胀气和腹泻等不良症状。添加α-半乳糖苷酶到饲料里，可以有效的降解此类物质，从而消除大豆中引起消化不良的棉子糖和水苏糖。α-半乳糖苷酶在制糖工业中应用也较为广泛。由于棉子糖的存在，造成糖蜜粘度增加而阻碍蔗糖结晶析出，导致大量的废糖蜜产生，降低了糖的产量。然而，利用α-半乳糖苷酶可以去除废糖蜜中的棉子糖，产生半乳糖和蔗糖，从而大大提高了蔗糖的得率。在造纸工业上，软木主要的半纤维素组分是半乳葡聚甘露聚糖和阿拉伯木聚糖。用α-半乳糖苷酶、木聚糖酶以及甘露聚糖酶混合处理软木纸浆，能够使纸张的漂白效果大大提高。α-半乳糖苷酶广泛应用于食品、纺织和制药等工业。

本发明从Talaromyces leycettanus JCM12803菌株中得到了一个新的半乳糖苷酶基因，其编码的半乳糖苷酶具有以下几个优点：酸性、广泛的底物特异性、比活高、降解蜜二糖、水苏糖、棉籽糖。所有这些优点都意味着新发明的半乳糖苷酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比之前报道的半乳糖苷酶更有应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酸性、广泛底物特异性、具有降解蜜二糖、水苏糖、棉籽糖能力的的半乳糖苷酶。

本发明的再一目的是提供上述半乳糖苷酶的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述半乳糖苷酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述半乳糖苷酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备半乳糖苷酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述半乳糖苷酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的半乳糖苷酶。该半乳糖苷酶TlGal27S氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长473个氨基酸，N端24个氨基酸为信号肽序列“MPAQTVSTAT FILASLLLPS VVHG”。

因此，成熟的半乳糖苷酶TlGal27S的理论分子量为49.4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

该半乳糖苷酶最适作用pH为4.5，在pH 3.5-5保持62.4％以上的相对酶活性，37℃下pH 3-7处理1h后，TlGal27S能保持62.0％以上的酶活力；最适温度为65℃，在55-65℃范围内保持72.4％以上的相对酶活性，50℃处理1h之后TlGal27S的酶活力还能保持86.0％，60℃处理1h之后，TlGal27S的酶活力仅为未处理酶液的5.8％。

本发明还提供了编码上述半乳糖苷酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了这个半乳糖苷酶基因TlGal27S，DNA全序列分析结果表明，半乳糖苷酶TlGal27S结构基因全长1918bp，含有6个内含子，cDNA长1419bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

成熟蛋白理论分子量为49.4kDa，该酶属于糖苷水解酶第27家族。TlGal27S是一种新的半乳糖苷酶。

去除信号肽后的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示

本发明还提供了包含上述半乳糖苷酶基因的重组载体，优选为pPIC9-TlGal27S。将本发明的半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将半乳糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-TlGal27S。

本发明还提供了包含上述半乳糖苷酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/TlGal27S。

本发明还提供了一种制备半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组半乳糖苷酶的表达；以及回收并纯化所表达的半乳糖苷酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/TlGal27S。

本发明还提供了上述半乳糖苷酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产半乳糖苷酶。

本发明提供了一个新的半乳糖苷酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的半乳糖苷酶。

附图说明

图1本发明的重组半乳糖苷酶的最适pH值。

图2本发明的半乳糖苷酶的pH稳定性。

图3本发明的半乳糖苷酶最适反应温度。

图4本发明的半乳糖苷酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。

(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1半乳糖苷酶编码基因TlGal27S的克隆

提取Talaromyces leycettanus JCM12803基因组DNA

设计引物，以Talaromyces leycettanus JCM12803总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃2min,35个循环，72℃10min。得到一约1900bp片段，将该片段回收后送睿博兴科生物技术有限公司

表1基因克隆本实验所需的引物

实施例2半乳糖苷酶cDNA的获得

提取Talaromyces leycettanus JCM12803,总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物12803GH27-1-F和12802GH27-1-R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得半乳糖苷酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。

通过对半乳糖苷酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有6个内含子，cDNA长1419bp，编码472个氨基酸和一个终止密码子，N端24个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Talaromyces leycettanus JCM12803中分离克隆得到的编码半乳糖苷酶的基因为新基因。

实施例3半乳糖苷酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的半乳糖苷酶TlGal27S的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物12803GH27-1-F和12803GH27-1-R(见表1)，对TlGal27S的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,San Diego)，半乳糖苷酶TlGal27S成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-TlGal27S，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方式构建含TlGal27S信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

(2)高半乳糖苷酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高半乳糖苷酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例4重组半乳糖苷酶的制备

(1)半乳糖苷酶基因TlGal27S在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于400mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入200mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

(2)重组半乳糖苷酶的纯化

收集摇瓶表达的重组半乳糖苷酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组TlGal27S，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取TlGal27S浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定

实施例5重组半乳糖苷酶部分性质分析

采用pNPG法对本发明的半乳糖苷酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 4.5，65℃条件下，0.5mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，125μLpNP，275μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，反应5min，加入1.5mL 1M碳酸钠终止反应。405nm测定OD值。半乳糖苷酶活性单位定义：在最适反应条件下，每分钟分解pNPG生成1μmol pNP需要的酶量。

(1)半乳糖苷酶TlGal27S的最适pH及pH稳定性

经纯化的实施例3表达的半乳糖苷酶TlGal27S在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的半乳糖苷酶TlGal27S在不同pH的缓冲体系.65℃下测定的pH适性结果(图1)表明：TlGal27S的最适pH为4.5，在pH 3.5-5保持62.4％以上的相对酶活性。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图2)，分析结果表明pH3.0-pH7.0之间能够维持62.0％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

(2)半乳糖苷酶TlGal27S反应最适温度及热稳定性

纯化的半乳糖苷酶在pH4.5条件下，测定不同温度(40-90℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为65℃，在55-65℃时依然具有72.4％以上的酶活力(图3)。耐温性测定为半乳糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该半乳糖苷酶在50℃下处理60min，剩余酶活在86.0％以上，即使该酶在60℃下处理20min，依然能够保持32.4％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性(图4)。

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 真菌来源的半乳糖苷酶TlGal27S及其基因和应用

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<212> PRT

<213> Talaromyces leycettanus JCM12803

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<213> Talaromyces leycettanus JCM12803

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