本发明涉及化妆品技术领域，具体是一种用于抑制酪氨酸酶的连翘花提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
人面部的黄褐斑、蝴蝶斑均属黑色素沉着异常导致，而酪氨酸酶又是合成黑色素的关键酶，通过抑制酪氨酸酶的生物活性，可以间接地抑制黑色素的生成。因此，目前祛斑、美白化妆品中主要成分是以具有抑制酪氨酸酶活性的曲酸、熊果苷为主。并且从天然植物中筛选酪氨酸酶抑制剂并应用于祛斑、美白化妆品中一直是化妆品研究的热点。如芦荟、甘草和桑树的提取物已在祛斑、美白化妆品中得到广泛应用。
连翘花是木犀科连翘属植物连翘的花，含有丰富的芦丁等生物黄酮成分，并具有较强的抗氧化和抗菌活性。而且在民间具有使用连翘花作为花茶饮用的习惯。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于抑制酪氨酸酶的连翘花提取物及其制备方法和应用。
本发明提供的一种用于抑制酪氨酸酶的连翘花提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：称取一定量连翘干花、粉碎，加入8～10倍量的亲水性溶剂，静置浸泡30min，回流提取1～2h，过滤，残渣再用8～10倍量的亲水性溶剂回流提取1h，过滤，合并两次提取液，60℃减压浓缩至比重为1.05～1.10的连翘花浓缩液；
(2)分离：浓缩液进一步利用非极性柱层析材料层析分离，首先用去离子水洗脱2～4个柱体积，再用20％、40％、60％的乙醇水溶液依次各洗脱2～4个柱体积，收集60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩、干燥，得到连翘花提取物。
步骤(1)所述的亲水性溶剂可以为水、乙醇、甲醇或不同比例的水和乙醇的混合溶剂，不同比例的水和甲醇的混合溶剂，优选使用70％乙醇水溶液。
步骤(2)所述的非极性柱层析材料可以为C18和MDS-5的任意一种。
有效成分测定：采用NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法测定有效部位中的总黄酮含量，连翘花的有效部位中总黄酮的含量在12.0％以上(总黄酮含量以芦丁当量计算)。
以上述获得的连翘花提取物为活性组分，可以与载体、其他美容活性组分、稀释剂等混合制成化妆水、乳液、凝露、面膜和面霜等特殊功能性化妆品。
本发明具有如下优点：本发明制备的连翘花提取物总黄酮含量为12.0％以上(总黄酮含量以芦丁当量计算)。连翘花提取物抑制酪氨酸酶活性的IC50值为0.67mg/mL，抑制效果与熊果苷相当(熊果苷抑制酪氨酸酶的IC50值0.52mg/mL)。其可在祛斑、美白化妆品中应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。
实施例1 称取100g连翘干花、适当粉碎，加入1000mL 70％的乙醇水溶液，静置浸泡30min，回流提取1h，过滤，残渣再用1000mL 70％的乙醇水溶液回流提取1h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至浓缩液比重为1.05。浓缩液进一步利用非极性C18柱层析材料层析分离，先用去离子水洗脱3个柱体积，再用20％、40％、60％的乙醇水溶液依次各洗脱3个柱体积，弃去去离子水和20％、40％的乙醇水溶液洗脱液，收集60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩、干燥，得连翘花提取物。连翘花提取物中总黄酮的含量为12.5％(总黄酮含量以芦丁当量计算)。
实施例2 称取100g连翘干花、适当粉碎，加入800mL 70％的乙醇水溶液，静置浸泡30min，回流提取1.5h，过滤，残渣再用800mL 70％的乙醇水溶液回流提取1h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至浓缩液比重为1.10，回收溶剂。浓缩液进一步利用非极性MDS-5柱层析材料层析分离，先用去离子水洗脱4个柱体积，再用20％、40％、60％的乙醇水溶液依次洗脱4个柱体积，弃去去离子水和20％、40％的乙醇水溶液洗脱液，收集60％的乙醇水溶液的洗脱，减压浓缩、干燥，得连翘花提取物。连翘花提取物中总黄酮的含量为12.7％(总黄酮含量以芦丁当量计算)。
实施例3 连翘花提取物对酪氨酸酶的抑制作用的体外试验
按实施例1制备获得的连翘花提取物观察对酪氨酸酶的抑制作用
酪氨酸酶活性抑制实验体系如表1所述。实验时，先加蘑菇酪氨酸酶(TYR)和不同浓度的连翘花提取物和熊果苷溶液，在37℃预热10min，最后加入底物L-酪氨酸20μL，触发反应，设置检测波长为475nm，记录30min时的吸光度值。每组实验重复三次。
酪氨酸酶抑制率计算公式为：I％＝{[(A-B)-(C-D)]/(A-B)}×100％
连翘花提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制结果见表2。说明本发明获得的连翘花提取物对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制效果与熊果苷相近，具有较强的抑制效果。
表1酪氨酸酶抑制活性实验反应体系
表2连翘花提取物对蘑菇酪氨酸酶抑制的IC50