可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达ha-5-ht6r的细胞系的制作方法

专利名称：可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达ha-5-ht6r的细胞系的制作方法
可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达 HA-5-HT6R的细胞系
技术领域：
本发明涉及一种5-羟色胺6受体(5-HT6R)配体高效率检索方法。背景技术：
5-羟色胺受体(5-HTR)包括5-ffl\R到5_HT7R的各种亚型，目前为止被发现的种 类共有15种，被认为与抑郁症、精神分裂症、焦虑症(anxiety)及睡眠障碍等精神疾病及阿 尔茨海默病等有关。 其中，5-HTeR是最近探索出盐基序列的5-HTR，虽然还没有研究出其机制，但被 认为涉及到退化性脑疾病与精神疾病之类的疾病。根据最近的研究报告显示，5-HTeR的 剌激在生物化学及行动学方面可以呈现出类似于抗抑郁剂的效果，而且各种报告均指 出脑发育(brain development)、记忆禾口学习(learning and memory)及老年痴呆症 (Alzheimer disease)等很多重大脑部疾病都与其有密切关系(Grimaldi B et al.， Na皿ynSchmiedebergs Arch Pharmacol. 357 (4) :393-400,1999 ;Garcia-AllozaM et al.， Neuropsychopharmacology 29 (2) :410-416，2004 ;Lorke D etal. ， BMC Neurosci. 27 ; 7-36,2006 ;Greengard et al. ， J Neurosci. 27(15) :4201-4209，2007)。 以5-HTR作为 作用点的药物包括非选择性地结合于一切5-HTR的氯氮平(clozapine)，选择性地结合于 5-HTeR的药物为SB258585，但还无法作为疾病的治疗剂使用。在研究抑郁症或阿尔茨海默 病等疾病时，由于人们对于5-HTeR在脑细胞的具体功能及5-HTeR参与的信号传达机制几乎 没有任何认识，为了研究其功能与机制并选择性地开发配体，需要具备可以选择性地研究 5_HT6R的系统。 本发明人们制作出可以表达出HA (Hemagglutinin)被连接到N端(N-terminal) 的5-HT6R的细胞系，上述HA-5-HT6R暴露于细胞表面外部，可以稳定表达上述HA-5-HT6R并 维持上述5-HT6R的活性，确认了上述细胞系可以在5-HT6R的选择性配体的开发过程中进行 高效率检索。

发明内容发明需要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种可以稳定表达5_HT6R的细胞系。 本发明的另一个目的是提供一种基于上述细胞系的5_HT6R配体高效率检索方法。
本发明的再一个目的是提供一种包含上述细胞系的5-HT6R配体高效率检索用组 成物。解决问题的技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种含有N端连接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R
基因构建体的载体(vector)被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。本发明提供的5-HTeR配体高效率检索方法包括下列步骤步骤l，利用受检化合物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，检查上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及 步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。
本发明提供的5-HTeR配体高效率检索方法包括下列步骤步骤l，利用受检化合
物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，精制上述经过处理的细胞系的蛋白质； 步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及 步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。 本发明还提供包含本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-HT6R配体高效率检 索用组成物。 下面说明本发明所使用的术语。 术语"5_HT6R配体"表示结合在5_HT6R而调节活性的物质。
下面详细说明本发明。 本发明提供一种通过含N端连接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R基因构建体的载 体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 在本发明的较佳实施例中，把含有HA基因与取自人类绒毛膜癌细胞系的5_HT6R 基因连接而成的HA-5-HT6R构建体的载体(参照图1)转导到人胚肾细胞系(human embryonic kidney cell line ;HEK293细胞系)。利用PCR方法对特异表达HA-5-HT6R基 因的细胞系进行筛选后(参照图2a)，把上述选定转基因细胞系从第一代培养到第六代。 然后利用PCR方法验证各代的HA-5-HT6R基因是否出现特异表达(参照图2b)。检查结 果发现本发明的细胞系可稳定表达HA-5-HT6R，2008年09月12日把上述经过验证的细胞 系寄托到韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line ResearchFoundation)(寄托编号 KCLRF-BP-00187)。 在本发明的较佳实施例中，按照时间顺序对本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系 进行了5_羟色胺(5-HT)处理，确认了 ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 的磷酸化增加(参照图3a)，可知上述细胞系所表达的HA-5-HT6R在细胞内部正常地发挥功 能。上述细胞系受到5-HT与EMD386088的剌激后增加了 ERK的磷酸化现象，SB258585则 减少其效果(参照图3b)。把可以表达嵌合体Gal5蛋白质的载体与脂质体基因感染到本 发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系后利用5_HT给与剌激，然后再与表达5_HT6R的细胞系 的细胞内部钙流入情形进行比较，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及图 5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。 在本发明的较佳实施例中，分别在HA及大韩民国公开专利第2008-0004994号确 认为5-HT6R的结合蛋白质的Fyn使用特异抗体，可以观察到本发明稳定表达HA-5-HT6R的 细胞系细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在 细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 在本发明的较佳实施例中，对于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表 达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较后发现，由于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系 (参照图6)。本发明的细胞系是寄托编号为KCLRF-BP-00187的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 上述HA在细胞系以连接5-HT6R的形态表达并位于细胞表面的外部，可以利用上 述HA选择性地检查表达在细胞表面的5-HT6R。 上述转导可以在下列方法中选择一个方法后进行在脂质体(Lipofectamine)、 Dojindo公司的Hilymax、 Fugene、 jetPEI、 Effectene及DreamFect所组成的群中选 择某一商业化的转导用试药的方法；利用磷酸钙(calcium-phosphate)、正电荷型高分 子、微脂粒、纳米粒子、核转染(皿cleofection)、电穿孔法(electroporation)、热冲击 (heatshock)、磁珠转染(magnetofection)的方法；以及利用反转病毒的方法。
本发明提供的5_HT6R配体高效率检索方法包括步骤l，利用受检化合物处理本 发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，测定上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及 步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。 在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部 的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到 HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 在本发明的较佳实施例中，把稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情 形与表达5-HT6R的细胞系进行比较，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及 图5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。 在本发明的较佳实施例中，对于可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表 达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较后发现，由于本发明稳定表达 HA-5-HT6R的细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系 (参照图6)。 本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA选择性地检查
表达在细胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地运用到5-HT6R配体的高效率检索作业。 步骤1的受检化合物以天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白质、配
体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子较佳，但不限于此。 步骤2在测定5_HT6R活性时可以采取通过5_HT6R测定细胞内部钙浓度流入情形
的方法，但不限于此。此时测定细胞内部钙浓度流入情形的目标细胞系可以在进行受检化
合物的处理之前先利用表达嵌合体G。^蛋白质的载体与脂质体进行基因感染。 本发明5_HT6R配体高效率检索方法包括下列步骤步骤1，利用受检化合物处理
本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，上述经过处理的细胞系的蛋白质精制步骤；
步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及 步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。
在本发明的较佳实施例中，利用5-HT， EMD386088及SB258585剌激本发明稳定表 达HA-5-HT6R的细胞系后，确定了上述转基因细胞系所表达的HA-5-HT6R在细胞内部发挥 正常功能(参照图3a及图3b)。 在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部 的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到 HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA (HA)选择性地
检查表达在细胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地运用到5-HT6R配体的高效率检索作业。 步骤1的受检化合物以天然化合物，合成化合物，RNA， DNA，多肽，酶、蛋白质、配
体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子较佳，但不限于此。 步骤2的5_HT6R活性测定不限于此，但可以利用测定上述5_HT6R所磷酸化的ERK
的方法进行测定。 本发明还可以提供包含本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-HT6R配体高效 率检索用组成物。 在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部 的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到 HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 在本发明的较佳实施例中，确定HA-连接没有改变5_HT6R的功能(参照图5a及图 5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。在本发明的较佳实施例中，由 于本发明细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系(参 照图6)。本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA (HA)选择性地 检查表达在细胞表面上的5-HTeR，因此可以作为5-HT6R配体高效率检索用组成物使用。
本发明的细胞系是寄托编号为KCLRF-BP-00187的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 上述组成物可以另外添加Gal5基因、脂质体、荧光钙标记物及洗涤缓冲液，上述荧 光型f丐标记物可以使用对f丐浓度敏感的Fluoro-4/AM与普朗尼克(Pluronic)F-127等。
发明效果
本发明的细胞系可以稳定地表达HA-5-HT6R，进而提高选择性地作用在5-HT6R的 配体的检索效率，对于和5-HT6R结合的蛋白质研究做出贡献。本发明可以有效地预防及诊 断出5-HTeR相关抑郁症、阿尔茨海默之类的脑疾病及精神疾病，进而开发出其治疗剂。


图1是包括N端连接HA的人类5_HT6R基因在内的质体的序列图。 图2是利用逆转录PCR方法检查HA-5-HT6R转导的细胞系的结果 a :HA-5-HT6R转导的细胞系的筛选；及 b :从Pl到P6对稳定表达HA-5-HT6R的鉴定。 图3是本发明的HA-5-HT6R被转导的HEK293细胞系的HA-5-HT6R的功能检查结 果图
6
a :5-羟色胺(5-HT)的剌激所造成的ERK磷酸化；及b :5-HT6R的活性剂5-HT及EMD386088及对抗药SB258585的效果确认。 图4是本发明的HA-5-HT6R被转导的HEK293细胞系的细胞表面的HA-5-HT6R表
达形态分析结果(整体在细胞内部及表面检查表达形态) a :5-HT6R的N端所连接的、位于细胞表面外部的HA的模式图； b :Fyn过表达之前的Fyn及HA-5-HT6R的分布；及 c :Fyn过表达时的Fyn及HA-5-HT6R的分布. 图5是本发明的细胞系表达的HA-5-HT6R的功能没有被HA_连接影响的鉴定结 果 a :细胞内部f丐量的变化；b :细胞内部f丐量的平均；及
c :HA-5-HT6R的浓度-依存活性。 图6是临时或稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的重现性差异图。发明的具体实施方式
下面详细描述本发明的较佳实施例。 但下列实施例仅为本发明的举例，本发明的内容不受下列实施例的限定。
〈实施例1>转基因细胞系的制备
〈1-1>野生型细胞系的培养 在含有10%胎牛血清及1 %青霉素/链霉素(v/v)的 DMEM(Dulbecco， smodified-Eagle' s medium)培养池上以37°C，5% C02的加湿条件培养 HEK293细胞系(ATCC CRL 1573)。上述培养液3-4日交换一次，细胞则每星期进行一次传 代培养(sub-culture)。把上述HEK293细胞系涂敷在10cm培养皿上5. OX 106左右后培养 12小时。 〈l-2〉HA-5-HT6R细胞系的制备 禾U 用BglII限制酶处理HA-5-HT6R-pcDNA3. 1 (+)质体(图1; MissouriS&T cDNA Resource Center, USA)而使其线性化后，以1 : 3的比率(线 性化的HA_5_HT6R_pcDNA3. 1 (+) 12ii g， Lipofectamine 36 yl)禾口 Lipofectamine 2000(Invitrogen， USA) —起投入Opti-MEM(Invitrogen， USA)培养池并混合5分钟，30 分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用匿EM培养池更换 培养池，再培养细胞24小时后添加800iig/ml的G418(Invitrogen， USA)筛选出转基因 细胞。选择性地培养14天后，分别在24孔板针对已形成了集落的细胞群进行传代培养 (subculture)使其成长，筛选出成长速度最快的细胞群，得到了可稳定表达HA-5-HT6R的 细胞系。得到了稳定的细胞系后，逐渐降低G418浓度后在添加了 400i! g/ml的培养池里进 行培养。 〈l-3〉5-HTeR细胞系的制备 利用5-HT6R_pcDNA3. 1 (+)质体(Missouri S&T cDNA ResourceCenter，USA)按照 实施例1-2的方法得到转基因的细胞系。
〈实施例2>转基因细胞系的确认
〈2-1>转基因细胞系的筛选 把实施例1-2中得到的转基因细胞系按照各集落区分后在DMEM培养池以37°C、5% C02细胞培养池培养，然后使用三环唑试药分离RNA。利用AMV逆转录酶制备cDNA，使用序列号为1的正向引物(forwardprimer) (5' -CCACTCTTCATGCGGGACTTC-3)及序列号为2的逆向引物(5' -TCAGTTCGTGGGGATGCCAAG-3')放大HA-5-HT6R基因。对照组则使用序列号为3的正向引物(5' -GTCACCAACTGGGACGACATG-3')及序列号为4的逆向引物(5'-GCCGTCAGGCAGCTCGTAGC-3')放大P-actin基因。PCR条件为，在95"C进行预变异4分钟后，以95°CT 1分钟、6(TC下30秒钟、72t:下30秒钟的顺序反复进行30次，最后在72°C的温度下反应10分钟，然后在4t:下冷却。 其结果为，如图2a所示得到了可以特异放大HA-5-HT6R基因(363bp)的细胞系(lane 1)。 〈2_2>可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系的鉴定 每3-4日就为按照实施例2-1的方法培养出来的细胞系更换一次培养液，每星期进行一次传代培养而在42天内得到l(Pl)到6(P6)代，在使用之前一直在-7(TC的温度下妥善保管。对照组则使用了野生型细胞系的1到6代。 利用上述方法到的细胞系按照实施例2-1的方法得到RNA，形成cDNA，放大HA-5-HT6R基因。对照组则放大P -actin基因。 其结果如图2b所示，可以在Pl到P6特异放大HA-5-HT6R基因。2008年09月12日把上述经过验证的细胞系寄托到韩国细胞系研究基金会(KoreanCell Line ResearchFoundation)(寄托编号KCLRF-BP-00187)。
〈2_3>可以临时表达HA-5-HT6R的转基因细胞系的制备 以1 : 3的比率把HA-5-HT6R-pcDNA3. 1 (+)质体与Lipofectamine2000 一起投入0pti-MEM培养池并混合5分钟，30分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用DMEM培养池更换培养池，再培养细胞24小时后制成可以临时表达HA-5-HT6R的转基因细胞系。〈实施例3>HA-5-HT6R的细胞信号传达过程分析 〈3-1>对于5_HT6R的活性剂5_羟色胺(5-HT)的反应性检查 〈3-l-l〉5-HT处理 在含有无血清DMEM培养池的6_孔培养皿里把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以IX 106细胞/孔分注后进行培养。3小时后，按照预设为0 60分钟的间隔(0， 1，5， 15，30及60分钟)处理20 ii M 5_HT (Sigma， USA)。
〈3_l_2>Western免疫印迹(Western blot) 针对各5-HT的处理时间而收集试料，把上述细胞保管在-20°C的温度下，然后和包含蛋白质酶抑制齐U (protease inhibitor, CompleteMini， Roche Diagnostics GmbH，Germany)的冰凉RIPA溶解缓冲液(upstate biotechnology, USA) —起投入均质化器加以粉碎后进行均质化。均质化的试料以13， 000rpm的转速进行离心分离10分钟，使上层清液与不溶型凝集物分离。分离后的上层清液的蛋白质浓度通过伯乐蛋白定量试剂盒(Bio-Rad protein assay kit,Bio-Rad，USA)进行测定。以l : 4的比率混合上层清液与5XSDS(0.156M Tris-HCl，pH 6. 8， 2. 5% SDS， 37. 5%甘油，37. 5mM DTT)后在10(TC的温度下煮10分钟。把煮过的试料加载到10% SDS-PAGE凝胶的孔(well)里，在125V的电压下电泳(electrophoresis) 2小时并根据分子量进行分 离，在20V、400A以下的条件下把上述蛋白质电泳1小时后移到PVDF膜。然后利用5%的脱脂牛奶把接受了蛋白质的膜遮蔽12小时，再使用第一阶段抗体(抗-ERK/p-ERK抗体；Cell signaling, USA)处理4小时后用TBST(Tris Buffered Saline+0. 1% tween)清洗3次，每次清洗10分钟，用第二阶段抗体(抗兔-IgG-HRP ;Amersham Bioscience, UK)处理1小时。再用TBST清洗4次，每次清洗IO分钟，然后利用ECL检测试剂盒(Amersham Biosciences, UK)引起发光反应，再暴露于Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, UK)并观察其结合反应。 其结果如图3a所示，受到5-羟色胺(5_HT)的剌激而增加了 ERK的磷酸化程度，其影响在5分钟时达到最高值。 〈3-2〉对于5-HT6R的活性剂EMD386088与对抗药SB258585的反应性检查
在含有无血清DMEM培养池的6_孔培养皿里把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以1 X 106细胞/孔分注后进行培养。3小时后，利用20iiM 5-HT，liiM EMD386088(Tocris，USA)及10 ii MSB258585 (Tocris， USA)分别按照预设的间隔处理5分钟。对于EMD386088/SB258585，首先对SB258585进行30分钟的预处理后再处理EMD386088。按照实施例3_1_2的Western免疫印迹方法检查了上述化学物质处理对ERK磷酸化的影响。 其结果如图3b所示，受到5-HT与EMD386088的剌激后增加了 ERK的磷酸化程度，SB258585则降低其效果。〈实施例4>HA-5-HT6R的细胞表面表达分析
〈4-l>Fyn过表达之前的分析 为了在本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中观察细胞膜外部的5_HT6R的N端所连接的HA是否位于细胞表面的外部(图4a)，使用了在大韩民国公开专利第2008-0004994号中确认为5-HT6R的结合蛋白质的Fyn。 具体地说，整体细胞或表面蛋白质分析时使用免疫荧光细胞化学法(immunofluorescence)。利用把涂层盖玻片(cover glass)中生育的实施例2所筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系清洗3次，利用溶于PBS的4 %多聚甲醛在4°C的温度下把细胞固定30分钟，再使用冰凉的PBS清洗3次。之后，把抗体投入细胞内部后，为了观察整体细胞而利用PBST(PBS+0. 2% Triton X-100)处理20分钟，或者省略上述PBST处理步骤而注入抗体并阻止抗体流入细胞内部，然后分析细胞表面。之后利用5%的BSA遮蔽1小时，再利用第一阶段抗体，anti-HA(l : 500 ;Cell Signaling, USA)与anti-Fyn(l : 500 ;Cell Signaling,USA)反应6小时后，利用PBS清洗3次，每次10分钟，第二阶段抗体则处理1小时。利用PBS清洗3次后，利用CRYSTAL/MOUNT(Biomeda Corp.，USA)把盖玻片固定在Slide上。为了观察抗体标记的两种特定蛋白质的细胞内部位置，使用confocal LSM 5101asersca皿ing microscope (Zeiss, Gottingen， Germany)对影像进行分析。 其结果如图4b所示，可以在本发明的转基因细胞系中稳定表达的HA-5-HT6R的宿主细胞HEK293细胞系中观察到独自表达Fyn蛋白质的分布。而且，如果阻止HA抗体渗透细胞表面膜，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R。
〈4-2>Fyn过表达之后的分析在含有无血清DMEM培养池的100mm板上把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以1 X 106细胞/孔分注后进行培养，然后以1 : 3的比率把Fyn-pcDNA3. 1 (+)与Lipofectamine 2000投入Opti-MEM培养池并混合5分钟，30分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用匿EM培养池更换培养池，再培养细胞24小时后使Fyn过表达。 之后，为了按照实施例4-1的方法观察整体细胞而添加PBST(PBS+0. 2% TritonX-100) 20分钟并观察整体细胞，或者省略该步骤后观察细胞表面。 其结果如图4c所示，如果阻止HA抗体渗透细胞表面膜，即使Fyn过表达时也没有在细胞膜观察到Fyn而只观察到了 HA-5-HT6R。
〈实施例5>HA-5-HT6R的活性测定
〈5-1>细胞处理条件 在含有无血清DMEM培养池的100mm板上把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表达HA-5-HT6R的细胞系、野生型HEK293细胞系及表达5-HT6R的细胞系以5X 106细胞/孔把单一 96-孔板分成3个区块后分别分注并进行培养。24小时后以1 : 3的重量比把表达6。15蛋白质的载体(Evi Kostenis， Institute forPharmaceutical Biology, Germany)与Lipofectamine 2000加以混合后使上述细胞系发生基因感染，然后在含有1 % FBS的DMEM培养16小时以上。在进行活性检索的前一天，以每孔5乂104的密度把上述基因感染的细胞分注到经过多聚赖氨酸(0. 05mg/ml)处理的96-孔板上。为了抑制受体内化(internalization)而使用了血清饥饿(serum starvation)条件。上述受体内化内化到细胞质内部时，将被分解或非活化而进行受体下调。
〈5-2〉利用FDSS6000测定荧光牵丐 使用高通量细胞筛选器FDSS6000(Hamamatsu Photonics, JP)测定荧光钙。荧光钙标记物使用了对钙浓度敏感的Fluoro-4/AM与0. 001%普朗尼克F-127 (Sigma， USA)。让细胞选择性地暴露于480nm，利用CCD摄像机拍摄通过515nm的放射荧光后得到相关数据。
具体地说，实验当天使用HEPES缓冲溶液把附在96-孔板上的细胞清洗3次，使用溶于HEPES缓冲溶液的4 ii M Fluoro-4/AM与0. 001 %普朗尼克F-127在培养池反应1小时后，利用HEPES缓冲溶液重新清洗2次后，让细胞选择性地暴露于480nm，利用CCD摄像机拍摄通过515nm的放射荧光后得到相关数据。
〈5-3〉调查HA-连接的影响 把实施例5-l中利用表达G。^蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与表达5-HT6R的细胞系分别利用10 y M 5-HT加以处理后，按照实施例4-2的方法测定活性。阴性对照组则是使用仅具备HA标签的空载体进行了转基因的细胞系。F表示480nm的荧光强度，F。表示初始值。 其结果如图5a所示，位于N端的HA-连接没有改变5-HTeR的功能。而且，上述荧光强度变化(F/F。)的平均值如图5b所示，可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系为0. lll士O. 003，表达5-HT6R的细胞系为0. 105±0. 003，使用仅具备HA标签的空载体进行了转基因的细胞系则是0. 014±0. 007 (n = 4)。
〈5-4>5-HT浓度-依存活性 针对实施例5-l中利用表达G。w蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系，除了 96-孔板以外，还另外准备了一个可以使5_HT6受体活化的、含
10有不同浓度(10—11 10—5M)的5-HTe受体活性剂的96-孔药物板。大部分的高通量细胞筛选器虽然具备了注入药物时所需要的液体应用系统(Liquid Application system)，但不具备液体吸入系统，把需要检索的5-HT及其它活性剂药物以5倍的高浓度在分别HEPES缓冲溶液制备20iU，在最终体积100iU(粘附状态的培养细胞80+5X 5-HT及其它活性剂药物)稀释1/5后进行测定。最后，以25秒为基准进行测定，在90秒钟的药物处理条件下把5_HT6受体活性剂5-HT在10—1Q 10—SM浓度范围内利用荧光标记染料Fluoro-4以％形式求得5-HTe受体活性的Ca"信号(signal)。把480nm的最大比率值的面积作为100%求得5-HT的活性效果后，得到细胞的浓度-依存性曲线并导出ECs。值(图5c)。此时，对于5-HT的EC5。值使用y/y隨=1/ (l+(K1/2/[5-HT]nH)计算(y隨是最大反应，K1/2是EC5。值，Nh是Hill常数)。 〈5-5>检查稳定表达HA-5-HT6R的细胞系 把实施例5-l中利用表达G。^蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与表达HA-5-HT6R的细胞系(Sl S3)与临时表达HA-5-HT6R的细胞系(Tl T3)分别利用10iiM 5-HT加以处理后，按照实施例4_2的方法测定活性，利用Integration Ratio Max(HamamatsuPhotonics program, JAPAN)计算了细胞内部牵丐流入值(Integrate ratiomax values)。 其结果如图6所示，由于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定地表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系。
0124]IA088981序列表
0125]〈110〉韩国科学技术研究院
0126]〈120>可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系
0127]〈130>IA088981
0128]〈150>KR10-2008-0095258
0129]〈151>2008-09-29
0130]〈160>4
0131]〈170〉Kopatentln 1.71
0132]〈210>1
0133]〈211>21
0134]〈212>DNA
0135]〈213〉人工序列
0136]〈220〉
0137]〈223>HA-5-HT6R正向引物
0138]〈400>1
0139]ccactcttca tgcgggactt c21
0140]〈210>2
0141]〈211>21
0142]〈212>DNA
0143]〈213〉人工序列
0144]〈220〉
〈223>HA-5-HT6R反向引物〈400>2tcagttcgtg gggatgccaa g〈210>3〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉 13肌动蛋白正向引物〈400〉3gtcaccaact gggacgacat g〈210>4〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉 P肌动蛋白反向引物〈400>4gccgtcaggc agctcgtagc
权利要求
一种细胞系，含有N端连接HA的5-HT6R基因构建体的载体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。
2. 根据权利要求l所述的细胞系，其特征在于上述细胞系以寄托编号 KCLRF-BP-00187寄托。
3. 根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于上述转导可以在下列方法中选择一个 方法后进行在月旨质体、Dojindo公司的Hilymax， Fugene， jetPEI、Effectene及DreamFect 所组成的群中选择某一商业化的转导用试药；利用磷酸钙、正电荷型高分子、微脂粒、纳米 粒子、核转染、电穿孔法、热冲击、磁珠转染的方法；以及利用反转病毒的方法。
4. 根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于上述宿主细胞在HEK293、C0S7、CH0-K1 及CH0-G5A所组成的群中选择。
5. —种5-HTeR配体高效率检索方法，包括下列步骤 步骤l，利用受检化合物处理权利要求1的细胞系； 步骤2，测定上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。
6. 根据权利要求5所述的高效率检索方法，其特征在于权利要求5中步骤1的受检 化合物在天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真 菌的代谢产物及生物活性分子所组成的群中选择一个。
7. 根据权利要求5所述的高效率检索方法，其特征在于测定5-HTeR的活性时，通过上 述5-HT6R测定细胞内部钙浓度流入情形。
8. 根据权利要求7所述的高效率检索方法，其特征在于测定细胞内部钙浓度流入情 形的目标细胞系在进行受检化合物处理之前，先利用可以表达G。w蛋白质的载体与脂质体 进行基因感染。
9. 一种5-HTeR配体高效率检索方法，包括下列步骤 步骤l，利用受检化合物处理权利要求1的细胞系； 步骤2，上述经过处理的细胞系的蛋白质精制步骤； 步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。
10. 根据权利要求9所述的高效率检索方法，其特征在于权利要求9中步骤1的受检 化合物在天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真 菌的代谢产物及生物活性分子所组成的群中选择一个。
11. 根据权利要求9所述的高效率检索方法，其特征在于测定5-HT6R的活性时，测定 上述5-HT6R所磷酸化的ERK。
12. —种5-HT6R配体高效率检索用组成物，其特征在于包含权利要求的细胞系。
13. 根据权利要求12所述的高效率检索用组成物，其特征在于上述细胞系以寄托编 号KCLRF-BP-00187寄托。
14. 根据权利要求12所述的高效率检索用组成物，其特征在于上述组成物另外包括 可以表达G。w蛋白质的载体、脂质体，荧光钙标记物及洗涤缓冲溶液。
全文摘要
本发明涉及一种5-羟色胺6受体配体的高效率检索方法，尤其是一种利用可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-羟色胺6受体配体高效率检索方法。本发明的细胞系可稳定地表达HA-5-HT6R，因此有效地提高了针对选择性地作用于5-HT6R的配体的检索效率，可以对结合5-HT6R的蛋白质的研究做出贡献。本发明可以有效地预防及诊断出5-HT6R相关抑郁症、阿尔茨海默之类的脑疾病及精神疾病，进而开发出其治疗剂。
文档编号G01N33/50GK101712950SQ20081018254
公开日2010年5月26日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年9月29日
发明者尹炯文, 崔己贤, 文东民, 林惠媛 申请人:韩国科学技术研究院