5-羟色胺受体的转基因昆虫及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明的5HT4R蛋白能够显著延长果蝇的寿命，并具备降低Aβ蛋白毒性的功能，进而首次制备了5HT4R转基因果蝇。本发明的5HT4R转基因果蝇可用于筛选5HT4R调控剂；进而筛选预防或治疗阿尔茨海默症、厌食症与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的药物；而5HT4R蛋白可以制备预防或治疗阿尔茨海默症、厌食症与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的药物以及延长动物寿命的药物或食物或保健品。
【专利说明】5-羟色胺受体的转基因昆虫及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】。更具体地说，本发明涉及5-羟色胺受体（5-HT4R)转 基因昆虫及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 5-轻色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT)，又名血清素（Serotonin)。5-轻色胺作 为一种神经递质和血管活性物质，广泛分布于中枢神经系统和周围组织中，在痛觉调节，感 觉运动，心血管功能以及呼吸，睡眠，食欲等方面发挥重要作用[1]。5-HT作为神经递质主 要分布于松果体和下丘脑，可能参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节。中枢神经系统中 5-HT含量及功能异常可能与精神病和偏头痛等多种疾病的发病有关。目前人类5-HT受体 (5-HTR)至少存在7种类型，且大多已被克隆；这7种类型又可进一步分成若干亚型。在目 前所克隆的5-HTR中除5-HT3R属配体门控离子通道族外，其余均为G-蛋白偶联受体超家 族。5-HT通过激动不同的5-HT受体亚型产生不同的药理作用[2]。
[0003] 多数人类5-HT受体在中枢神经系统中较为丰富，参与多种精神活动的调节，与精 神疾病的关系较为密切。其中，5-HT 4受体（5-HT4R)与大脑的许多生理功能相关，包括学习， 记忆，进食，情绪行为与肠道运动。5-HT4受体，是5-HT受体中研究药物靶点与信号传导相 关的热点。目前已经有以5-HT 4受体为靶点的药物主要集中在老年痴呆症（AD)，厌食症与 抑郁障碍相关的进食疾病上[3]。5-HT4受体激动剂还有望成为胃肠道疾病，特别是治疗慢 性特发性疾病的理想药物。比如，西沙必利可以抑制hERG通道[4]，普卢卡必利也刚上市
[5]。而对5-HT4配体的研究在老年痴呆症中也进入了临床II b阶段[6]，同时其他两类精 神疾病，比如抑郁和进食障碍也受5-HT4受体信号的调节[7]。另外，选择性的5-HT4受体 的部分激动剂，RS67333抑制原代大脑皮质神经元中Αβ的产生[8]。赛诺菲的两个5-HT4 受体的部分激动剂，SL65. 0155与VRX-03011进入了治疗AD的临床II期[9]。最近研究发 现，5-ΗΤ4受体的拮抗剂可能是治疗厌食症的有效药物。对肥胖小鼠（ob/ob) 口服5-ΗΤ4受 体的部分激动剂，枸橼酸莫沙比利，可增加其进食。目前，5-HT4受体与压力诱导的多食和成 瘾药物的相关机制的研究都取得了一定的进展。5-HT4受体还与重度抑郁和躁郁症都高度 相关，死后脑中也发现5-HT4表达水平的变化[7]。5-HT非肾上腺素再摄取的抑制剂是目 前抗抑郁药物的主要来源，特别是5-HT再摄取的抑制剂（SSRI)。5-HT4受体激动剂可以作 为抗抑郁药物而弥补SSRI的滞后性。
[0004] 果蝇是生物科学领域重要的模式生物之一，被用于研究多种人类疾病的机理，如 癌症、心血管疾病以及多种神经系统疾病。在以果蝇为模型的生命科学研究中，果蝇的行 为，尤其是运动能力是重要的检测指标之一。这一检测数据可被广泛用于评估基因型及环 境对果蝇的影响。
[0005] 因此，本领域急需能用于研究5-HT4受体功能，进而可用于相关药物筛选的转基 因果蝇。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种5HT4R转基因果蝇及其制备方法，所述转基因果蝇可 用于用于筛选5HT4R调控剂，进而筛选预防或治疗阿尔茨海默症、厌食症与抑郁障碍、胃肠 道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的药物。
[0007] 本发明还有一目的在于提供一些5HT4R蛋白，所述蛋白能够显著延长果蝇的寿 命，并具备降低Αβ蛋白毒性的功能，进而可以用于制备预防或治疗阿尔茨海默症、厌食症 与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的药物以及延长动物寿命的药物或 食物或保健品。
[0008] 在第一方面，本发明提供一种5-HT4R转基因昆虫模型的制备方法，所述方法包括 以下步骤：
[0009] (1)提供昆虫细胞，将5-HT4R基因导入所述昆虫细胞；
[0010] ⑵将导入所述5-HT4R基因的昆虫细胞再生成昆虫，从而得到5HT4R转基因昆虫 模型。
[0011] 在优选的实施方式中，所述5-HT4R基因是：
[0012] (i)具有SEQ ID Ν0:4_6所示序列的多核苷酸；或
[0013] (ii)具有与SEQ ID Ν0:4-6所示序列互补的多核苷酸。
[0014] 在优选的实施方式中，所述昆虫是果蝇、家蚕、蜜蜂、蛾，蚊，螟蛉虫；优选果蝇。
[0015] 在第二方面，本发明提供本发明第一方面所制备的转基因昆虫模型的用途，所述 转基因昆虫模型用于筛选5HT4R调控剂。
[0016] 在优选的实施方式中，所述5HT4R调控剂是5-HT4R激动剂；优选地，所述5-HT4R 激动剂是阿尔茨海默症、厌食症与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的 治疗药物。
[0017] 在优选的实施方式中，所述昆虫是果蝇、家蚕、蜜蜂、蛾，蚊，螟蛉虫；优选果蝇。
[0018] 在第三方面，本发明提供一种5-HT4R调控剂的筛选方法，所述方法包括以下步 骤：
[0019] (1)将待测物质施用于本发明第一方面所制备的转基因昆虫模型；和
[0020] (2)检测所述转基因昆虫的寿命；
[0021] 如果与未施用待测物质的对照转基因昆虫模型相比，施用待测物质的转基因昆虫 模型的寿命延长，则判断所述待测物质是5-HT4R调控剂。
[0022] 在优选的实施方式中，所述5-HT4R调控剂是5-HT4R激动剂。
[0023] 在优选的实施方式中，所述昆虫是果蝇、家蚕、蜜蜂、蛾，蚊，螟蛉虫；优选果蝇。
[0024] 在第四方面，本发明提供一种治疗阿尔茨海默症药物的筛选方法，所述方法包括 以下步骤：
[0025] (1)将待测物质施用于本发明第一方面所制备的转基因昆虫模型与阿尔茨海默症 模型昆虫杂交后代；和
[0026] (2)检测所述杂交后代的寿命；
[0027] 如果与未施用待测物质的转基因昆虫模型与阿尔茨海默症模型昆虫杂交后代相 t匕，施用待测物质后所述杂交后代的寿命延长，则判断所述待测物质可用于制备治疗阿尔 茨海默症药物。
[0028] 在第五方面，本发明提供5-HT4R蛋白或其编码基因的用途，所述蛋白或其编码基 因用于制备预防或治疗阿尔茨海默症、厌食症与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑 郁和躁郁症的药物。
[0029] 在优选的实施方式中，所述5-HT4R蛋白是5-HT4G蛋白或5-HT4B蛋白，所述蛋白 或其编码基因具备以下特征：
[0030] 所述5-HT4G蛋白或5-HT4B蛋白是：⑴具有SEQ ID N0:1-2所示氨基酸序列的 蛋白；或（ii)由SEQ ID N0:1-2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失 或添加而形成的且具有5-HT4R蛋白功能的由（i)衍生的多肽；或
[0031] 所述5-HT4G蛋白或5-HT4B蛋白的编码基因是：⑴具有SEQ ID N0:4-5所示序 列的多核苷酸；或（ii)具有与SEQ ID N0:4-5所示序列互补的多核苷酸。
[0032] 在优选的实施方式中，所述药物是Α β蛋白减毒剂。
[0033] 在第六方面，本发明提供5-HT4D蛋白或其编码基因的用途，所述5-HT4D蛋白或其 编码基因用于制备延长动物寿命的药物或食物或保健品。
[0034] 在优选的实施方式中，所述5-HT4D蛋白或其编码基因具有以下特征：
[0035] 所述是5-HT4D蛋白是：⑴具有SEQIDN0:3所示氨基酸序列的蛋白 ；或（ii)由 SEQ ID Ν0:3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且 具有5-HT4D蛋白功能的由（i)衍生的多肽；或
[0036] 所述5-HT4D蛋白的编码基因是：⑴具有SEQ ID N0:6所示序列的多核苷酸；或 (ii)具有与SEQ ID N0:6所示序列互补的多核苷酸。
[0037] 在优选的实施方式中，所述动物是哺乳动物、灵长类动物、啮齿类动物、昆虫。
[0038] 在进一步的优选实施方式中，所述动物是：家养动物，例如家猫、家兔、狗等；人、 猴、猩猩；竞技动物，如赛马；畜牧业动物，例如牛、猪、山羊、绵羊；家禽，如鸡、鸭；有经济价 值的昆虫，例如家蚕、蜜蜂、果蝇。
[0039] 在第七方面，本发明提供一种遗传构建物，所述遗传构建物包含5-HT4R转基因。
[0040] 在优选的实施方式中，所述5-HT4R基因是：
[0041] (i)具有SEQ ID N0:4_6所示序列的多核苷酸；或
[0042] (ii)具有与SEQ ID N0:4-6所示序列互补的多核苷酸。
[0043] 在第八方面，本发明提供一种动物细胞，所述动物细胞包含本发明第七方面所述 的遗传构建物。
[0044] 在优选的实施方式中，所述动物细胞是昆虫细胞，更优选果蝇细胞。
[0045] 在优选的实施方式中，所述动物细胞是非生殖细胞，优选体细胞。
[0046] 在第九方面，本发明提供本发明第七方面所述遗传构建物的用途，所述遗传构建 物用于制备转基因昆虫模型。
[0047] 在优选的实施方式中，所述昆虫是果蝇、家蚕、蜜蜂、蛾，蚊，螟蛉虫；优选果蝇。
[0048] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1. 5-HT4受体依赖于Gs的信号途径与独立于Gs信号途径和脱敏过程。
[0050] 图2.人源5-HT4受体的11种不同剪切变体。
[0051] 图3.果蝇前脑（左侧）和后脑（右侧）内显现血清素免疫反应的细胞群。
[0052] 图4.转基因果蝇的构建过程。
[0053] 图 5. 5HT4R 转基因（5HT4B，5HT4D，5HT4G)果蝇品系的 PCR 鉴定。
[0054] 图6. 5HT4R(5HT4B，5HT4D3个，5HT4G)转基因果蝇基础与表达后的寿命实验，以 cs，elav-cs为对照果蝇。
[0055] 图7. 5HT4R(5HT4B，5HT4D3个，5HT4G)转基因果蝇表达后的爬管实验，以elav-cs 为对照果蝇。
[0056] 图8. 5HT4R表达的果蝇（elav-5HT4R)进行5HT4R激动剂（SL65. 0155)加药的寿 命实验，以野生型果蝇（elav-cs)为对照果蝇。以H20为加药对照，加药浓度分别为10nM、 100nM、1000nM。
[0057] 图9. 5HT4R表达的果蝇（elav-5HT4R)进行5HT4R拮抗剂（RS23597-190)加药的寿 命实验，，以野生型果蝇（elav-cs)为对照果蝇。以H20为加药对照，加药浓度分别为luM、 3uM、10uM。
[0058] 图1(λ 5HT4R，Α β和5HT4R，APP/BACE果蝇品系的构建过程。其中B1和cyo是II 染色体上的平衡致死系，TM6B是III染色体上的平衡致死系，alz8是II染色体上的Αβ基 因，APP-BACE是III染色体上ΑΡΡ和BACE重组的基因。
[0059] 图11. 5ΗΤ4Β，Α β共表达果蝇和5HT4D，Α β的寿命实验和爬管实验，并以野生型果 蝇（elav-cs)与Αβ表达的果蝇（elav_alz3)为对照组。
[0060] 图12. 5HT4B，APP/BACE共表达果蝇和5HT4D，APP/BACE的寿命实验和爬管实验， 并以野生型果蝇（elav-cs)与APP/BACE表达的果蝇（elav-APP;BACE)为对照组。
【具体实施方式】
[0061] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将5-HT4受体基因导入果蝇制得 的转基因果蝇的寿命得到延长，而5HTR激动剂对转基因果蝇的寿命也有显著延长作用， 而5-HT4R基因表达对于Αβ蛋白有明显减毒作用，因此，本发明的转基因果蝇可用于筛选 5-HTR激动剂，而相应的5-HT4R蛋白或基因可用于改善阿尔茨海默病或延长动物的寿命。 在此基础上完成了本发明。
[0062] 5-ΗΤ4 受体
[0063] 在本文中，"5-ΗΤ4受体"与"5-HT4R"具有相同的意义，二者均表示第四类型的 5_羟色胺受体。同样，在本文中，" 5-HT4R基因"表示编码5-ΗΤ4受体的基因。
[0064] 5-ΗΤ4受体可以通过多种G蛋白，Gs，G13，Gq与Gi引发信号通路。目前，有研究表 明5-HT 4受体还可以介导独立于G蛋白的通路，首先是激活ERK的磷酸化（非经典的G蛋 白信号），激活非受体的酪氨酸激酶Src (图1)。这个通路并不是细胞特异性的，在HEK293 细胞，神经元与表皮细胞系中都发生。在肠上皮细胞中，5-HT4介导的Src激活，进一步激活 PLC Y1通路，抑制Na+/H+交换。而5-HT4受体是受GRK5负调节的：β -arrestinl与分布在 受体C末端磷酸化的丝氨酸/苏氨酸束相互作用；GRK5调节β -arrestinl的磷酸化，阻止 Ser的激活[10]。
[0065] 5-HT4R基因通过mRNA的选择性剪切在人和猪中产生至少11种的C末端变体： h5-HT4(a)、h5-HT4(b)、2 种 h5-HT4(c)、h5-HT4(d)、h5-HT4(e)、h5-HT4(f)、h5-HT4(g)[先 前称为（e)]、h5-HT4(i)、h5-HT4(h)和 h5-HT4(n)(图 2) [11]，在小鼠中有 4种。h5-HT4(a)、 h5-HT4(b)、2种h5-HT4(c)、h5-HT4(g)都表达在心脏，脑与肠道中。而膀胱和肾脏分别表 达的受体亚型h5-HT4(a)、h5-HT4(a)与h5-HT4(b)。h5-HT4(d)只表达在肠道中，而肺中未 检测到任一种h5-HT4变体（表1)。因此，本文所用的术语"5-HT4G"、"5-HT4B"、"5-HT4D" 基因分别表示G、B和D亚型的5-HT4R基因。本文所用的术语"5-HT4G蛋白"、"5-HT4B蛋 白"和"5-HT4D蛋白"分别表示G、B和D亚型的5-HT4受体蛋白
[0066] 大多数剪切变体都发生在紧接着358位点亮氨酸之后的C末端。然而，h5_HT4(h) 发生在第二个胞外结构域，并包含有b变体的尾端。人5-HT4受体剪切变体的组织特异性 分布见下表1。
[0067] 表1.人5-HT4受体剪切变体的组织特异性分布
[0068]
【权利要求】
1. 一种5-HT4R转基因昆虫模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 提供昆虫细胞，将5-HT4R基因导入所述昆虫细胞； (2) 将导入所述5-HT4R基因的昆虫细胞再生成昆虫，从而得到5HT4R转基因昆虫模型。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5-HT4R基因是： (i) 具有SEQ ID N0:4-6所示序列的多核苷酸；或 (ii) 具有与SEQ ID N0:4-6所示序列互补的多核苷酸。
3. 权利要求1或2所制备的转基因昆虫模型的用途，其特征在于，用于筛选5HT4R调控 剂。
4. 一种5-HT4R调控剂的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将待测物质施用于权利要求1或2所制备的转基因昆虫模型；和 (2) 检测所述转基因昆虫的寿命； 如果与未施用待测物质的对照转基因昆虫模型相比，施用待测物质的转基因昆虫模型 的寿命延长，则判断所述待测物质是5-HT4R调控剂。
5. -种治疗阿尔茨海默症药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将待测物质施用于权利要求1或2所制备的转基因昆虫模型与阿尔茨海默症模型 昆虫杂交后代；和 (2) 检测所述杂交后代的寿命； 如果与未施用待测物质的转基因昆虫模型与阿尔茨海默症模型昆虫杂交后代相比，施 用待测物质后所述杂交后代的寿命延长，则判断所述待测物质可用于制备治疗阿尔茨海默 症药物。 6. 5-HT4R蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗阿尔茨海默症、 厌食症与抑郁障碍、胃肠道疾病、改善记忆、重度抑郁和躁郁症的药物。
7. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述5-HT4R蛋白是5-HT4G蛋白或5-HT4B 蛋白，所述蛋白或其编码基因具备以下特征： 所述5-HT4G蛋白或5-HT4B蛋白是：（i)具有SEQ ID NO: 1-2所示氨基酸序列的蛋白； 或（ii)由SEQ ID NO: 1-2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有5-HT4R蛋白功能的由（i)衍生的多肽；或 所述5-HT4G蛋白或5-HT4B蛋白的编码基因是：（i)具有SEQ ID N0:4-5所示序列的 多核苷酸；或（ii)具有与SEQ ID N0:4-5所示序列互补的多核苷酸。 8. 5-HT4D蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备延长动物寿命的药物或食 物或保健品。
9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述5-HT4D蛋白或其编码基因具有以下特 征： 所述是5-HT4D蛋白是：（i)具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的蛋白；或（ii)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有 5-HT4D蛋白功能的由（i)衍生的多肽；或 所述5-HT4D蛋白的编码基因是：（i)具有SEQ ID N0:6所示序列的多核苷酸；或（ii) 具有与SEQ ID N0:6所示序列互补的多核苷酸。
【文档编号】A61K49/00GK104099337SQ201310111941
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】裴钢, 陈淑姣, 赵简 申请人:中国科学院上海生命科学研究院