一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物的制作方法

一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物。所述的恶性肿瘤治疗性疫苗为将人肿瘤组织的癌细胞通过培养得到肿瘤细胞系，将TGF-β2反义质粒转染到肿瘤细胞系中，所述的肿瘤细胞系经灭活后得到恶性肿瘤治疗性疫苗。本发明还涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，组合物包括所述的恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂。本发明的恶性肿瘤治疗性疫苗可用于治疗该肿瘤细胞来源的病人，从而具有免疫抗原特异性强、可反复多次制备使用、价格低廉的优势；也可制备成疫苗制剂，用于治疗其他的同种癌症的病人。经动物实验证实，具有良好的治疗效果。
【专利说明】一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物。

【背景技术】
[0002] 目前，恶性肿瘤依然是威胁人类生存的头号杀手，严重干扰患者的健康和影响生 存质量，其治疗方法主要有手术、化疗、放疗与生物治疗四种模式。虽然用手术、化疗及疗常 规治疗可以清除大部分肿瘤细胞并能使多数患者的病情得到缓解，但化疗、放疗大都对患 者存在着严重的毒副作用。且这些治疗方法达不到完全根除癌细胞的效果，大多数病人最 终死于肿瘤的复发。因此继手术、化疗、放疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手 段。当前，肿瘤生物治疗策略主要有细胞因子疗法、细胞疗法、基因治疗、靶向治疗等。但目 前大多数生物治疗的有效性还远未达到令人满意的程度，其主要原因是这些治疗不能有效 地激活免疫系统清除肿瘤细胞。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，肿瘤疫苗成为 研究的热点之一，其原理是通过激活患者自身免疫系统，以达到清除或控制肿瘤的目的。现 阶段研究较多的肿瘤疫苗有肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、以DC (树突状细胞）为基础的疫 苗以及核酸疫苗等。尽管现有疫苗表现出一定的抗肿瘤效应，但存在疗效不强、安全性差等 缺点，因此，如何克服免疫系统对肿瘤抗原的免疫逃逸，研制出提呈免疫原性强、有效阻断 免疫逃逸、激发机体强大免疫吞噬功能且副作用小，临床疗效满意的肿瘤疫苗是其能否取 得成功的关键。
[0003] 免疫增强剂（immunopotentiator)是通过不同方式，达到增强机体免疫力的一类 免疫治疗药物。临床上常用于治疗与免疫功能低下有关的疾病及免疫缺陷病。目前针对免 疫增强剂的研究很多。
[0004] 现代药理学研究表明，药物加工到纳米水平之后，可显著提高吸收度、扩散度，有 利于降低药物的某些副作用，提高药效。通常微生物细胞的破碎技术为机械法、非机械法两 种。机械法包括：高压匀浆器、高速珠磨机、超声波震荡器，非机械法包括化学法、酶解法、渗 透压冲击法、冻融法和干燥法。虽然细胞破碎的方法很多，但都难以将细胞破碎到粒度均一 的纳米水平。将药物加工到其粒度绝大部分都小于500nm从技术角度讲是难于实现的。
[0005] 转化生长因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )是一组具有多重作 用的调节蛋白，具有调节细胞增长、协助肿瘤细胞免疫逃逸的作用。转化生长因子β-2是 TGF-β家族里最主要的亚型。通常情况下，癌症病人的免疫抑制中多伴有TGF-β 2水平的 提高，TGF-β 2水平与癌症病人的预后也有密切关系。TGF-β 2对天然杀伤细胞、淋巴细胞 激活细胞、树突细胞具有拮抗作用。肿瘤细胞性疫苗有助于增强机体对肿瘤相关抗原的提 呈作用，加强机体对肿瘤细胞的清除。
[0006] RNA干扰现象是由FIRE等在1998年首先发现的，是指通过正、反义RNA片段形成 双链RNA，从而特异性地抑制靶基因转录后表达的现象。作为高效、特异的调节基因表达的 技术，RNA干扰已成为基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系研究的有力工具。抑 制TGF-β 2的表达可以逆转肿瘤的免疫逃逸。
[0007] 为此，本发明提出一种恶性肿瘤治疗性疫苗及其组合物。


【发明内容】

[0008] 本发明的首要发明目的在于提出了一种恶性肿瘤治疗性疫苗。
[0009] 本发明的第二发明目的在于提出了一种恶性肿瘤治疗性疫苗组合物。
[0010] 为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
[0011] 本发明涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗，该恶性肿瘤治疗性疫苗为将人肿瘤组织的 癌细胞通过培养得到肿瘤细胞系，将TGF-β 2反义质粒转染到肿瘤细胞系中，所述的肿瘤 细胞系经灭活后得到恶性肿瘤治疗性疫苗。
[0012] 本发明的第一优选技术方案为：所述的TGF- β 2的cDNA为：NCBI Reference Sequence:NM_003238. 3,片段 1369bp-2613bp。
[0013] 本发明的第二优选技术方案为：人肿瘤组织的癌细胞选自肺癌肿瘤细胞、肝癌肿 瘤细胞、卵巢癌肿瘤细胞、乳腺癌肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、胰腺癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细 胞、食道癌细胞、子宫颈癌细胞或子宫内膜癌细胞。
[0014] 本发明的第三优选技术方案为：所述的制备方法包括以下步骤：
[0015] (1)制备人TGF-3 2反义质粒：
[0016] (2)将人肿瘤组织切碎，消化，培养得到肿瘤细胞系；
[0017] (3)将人TGF-β 2反义质粒转染至培养得到的肿瘤细胞系中；
[0018] (4)继续传代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，分装冻存。
[0019] 本发明还涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，所述的组合物包括权利要求1所 述的恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂。
[0020] 本发明恶性肿瘤治疗性疫苗组合物的第一优选技术方案为：所述的免疫增强剂选 自：短棒状杆菌制剂，无细胞短棒状杆菌制剂，卡介菌多糖、核酸制剂，红色诺卡氏菌细胞壁 骨架制剂，A群链球菌制剂，无细胞A群链球菌制剂，绿脓杆菌制剂，无细胞绿脓杆菌制剂， 布氏菌制剂，无细胞布氏菌制剂，无细胞母牛分枝杆菌制剂，无细胞耻垢分支杆菌制剂，胸 腺肽制剂，左旋咪唑制剂，霍乱霉素 B亚单位制剂，白细胞介素 IL-1制剂，白细胞介素 IL-2 制剂，白细胞介素 IL-12制剂，白细胞介素 IL-3制剂，白细胞介素 IL-4制剂，白细胞介素 IL-6制剂，白细胞介素 IL-11制剂，白细胞介素 IL-15制剂，白细胞介素 IL-18制剂，白细 胞介素 IL-21制剂，白细胞介素 IL-23制剂，热休克蛋白制剂，CpG寡脱氧核苷酸制剂，冻干 卡介苗胞壁匀浆制剂，灭活草分歧杆菌制剂，铜绿假单胞菌MSHA菌毛株菌苗（PA-MSHA菌 苗)，乌苯美司，必思添，多价细菌溶解产物，干扰素 IFN-α制剂，干扰素 IFN-β制剂，干扰 素 IFN-γ制剂，细胞集落刺激因子GM-CSF，细胞集落刺激因子M-CSF，转移因子制剂。
[0021] 本发明恶性肿瘤治疗性疫苗组合物的第二优选技术方案为：所述的免疫增强剂选 自：无细胞短棒状杆菌制剂、无细胞A群链球菌制剂、无细胞绿脓杆菌制剂、无细胞布氏菌 制齐U，无细胞母牛分枝杆菌制剂，无细胞耻垢分支杆菌制剂；优选无细胞短棒状杆菌制剂。
[0022] 本发明恶性肿瘤治疗性疫苗组合物的第三优选技术方案为：所述的组合物中含有 恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂分别分装后合并包装，恶性肿瘤治疗性疫苗组合物。
[0023] 本发明恶性肿瘤治疗性疫苗组合物的第四优选技术方案为：所述的组合物中含有 恶性肿瘤治疗性疫苗1X 1〇7?1X 1〇8细胞，免疫增强剂〇. 5?5. Omg。
[0024] 本发明恶性肿瘤治疗性疫苗组合物的第五优选技术方案为：所述的组合物中含有 恶性肿瘤治疗性疫苗1X 1〇7?5 X 107细胞，免疫增强剂0. 5?2. 5mg。
[0025] 本发明的肿瘤治疗性疫苗可用于静脉、皮下或皮内注射，剂量为1 X107?5X107 细胞，用法为每10?60天注射一次。
[0026] 本发明的恶性肿瘤治疗性疫苗可用于治疗该肿瘤细胞来源的病人，从而具有免疫 抗原特异性强、可反复多次制备使用、价格低廉的优势；也可制备成疫苗制剂，用于治疗其 他的同种癌症的病人。本发明的经转染有人TGF-β 2反义质粒的恶性肿瘤治疗性疫苗可皮 下或静脉注射使用。
[0027] 本发明涉及一种恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，所述的组合物包括本发明所述的恶 性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂，为恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂联合使用。通过动 物实验和临床试验证实，恶性肿瘤治疗性疫苗通过与免疫增强剂的联合使用，其抗肿瘤作 用大大增强。在使用恶性肿瘤治疗性疫苗的同时使用免疫增强剂，免疫增强剂可用于肌肉 注射的方式。本发明的免疫增强剂的无细胞制剂，根据需要，可制成无菌生理盐水的悬浮 制齐U，固体含量为1. 〇mg/ml或2. Omg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂型。本 发明免疫增强剂合适剂量范围为〇. 001?〇. 2mg/Kg体重，优选为0. 01?0. 08mg/Kg体重， 1?7天/次。
[0028] 所述的免疫增强剂选自：短棒状杆菌制剂，无细胞短棒状杆菌制剂，卡介菌多糖、 核酸制剂，红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂，A群链球菌制剂，无细胞A群链球菌制剂，绿脓杆 菌制剂，无细胞绿脓杆菌制剂，布氏菌制剂，无细胞布氏菌制剂，无细胞母牛分枝杆菌制剂， 无细胞耻垢分支杆菌制剂，胸腺肽制剂，左旋咪唑制剂，霍乱霉素 B亚单位制剂，白细胞介 素 IL-1制剂，白细胞介素 IL-2制剂，白细胞介素 IL-12制剂，白细胞介素 IL-3制剂，白细 胞介素 IL-4制剂，白细胞介素 IL-6制剂，白细胞介素 IL-11制剂、热休克蛋白制剂、CpG寡 脱氧核苷酸制剂（CpG-ODN)、冻干卡介苗胞壁匀浆制剂（BCG-CW)、灭活草分歧杆菌制剂、铜 绿假单胞菌MSHA菌毛株菌苗（PA-MSHA菌苗)、乌苯美司（ubenimex)、必思添（biostim)、多 价细菌溶解产物（bacteriallysates，泛福舒)、干扰素 IFN-α制齐[|、干扰素 IFN-β制齐[J、干 扰素 IFN- γ制剂、集落刺激因子制剂、粒细胞集落刺激因子制剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子制剂、转移因子制剂（transfer factor，TF)。所述的转移因子制剂包括正常人自细 胞转移因子和胎盘转移因子(胎盘肽)。
[0029] 随着对肿瘤发病机理的深入认识和分子免疫学理论的发展，非特异性免疫在 抗肿瘤中的作用，越来越被人们所重视。巨噬细胞(ΜΦ )不但在机体非特异性免疫中 起重要作用，而且在特异性免疫中也起着非常重要的作用。单核吞噬细胞系统除具 有吞噬功能，还可发挥抗原递呈（antigen presentation)作用，也属于抗原递呈细胞 (antigen-presentation cell, APC)，可辅助T淋巴细胞活化，并与淋巴细胞相互刺激其功 能，从而放大特异性免疫效应。然而只有活化的ΜΦ才能发挥抗肿瘤效应，且活化的ΜΦ的 抗肿瘤作用具有选择性，即只杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞，其杀伤效应与肿瘤的抗原 结构及瘤细胞增生周期无关，且可杀伤对化疗、放疗呈抗性的肿瘤细胞。
[0030] 免疫增强剂如无细胞短棒状杆菌制剂抗肿瘤作用主要是通过对单核巨噬细胞系 统强大而持久的刺激，引起巨噬细胞（Nhp)增生、活化、吞噬功能增强、诱导分泌肿瘤坏死因 子（TNF-α)、干扰素（IFN-γ)、白细胞介素（IL-2)、活性氧（Η 202、Ν0)等癌细胞杀伤因子及 增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的，且可通过促进造血多能干细胞分 化为单核巨噬细胞，进一步调动机体免疫系统蕴藏抗癌潜力。
[0031] 由于小鼠的TGF-i3 2的基因序列与人TGF-i3 2的基因序列高度同源，所以本发明 亦采用小鼠作为动物模型，进行动物实验，证实本发明的恶性肿瘤治疗性疫苗具有良好的 治疗作用。

【专利附图】

【附图说明】：
[0032] 图1为pIRESpuro3质粒的结构图。
[0033] 本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构 成限制。

【具体实施方式】
[0034] 实施例1 :肺癌疫苗的制备方法：
[0035] 1.人TGF- β 2反义质粒的制备：
[0036] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0037] 2.人肺癌肿瘤组织癌细胞系的制备
[0038] 2. 1切碎组织
[0039] 取人肺癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗2?3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0040] 2. 2 消化
[0041] 冷消化过夜：在切碎的组织中加入0. 25%新鲜配置的胰蛋白酶，摇匀后放4°C过 夜，次日再用PBS洗涤，低转速离心后弃去上清液，洗2?3次；加入少量培养液吹打、分散 制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，未彻底消化的小块组织按上述方法分散处理后制 成细胞悬液，细胞计数后按适当的浓度分瓶培养；
[0042] 2. 3细胞培养
[0043] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的1?^1-1640全培养 液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到肺癌肿瘤细胞系；
[0044] 3.转染
[0045] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，IMm MgCl2)中重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0046] 将转化后的细胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后，约 转染后15天左右，继续培养10天后，分装冻存。
[0047] 3.稳定细胞株人TGF-β 2表达水平的检测
[0048] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（PH8. 0, 20MmTris-HCL，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常肺癌细胞株下降超过40%。
[0049] 4.肿瘤疫苗的制备
[0050] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的肺癌肿瘤细胞细胞株，继续传 代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0051] 实施例2 :乳腺癌肿瘤治疗性疫苗的制备
[0052] 1.人TGF- β 2反义质粒的制备：
[0053] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0054] 2.人乳腺肿瘤组织癌细胞系的制备
[0055] 2. 1切碎组织
[0056] 取人乳腺癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0057] 2. 2 消化
[0058] 先热消化后冷消化：将组织块先用胰蛋白酶37°C水浴中消化20min，经洗涤后用 培养液分散制成细胞悬液，未彻底消化的小组织块经洗涤后用胰蛋白酶4°C过夜，次日再提 取细胞分散成细胞悬液，分瓶培养；
[0059] 2. 3细胞培养
[0060] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的1?^1-1640全培养 液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到乳腺癌肿瘤细胞系；
[0061] 3.转染
[0062] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，IMm MgCl2)中重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0063] 将转化后的细胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每2?3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量 后，约转染后15天左右，继续培养5?10天后，分装冻存。
[0064] 3.稳定细胞株人TGF-β 2表达水平的检测
[0065] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（PH8. 0, 20MmTris-HCL，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常乳腺癌细胞株下降超过40%。
[0066] 4.肿瘤疫苗的制备
[0067] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的乳腺癌肿瘤细胞细胞株，继续 传代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0068] 实施例3 :卵巢癌肿瘤治疗性疫苗的制备 [0069] 1.人TGF_@2反义质粒的制备：
[0070] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0071] 2.人卵巢肿瘤组织癌细胞系的制备
[0072] 2. 1切碎组织
[0073] 取人卵巢癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0074] 2. 2 消化
[0075] 先热消化后冷消化：将组织块先用胰蛋白酶37°C水浴中消化20min，经洗涤后用 培养液分散制成细胞悬液，未彻底消化的小组织块经洗涤后用胰蛋白酶4°C过夜，次日再提 取细胞分散成细胞悬液，分瓶培养；
[0076] 2. 3细胞培养
[0077] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的1?^1-1640全培养 液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到卵巢癌肿瘤细胞系；
[0078] 3·转染
[0079] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，lmMMgCl2)中重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0080] 将转化后的细胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每2?3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量 后，约转染后15天左右，继续培养5?10天后，分装冻存。
[0081] 3.稳定细胞株人TGF-β 2表达水平的检测
[0082] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（PH8. 0, 20MmTris-HCl，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常卵巢癌细胞株下降超过40%。
[0083] 4.肿瘤疫苗的制备
[0084] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的卵巢癌肿瘤细胞细胞株，继续 传代扩大培养，收集细胞，用l〇〇Gy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0085] 实施例4 :肝癌疫苗的制备方法：
[0086] 1.人TGF- β 2反义质粒的制备：
[0087] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0088] 2.人肝癌肿瘤组织癌细胞系的制备
[0089] 2. 1切碎组织
[0090] 取人肝癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗2?3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0091] 2. 2 消化
[0092] 冷消化过夜：在切碎的组织中加入0. 25%新鲜配置的胰蛋白酶，摇匀后放4°C过 夜，次日再用PBS洗涤，低转速离心后弃去上清液，洗3次；加入少量培养液吹打、分散制成 细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，未彻底消化的小块组织按上述方法分散处理后制成细 胞悬液，细胞计数后按适当的浓度分瓶培养；
[0093] 2. 3细胞培养
[0094] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的RPMI -1640全培 养液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到肝癌肿瘤系细胞；
[0095] 3.转染
[0096] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，IMm MgCl2)中重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0097] 将转化后的细胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每2?3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量 后，约转染后15天左右，继续培养5-10天后，分装冻存。
[0098] 3.稳定细胞株人TGF-β 2表达水平的检测
[0099] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（PH8. 0, 20MmTris-HCL，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常肝癌细胞株下降超过40%。
[0100] 4.肿瘤疫苗的制备
[0101] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的肝癌肿瘤细胞细胞株，继续传 代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0102] 实施例5 :胃癌疫苗的制备方法：
[0103] 1.人TGF-β 2反义质粒的制备：
[0104] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0105] 2.人胃癌肿瘤组织癌细胞系的制备
[0106] 2. 1切碎组织
[0107] 取人胃癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗2?3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0108] 2. 2 消化
[0109] 冷消化过夜：在切碎的组织中加入0. 25%新鲜配置的胰蛋白酶，摇匀后放4°C过 夜，次日再用PBS洗涤，低转速离心后弃去上清液，洗2?3次；加入少量培养液吹打、分散 制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，未彻底消化的小块组织按上述方法分散处理后制 成细胞悬液，细胞计数后按适当的浓度分瓶培养；
[0110] 2. 3细胞培养
[0111] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的1?^1-1640全培养 液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到胃癌肿瘤系细胞；
[0112] 3.转染
[0113] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，IMm MgCl2)中重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0114] 将转化后的细胞株加入含10μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每2?3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量 后，约转染后15天左右，继续培养5-10天后，分装冻存。
[0115] 3.稳定细胞株人TGF- β 2表达水平的检测
[0116] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（ΡΗ8. 0, 20MmTris-HCL，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常胃癌细胞株下降超过40%。
[0117] 4.肿瘤疫苗的制备
[0118] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的胃癌肿瘤细胞细胞株，继续传 代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0119] 实施例6 :胰腺癌疫苗的制备方法：
[0120] 1.人TGF-β 2反义质粒的制备：
[0121] 将人 TGF-β 2 的 cDNA (NCBI Reference Sequence:ΝΜ_003238· 3，片段 1369bp-2613bp)反方向克隆至pIRESpuro3载体的多克隆位点MCS中，经测序证实。由于 pIRESpur〇3载体含有CMV的启动子和增强子，能在哺乳动物内复制；含有脑炎心肌炎病 毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES)和表达抗噪呤霉素的 基因，能使人TGF-β 2的反义mRNA在细胞内单独表达，且在嘌呤霉素筛选下，只有表达人 TGF-β 2的反义mRNA的细胞才能稳定生长。pIRESpuro3质粒的结构如附图1所示。
[0122] 2.人胰腺癌肿瘤组织癌细胞系的制备
[0123] 2.1切碎组织
[0124] 取人胰腺癌肿瘤组织，充分去除血液、脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用PBS 液清洗2?3次，将组织切成1?2mm左右，用PBS清洗3次；
[0125] 2. 2 消化
[0126] 冷消化过夜：在切碎的组织中加入0. 25%新鲜配置的胰蛋白酶，摇匀后放4°C过 夜，次日再用PBS洗涤，低转速离心后弃去上清液，洗3次；加入少量培养液吹打、分散制成 细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，未彻底消化的小块组织按上述方法分散处理后制成细 胞悬液，细胞计数后按适当的浓度分瓶培养；
[0127] 2. 3细胞培养
[0128] 细胞以5X108?10X108/L细胞浓度，在含有10%胎牛血清的1?^1-1640全培养 液中于37°C，5% C02的恒温培养箱内培养，得到胰腺癌肿瘤系细胞；
[0129] 3.转染
[0130] 将细胞室温下离心（200g，5min)，在电穿孔缓冲液（10%甘油，IMm 1%(：12冲重悬细 胞，浓度调整至2X 106/ml，加入人TGF-β 2反义质粒25ug/ml，将800ul细胞悬液移至4mm 电击杯，电击参数为电压620v，持续时间60us，脉冲次数1次。
[0131] 将转化后的细胞株加入含10 μ g/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI1640/10%胎牛血清培 养基，每3天更换一次新的筛选培养基，直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后，约 转染后15天左右，继续培养5天后，分装冻存。
[0132] 3.稳定细胞株人TGF-β 2表达水平的检测
[0133] 收集人TGF-β 2反义稳定细胞株，加入蛋白裂解液（PH8. 0, 20MmTris-HCL，2%trit on-X-100)裂解细胞，用抗人TGF- β 2抗体进行western blot检测，人TGF- β 2表达水平应 比未转入人TGF-β 2反义质粒的正常胰腺癌细胞株下降超过40%。
[0134] 4.肿瘤疫苗的制备
[0135] 将上述经过鉴定的稳定表达人TGF-β 2反义核酸的胰腺癌肿瘤细胞细胞株，继续 传代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，取1X 107细胞/毫升，分装冻存。
[0136] 实施例7 :无细胞布氏菌制剂的制备
[0137] 一、布氏菌制剂的制备
[0138] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0139] 1.生产用种子：将工作种子批菌种启开后，接种于肝浸液琼脂斜面或其他适宜培 养基上，37°C培养44?48小时为第1代菌种。第1代菌种在2?8°C可以保存15日；将 第1代菌种移种肝琼脂或其他适宜培养基上，放37°C培养44?48小时，为第2代菌种，经 肉眼纯菌检查合格后，用灭菌生理氯化钠溶液洗下菌苔制成悬液。以此作为生产用种子，用 于生产。
[0140] 2.生产用培养基：用肝浸液琼脂培养基。
[0141] 3.菌种接种和培养：于培养基中接种生产用种子后，放37°C培养44?48小时， 肉眼逐瓶检查，有杂菌者废弃。
[0142] 二、无细胞布氏菌制剂的制备
[0143] (1)将所述制剂加热煮沸15分钟得到灭活菌液；
[0144] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在l〇〇〇kgf/ Cm2压力下破碎菌体2次；
[0145] (3)菌体破碎后的悬液经lOOOOrpm离心0. 5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液， 所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤5次；
[0146] (4)无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0147] (5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2°C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0148] 实施例8 :卡介菌多糖、核酸制剂的制备
[0149] 卡介菌多糖、核酸制剂系用卡介菌经热酚法提取多糖、核酸，配以灭菌生理氯化钠 溶液制成，用于预防和治疗慢性支气管炎、感冒、哮喘等疾病。
[0150] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0151] -、卡介菌多糖、核酸制剂的制备
[0152] 来源：采用国家药品管理批准的菌种进行生产，严禁使用通过动物的菌种用于生 产。
[0153] 冻干菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上每传一 次为一代。在马铃薯培养基上培养的菌种放冰箱保存不超过2个月。用于生产的培养物的 总代数不超过12代。
[0154] 菌体收集：培养物应逐瓶检查，若有污染、混浊等情况应废弃。收集马铃薯培养基 内培养物或液体苏通表面培养物，压干，加入适量蒸馏水，以高速粉碎机破碎菌体后备用。
[0155] 提取：取破碎菌悬液与等量热酚混匀，以静置法或离心沉淀菌体，吸取上清，以透 析法除酚，加入适量乙醇沉淀多糖、核酸，收集沉淀物。分别以乙醇、乙醚混匀洗涤，离心后 干燥即得精制多糖、核酸。
[0156] 实施例9 :无细胞A群链球菌制剂的制备
[0157] A群链球菌制剂是由A群链球菌的弱毒菌株经培养、增效及青霉素处理后制成的 冻干品，用于癌性胸水及恶性肿瘤的免疫治疗。
[0158] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0159] -、A群链球菌制剂的制备
[0160] 菌种为CMCC32235株或SIPI722株，接种在Todd-Hewitt肉汤或酵母浸膏或其他 适宜的固体或液体培养基。
[0161] 将工作种子批菌种启开后，接种在适宜的固体或液体培养基上，36±1°C培养，2? 4代扩增，由此制备适宜的工作种子液。
[0162] 菌种接种及培养：采用大瓶或大罐液体培养。于培养基中接种生产用工作种子液 后，在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌应 废弃。
[0163] 采集及处理：正常培养物离心或薄膜过滤，菌体用适量生理氯化钠溶液洗两次，根 据菌体湿重，加入适量的青霉素 G，在660nm处测定A值，计算含量或将菌体悬浮于适量的 BBM溶液中，在660nm处测定A值来计算含量后加入适量青霉素 G。经多步处理后的菌液为 待稀释原液。
[0164] 二、无细胞A群链球菌制剂的制备
[0165] (1)将所述制剂加热煮沸15?60分钟得到灭活菌液；
[0166] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在1500kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
[0167] (3)菌体破碎后的悬液经20000rpm离心10分钟后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液， 所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤4次；
[0168] (4)无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0169] (5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2°C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0170] 实施例10 :红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的制备
[0171] 红色诺卡氏菌细胞壁骨架（N-CWS)系红色诺卡氏菌经发酵、破碎、提取获得细胞壁 骨架，加入适量乳化剂后冻干制成，主要含该菌细胞壁的组份霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘 肽等，用于恶性胸腹水和癌症患者的免疫治疗。
[0172] 一、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的制备
[0173] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0174] 制造用菌种用红色诺卡氏菌P0-8株；
[0175] 生产用培养基：使用葡萄糖-酵母膏培养基。
[0176] 生产用种子：将工作种子批菌种启开后接种在营养琼脂斜面上，28°C培养。2?3 代采用葡萄糖-酵母膏液体振荡培养36小时。纯菌试验无污染杂菌者方可供作种子。
[0177] 接种及培养：在葡萄糖-酵母膏培养液中接种种子液，振荡通气培养5天，在培养 过程中及杀菌前取样涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0178] 菌体收集：收集培养液，离心收获湿菌体。
[0179] 破壁：湿菌体加蒸馏水，以超声波破碎菌体。分别加胰蛋白酶、糜蛋白酶和链蛋白 酶水解16?24小时，离心，获细胞壁粗提物。
[0180] 提取：分别以乙醚-乙醇、氯仿和氯仿-甲醇提取16小时。
[0181] 干燥：溶媒提取后的细胞壁骨架于60°C减压干燥至无溶媒味为止。获得的细胞壁 骨架于玛瑙研钵中研细，得N-CWS原粉。置-20°C干燥保存，有效期为2年。
[0182] 实施例11:无细胞绿脓杆菌制剂的制备
[0183] 本品系绿脓杆菌MSHA菌毛株培养后，取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以PBS稀释成 每lml含菌1. 8X 109制成，用于恶性肿瘤的辅助治疗。
[0184] 一、绿脓杆菌制剂的制备
[0185] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。将工作种子批菌种启开后，接种在营养琼脂或其他适宜培养基，放35?37°C 培养，一般不超过18小时，传代不得超过5代，由此制备适宜数量的生产用工作种子，用于 生产。
[0186] 生产用培养基：用pH7. 2?7. 4的营养琼脂或国家药品管理当局批准的其他培养 基。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏源物质。
[0187] 菌种接种和培养：采用克氏瓶涂种法，置37°C培养18?20小时。在培养过程中 及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，发现污染杂菌应废弃。
[0188] 收获和杀菌：培养结束后于采集的培养物中加入不超过1%甲醛的PBS，加杀菌剂 后的原液放置室温（20?26°C)，维持时间14?16天，离心洗涤后保存于2?8°C。
[0189] 二、无细胞绿脓杆菌制剂的制备
[0190] (1)将所述制剂加热煮沸45分钟得到灭活菌液；
[0191] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在2000kgf/cm 2压力下破碎菌体2次；
[0192] (3)菌体破碎后的悬液经6000rpm离心1. 5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液， 所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤3次；
[0193] (4)无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0194] (5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2°C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0195] 实施例12 :无细胞假单胞菌制剂的制备
[0196] 一、假单胞菌制剂的制备
[0197] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0198] 将工作种子批菌种开启后，接种于肉浸液基础培养基，放30°C培养48小时，传代 不得超过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
[0199] 培养基：肉浸液基础培养基。
[0200] 菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30°C培养72小时。在培养过程和杀菌前 取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0201] 采集和杀菌：培养结束后，刮取菌苔混悬于生理氯化钠溶液的瓶中。将收获的菌悬 液置70°C水浴间歇灭菌2次，每次2小时，然后于3500r/min离心30分钟，并弃上清液，力口 生理氯化钠溶液混悬，菌悬液放2?8°C保存。
[0202] 二、无细胞假单胞菌制剂的制备
[0203] (1)将所述制剂加热煮沸15?60分钟得到灭活菌液；
[0204] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在2000kgf/cm 2压力下破碎菌体2次；
[0205] (3)菌体破碎后的悬液经8000rpm离心1小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所 述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1?5次；
[0206] (4 )无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0207] (5 )将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60 ± 2 °C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0208] 实施例13 :母牛分支杆菌制剂的制备
[0209] -、母牛分支杆菌制剂的制备
[0210] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0211] 将工作种子批菌种开启后，接种于罗氏培养基，放30°C培养48小时，传代不得超 过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
[0212] 培养基：罗氏培养基。
[0213] 菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30°C培养72小时。在培养过程和杀菌前 取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0214] 二、无细胞母牛分支杆菌制剂的制备
[0215] (1)将所述制剂加热煮沸15?60分钟得到灭活菌液；
[0216] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在1600kgf/cm 2压力下破碎菌体2次；
[0217] (3)菌体破碎后的悬液经18000rpm离心1小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所 述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1?5次；
[0218] (4)无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0219] (5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2°C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0220] 实施例14 :耻垢分支杆菌制剂的制备
[0221] 一、耻垢分支杆菌制剂的制备
[0222] 参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以 及其它检定。
[0223] 将工作种子批菌种开启后，接种于罗氏培养基，放30°C培养48小时，传代不得超 过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
[0224] 培养基：罗氏培养基。
[0225] 菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30°C培养72小时。在培养过程和杀菌前 取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0226] 二、无细胞耻垢分支杆菌制剂的制备
[0227] (1)将所述制剂加热煮沸15分钟得到灭活菌液；
[0228] (2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对 撞机在1500kgf/cm 2压力下破碎菌体2次；
[0229] (3)菌体破碎后的悬液经lOOOOrpm离心0. 5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液， 所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤5次；
[0230] (4 )无菌检验（2000版《中国生物制品规程》）及热原检测（2000版《中国人民共和 国药典》)合格后将悬液分装，在60?65°C加热0. 5?2小时加热灭菌，得到所述制剂的无 细胞制剂；
[0231] (5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2°C加热30分钟或121 °C加热 15?30分钟。
[0232] 实施例15:无细胞短棒状杆菌制剂的制备
[0233] 1. CP工作种子批菌种连续2次传代后接种于大瓶或营养罐，在低热原、不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基中37°C培养7天：CP学名为粉刺丙酸杆菌，菌号为65101 (76-27或 7627)、65102 (H-84)或 65103 (77-1 或 771);
[0234] 2.收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15分钟得到菌液：
[0235] 3.无菌试验合格的菌液经洗涤后，用超高压射流对撞机破碎菌体；所述的菌体是 灭活菌，菌体浓度为1〇〇亿/ml ;其中所述菌体破碎是在无菌条件下进行。所述的洗涤是将 沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次；
[0236] 4.菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液：所述的洗涤是将沉 淀物用无菌生理盐水离心洗涤2次；菌体破碎后悬液的离心条件是在4°C、12000rpm离心 50分钟；
[0237] 5.将悬液分装后加热灭菌，65°C加热0.5小时，得到无细胞短棒状杆菌制剂。
[0238] 实施例16:
[0239] 将实施例1制备的肺癌疫苗、实施例13制备的无细胞短棒状杆菌制剂分别分装， 合并包装，制备得到肺癌疫苗加免疫增强剂的组合物。
[0240] 可按照该方法制备各种癌症疫苗与免疫增强剂的组合物。
[0241] 实施例1 :肺癌治疗性疫苗的疫苗动物实验
[0242] 1.制备实验动物
[0243] 1. 13LL细胞的培养
[0244] 小鼠 Lewis肺癌细胞株购自上海市胸科医院胸部肿瘤研究所。
[0245] 用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，加双抗（100U/mL青霉素，lOOyg/ mL链霉素)，置于37°C、5%C02混合气体孵箱中培养，每1-2天换液，每3天传代一次，传代用 0. 25%胰酶消化。取1 X 104细胞接种于24孔板，每24h计数，重复3孔，持续8天，计算每 孔细胞均数，绘制生长曲线。
[0246] 1. 2细胞悬液的制备
[0247] 取对数生长期的小鼠 Lewis肺癌细胞，以0. 25%的胰酶消化，收集细胞，离心去上 清，用无菌生理盐水洗涤两次，将细胞悬浮于生理盐水中，台盼蓝染色细胞活力测定大于 90%，并进行细胞计数，调整细胞浓度分别为1 X 105/mL、1 X 106/mL、1 X 107/mL，立即对小鼠 进行皮下接种及肺原位接种。
[0248] 1. 3实验动物和接种方法
[0249] 实验动物C57BL/6小鼠48只，雌雄各半，8-10周龄，购自北京维通利华实验动物技 术有限公司。采用原位接种法，具体如下：
[0250] (1)分组：将小鼠随机分为3组，每组16只，一组用于定时监测肿瘤形成情况，另 外2组用于肿瘤治疗试验；第1组接种小鼠 Lewis肺癌细胞总数为IX 105。
[0251] (2)麻醉：戊巴比妥钠溶液50mg/kg腹腔内注射，将戊巴比妥钠配成10mg/mL的工 作液，按〇. 〇5mL/10g体重剂量对小鼠进行麻醉。
[0252] (3)接种：小鼠麻醉后，将其仰卧固定在操作台上，对小鼠前胸壁进行酒精消毒， 在左腋前线肋弓上约1. 5cm处作一约5_的小切口，分离皮肤及皮下组织暴露至胸壁，将 50 μ L细胞悬液与50 μ L Matrigel混勻，在快凝固之前以胰岛素注射针将小鼠 Lewis肺癌 细胞与Matrigel混悬液共100 μ L注入小鼠左肺，进针约3mm，注射完后停针5s，拔针后缝 合切口。
[0253] 1. 4移植瘤生长的观察和测量
[0254] 定期观察C57BL/6小鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况，皮下接种组于肿 瘤形成后第3天开始测量肿瘤大小，以游标卡尺测量肿瘤长径及短径，以公式V=a 2b π /2 (a 为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径）计算肿瘤大小。原位移植组分别在接种后第3、6、9、12、20 天，处死2只小鼠，观察肿瘤形成及转移情况。
[0255] 2结果：1X105剂量级的小鼠在第9天解剖时有成瘤迹象，成瘤率均为100%。生存 期为35d。
[0256] 3.治疗
[0257] 按上述方法制备试验动物，采用按照实施例1的方法制备的将人TGF- β 2反义质 粒转染到小鼠 Lewis肺癌细胞，得到肺癌的治疗性疫苗。
[0258] 第一组在原位接种的同时给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注射，剂量在IX 105细胞/ 只，生存期间每周一次，第一组的小鼠平均生存期为86. 3天；
[0259] 第二组与原位接种后2周给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注射，剂量在1 X 105细胞/ 只，生存期间每3天一次，第二组的小鼠平均生存期为73. 3天；
[0260] 由于肿瘤恶流质原因，肿瘤的大小会有所变化，所以对肿瘤体积不做统计。
[0261] 实验例2 :肺癌治疗性疫苗的联合治疗
[0262] 按实验例1的方法制备试验动物，采用实施例1制备的肿瘤治疗性疫苗进行治疗 性试验：
[0263] 第三组在原位接种的同时给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注射，剂量在IX 105细胞/ 只，生存期间每周一次；同时采用免疫增强剂一无细胞短棒状杆菌制剂，0. 5mg/0. lml肌肉 注射，生存期间每周一次。第三组的小鼠平均生存期为128. 3天；
[0264] 第四组与原位接种后2周给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注射，剂量在IX 105细胞/ 只，生存期间每3天一次；同时采用免疫增强剂一无细胞短棒状杆菌制剂，0. 5mg/0. lml肌 肉注射，生存期间每周一次。第三组的小鼠平均生存期为113. 2天；
[0265] 由于肿瘤恶流质原因，肿瘤的大小会有所变化，所以对肿瘤体积不做统计。
[0266] 实施例3 :乳腺癌治疗性疫苗的疫苗动物实验
[0267] 1.材料与方法
[0268] 1. 1雌激素受体（estrogen receptor, ER)免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生 物技术有限公司。
[0269] 1. 2动物：Balb/c小鼠，雌性，6?8周龄，体重18?22g，共30只，购自广东医学 院实验动物中心，饲养于SPF级条件下。分为3组进行实验，每组4只。
[0270] 1. 3细胞起源于Balb/c小鼠的乳腺癌细胞MCF-7,由广东医学院生物化学与分子 生物学研究所保存。
[0271] 1. 4MCF-7细胞株常规培养，每隔2天传代1次，待传代足够数量后取对数生长期细 胞配成细胞悬液，台盼蓝染色，血细胞计数板计数，细胞浓度调至1 X l〇6/ml。在Balb/c小 鼠胸壁5?6肋间或腹壁第4对乳腺处皮下接种肿瘤细胞0. lml，相当于1 X 106细胞/只 小鼠，每天观察肿瘤的生长情况。
[0272] 1. 5按照实施例2的方法制备的将人TGF-β 2反义质粒转染到小鼠乳腺癌细胞 MCF-7得到小鼠的乳腺癌肿瘤治疗性疫苗。
[0273] 2.肿瘤生长情况：乳腺癌细胞接种后10天，在接种部位乳垫处出现肿瘤结节，呈 圆形、椭圆形或分叶状生长，质地较硬。结节渐增大，接种后17天第一组Balb/c小鼠移植 瘤平均体积108. 1mm3。
[0274] 3.治疗
[0275] 按上述方法制备试验动物，采用实施例2制备的肿瘤疫苗进行治疗性试验：
[0276] 第2组在原位接种的同时给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1 X 105细胞/只，每周 一次，接种后17天第2组Balb/c小鼠移植瘤平均体积55. 2mm3。
[0277] 第3组与原位接种后2周给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在IX 105细胞/只，每3 天一次，接种后17天第3组Balb/c小鼠移植瘤平均体积62. 1mm3。
[0278] 实验例4 :乳腺癌治疗性疫苗的联合治疗
[0279] 按实验例3的方法制备试验动物2组，采用实施例2制备的乳腺癌肿瘤疫苗进行 治疗性试验：
[0280] 第4组在原位接种的同时给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1 X 105细胞/只，生存 期间每周一次；同时采用免疫增强剂一无细胞A群链球菌制剂，0. 5mg/0. lml肌肉注射，每 周一次。接种后17天Balb/c小鼠移植瘤平均体积38. 1mm3。
[0281] 第5组与原位接种后2周给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在IX 105细胞/只，生存 期间每3天一次；同时采用免疫增强剂一无细胞A群链球菌制剂，0. 5mg/0. lml肌肉注射， 每周一次。接种后17天Balb/c小鼠移植瘤平均体积44. 1mm3。
[0282] 实验例5 :胃癌肿瘤治疗性疫苗的治疗实验
[0283] 1. 1材料Balb/c小鼠32只，北京维通利华实验动物中心提供，合格证号 SCXK(京）2002-0003。雌性，6?8周龄，体重18?20g，SPF级条件下饲养。小鼠胃癌细 胞MFC，购自中国科学院上海细胞生物研究所。DMEM培养液购自Sigma公司，胎牛血清购自 四季青生物制品有限公司。
[0284] 1.2方法购买的小鼠胃癌细胞MFC皮下接种：接种细胞数为IX 108的鼠第21天 肿瘤组织长至1. 0cm/0. 8cm大小，中央出现出血和坏死，肿瘤组织平均体积为0. 32cm3。
[0285] 3.治疗
[0286] 按上述方法制备试验动物，采用实施例5制备的将人TGF-β 2反义质粒转染到小 鼠胃癌细胞MFC，制备得到的胃癌肿瘤疫苗进行治疗性试验：
[0287] 第2组在皮下接种的同时给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1. 5X 105细胞/只，每 周一次，接种后21天Balb/c小鼠移植瘤平均体积0. 17mm3。
[0288] 第3组与原位接种后2周给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1. 5 X 105细胞/只，每 3天一次，接种后21天Balb/c小鼠移植瘤平均体积0. 20mm3。
[0289] 实验例6 :胃癌治疗性疫苗的联合治疗
[0290] 按上述方法制备试验动物2组，采用实验例6制备的胃癌肿瘤疫苗进行治疗性试 验：
[0291] 第4组在原位接种的同时给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1. 5X 105细胞/只，生 存期间每周一次；同时采用免疫增强剂一无细胞布氏菌制剂，〇. 5mg/0. lml肌肉注射，每周 一次。接种后21天Balb/c小鼠移植瘤平均体积0. 15mm3。
[0292] 第5组与原位接种后2周给予肿瘤疫苗，静脉注射，剂量在1. 5 X 105细胞/只，生 存期间每3天一次；同时采用免疫增强剂一无细胞布氏菌制剂，0. 5mg/0. lml肌肉注射，每 周一次。接种后21天Balb/c小鼠移植瘤平均体积0. 15mm3。
[0293] 实施例7胰腺癌治疗性疫苗的动物实验
[0294] 1.动物模型准备：
[0295] 1. 1实验动物及试剂：
[0296] Balb/c小鼠，体重18?22g，40只，分为4组；小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83购自中 国科学院上海细胞生物研究所。
[0297] 1. 2小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83移植性胰腺癌模型制作：
[0298] 将小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83培养后配成1 X 107/ml，取0. 2mL接种于小鼠皮下， 4wk后成瘤。分别于20、30、40天用游标卡尺测量肿瘤大小。
[0299] 根据公式V=ab2/2计算肿瘤体积[V=肿瘤体积，a=瘤体最长径，b=瘤体最短径]。 肉眼观察肿瘤的转移与腹水产生情况。
[0300] 1. 3.移植瘤体积变化监测
[0301] 接种后第20、30、40天，测量肿瘤体积平均值分别为84. 1±21. 9mm3， 413. 7 ±208. 4mm3, 2187. 3 ±1882. 8mm3。结果显示后者与10d前比较差异均具有统计学意义 (P〈0. 01)。解剖结果发现其中有3只荷瘤Balb/c小鼠的肿瘤内出现液化灶且面积增大，同 时伴有血性腹水。
[0302] 3.治疗
[0303] 按上述方法制备试验动物，采用实施例6的方法将人TGF- β 2反义质粒转染到小 鼠胰腺腺癌细胞MPC-83得到胰腺癌肿瘤治疗性疫苗，进行治疗性试验：
[0304] 第3组在接种小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83的同时给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注 射，剂量在1. 5X 105细胞/只，每周一次，第20、30、40天，测量肿瘤体积平均值分别为 65. 3 ±14. 6mm3, 379. 3 ±164. 8mm3,1068. 7 ±1202. 5mm3。
[0305] 第4组在接种小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83两周后给予肿瘤治疗性疫苗，静脉注 射，剂量在1. 5X 105细胞/只，每3天一次，第20、30、40天，测量肿瘤体积平均值分别为 72. 1± 10. 8mm3, 358. 6 ±143. 2mm3,1308. 5 ±1230. 1mm3。
[0306] 实验例8 :胰腺癌治疗性疫苗的联合治疗
[0307] 按上述方法制备试验动物2组，采用实验例7制备的胰腺癌治疗性疫苗进行治疗 性试验：
[0308] 第3组在接种小鼠胰腺腺癌细胞MPC-83的同时给予治疗性疫苗，静脉注射，剂量 在1. 5 X 105细胞/只，每周一次，同时采用免疫增强剂一无细胞布氏菌制剂，0. 5mg/0. lml 肌肉注射，每周一次。第20、30、40天，测量肿瘤体积平均值分别为45. 7±16. 2mm3， 265. 3 ±134. 9mm3,975. 7 ±838. 4mm3。
[0309] 第4组在接种小鼠胰腺腺癌细胞MPC-832周后给予治疗性疫苗，静脉注射，剂量在 1. 5X 105细胞/只，每3天一次，同时采用免疫增强剂一无细胞布氏菌制剂，0. 5mg/0. lml 肌肉注射，每周一次。第20、30、40天，测量肿瘤体积平均值分别为53. 8±20. 7mm3， 280. 6± 102. 1mm3,1033. 5±954. 1mm3。
【权利要求】
1. 一种恶性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于,所述的恶性肿瘤治疗性疫苗为将人肿瘤组 织的癌细胞通过培养得到肿瘤细胞系，将TGF-β 2反义质粒转染到肿瘤细胞系中，所述的 肿瘤细胞系经灭活后得到恶性肿瘤治疗性疫苗。
2. 根据权利要求1所述的恶性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于，所述的TGF-β 2的cDNA 为：NCBI Reference Sequence:NM_003238. 3,片段 1369bp-2613bp。
3. 根据权利要求1所述的恶性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于，所述的人肿瘤组织的癌 细胞选自肺癌肿瘤细胞、肝癌肿瘤细胞、卵巢癌肿瘤细胞、乳腺癌肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、 胰腺癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细胞、食道癌细胞、子宫颈癌细胞或子宫内膜癌细胞。
4. 根据权利要求1所述的恶性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于，所述的制备方法包括以 下步骤：（1)制备人TGF- β 2反义质粒： (2) 将人肿瘤组织切碎，消化，培养得到肿瘤细胞系； (3) 将人TGF-β 2反义质粒转染至培养得到的肿瘤细胞系中； (4) 继续传代扩大培养，收集细胞，用lOOGy照射后，分装冻存。
5. -种恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求1所述 的恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂。
6. 根据权利要求5所述的所述的恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的免 疫增强剂选自：短棒状杆菌制剂，无细胞短棒状杆菌制剂，卡介菌多糖、核酸制剂，红色诺卡 氏菌细胞壁骨架制剂，A群链球菌制剂，无细胞A群链球菌制剂，绿脓杆菌制剂，无细胞绿脓 杆菌制剂，布氏菌制剂，无细胞布氏菌制剂，无细胞母牛分枝杆菌制剂，无细胞耻垢分支杆 菌制剂，胸腺肽制剂，左旋咪唑制剂，霍乱霉素 B亚单位制剂，白细胞介素 IL-1制剂，白细 胞介素 IL-2制剂，白细胞介素 IL-3制剂，白细胞介素 IL-4制剂，白细胞介素 IL-6制剂，白 细胞介素 IL-11制剂，白细胞介素 IL-12制剂，白细胞介素 IL-15,白细胞介素 IL-18,白细 胞介素 IL-21，白细胞介素 IL-23,热休克蛋白制剂，CpG寡脱氧核苷酸制剂，冻干卡介苗胞 壁匀浆制剂，灭活草分歧杆菌制剂，铜绿假单胞菌MSHA菌毛株菌苗（PA-MSHA菌苗)，乌苯美 司，必思添，多价细菌溶解产物，干扰素 IFN- α制剂，干扰素 IFN- β制剂，干扰素 IFN- γ制 齐U，细胞集落刺激因子GM-CSF，细胞集落刺激因子M-CSF，转移因子制剂。
7. 根据权利要求5所述的所述的恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的免 疫增强剂选自：无细胞短棒状杆菌制剂、无细胞Α群链球菌制剂、无细胞绿脓杆菌制剂、无 细胞布氏菌制剂，无细胞母牛分枝杆菌制剂，无细胞耻垢分支杆菌制剂；优选无细胞短棒状 杆囷制剂。
8. 根据权利要求5所述的恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物中 含有恶性肿瘤治疗性疫苗和免疫增强剂分别分装后合并包装，恶性肿瘤治疗性疫苗组合 物。
9. 根据权利要求5所述的恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物中 含有恶性肿瘤治疗性疫苗1X 1〇7?1X 1〇8细胞，免疫增强剂0. 5?5. Omg。
10. 根据权利要求9所述的恶性肿瘤治疗性疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物中 含有恶性肿瘤治疗性疫苗1X 1〇7?5 X 107细胞，免疫增强剂0. 5?2. 5mg。
【文档编号】A61K39/00GK104096238SQ201310111819
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】熊慧 申请人:熊慧