PPARγ:RXRα异源二聚体激动剂在缓解拉坦前列腺素在临床上的副作用中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了PPARγ:RXRα异源二聚体激动剂在制备用于预防或治疗拉坦前列腺素的施用所引起副作用的药物中的用途，即PPARγ:RXRα异源二聚体激动剂用于缓解拉坦前列腺素对脂肪细胞分化的抑制作用的用途。因此，PPARγ:RXRα异源二聚体激动剂（例如，罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮等）可以用于缓解拉坦前列腺素在临床上应用的副作用。
【专利说明】PPARy :RXRa异源二聚体激动剂在缓解拉坦前列腺素在 临床上的副作用中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物治疗学领域，具体地，涉及PPARY :RXRa异源二聚体激动剂在制 备用于预防或治疗拉坦前列腺素的施用所引起副作用的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 拉坦前列腺素（Latanoprost)是一种新型苯基替代的丙基酯前列腺素 F2 a，属 于前列腺素的衍生物。拉坦前列腺素作为选择性前列腺素 F受体（FP)激动剂，目前在临 床上主要用于开角型青光眼和高眼压症的治疗。然而，拉坦前列腺素长期用药会导致一系 列副作用，包括眼周皮肤和虹膜黑变，睫毛生长增加和眼结膜充血等[Hollo G. The side effects of the prostaglandin analogues. Expert Opin Drug Saf. 2007;6:45 - 52]。除 此之外，长期使用拉坦前列腺素的病人还会出现上眼睑加深的副作用（deepening of the upper eyelid sulcus(DUES))，进一步的研究发现这主要是由于眼眶脂肪细胞萎缩所致， 但具体的机制并不清楚[Park J，Cho HK, Moon JI. Changes to upper eyelid orbital fat from use of topical bimatoprost, travoprost, and latanoprost. Jpn J Ophthalmol. 20 1ljan;55(1):22-7]。
[0003] 维甲酸X受体（RXR)作为核受体蛋白超家族的一员，可以自身形成同源二聚体， 还能够与其他核受体形成异源二聚体行使功能，参与细胞生长分化、代谢调节、形态发生 和胚胎发育等许多重要的生理过程。其中RXR和PPARy所形成的异源二聚体是脂肪细 胞分化的重要调节因子，在脂肪细胞分化的过程中起到非常关键的作用。而该二聚体的 拮抗剂可以抑制脂肪细胞分化，并降低白色脂肪细胞中甘油三酯的含量[J Clin Invest 108:1001-1013, 2001]〇
[0004] 本发明人经随机筛选发现拉坦前列腺素是维甲酸X受体a (retinoid X receptor α，RXR α )的拮抗剂，可以拮抗PPARy : RXR α异源二聚体的转录活性[拉坦前列腺素在治 疗糖尿病和/或高甘油三酯血症及其并发症中的应用，申请号是201210075028. 2的中国发 明专利申请]。
【发明内容】
[0005] 针对上述和其他问题，本发明人进一步深入研究发现，拉坦前列腺素是 PPARY :RXRa异源二聚体的特异性拮抗剂，可以浓度依赖性地抑制脂肪细胞的分化， 而PPARY:RXRa异源二聚体激动剂可以缓解拉坦前列腺素的这种抑制作用。因此， PPARY :RXRa异源二聚体激动剂(例如，罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮等)可以用于缓解拉 坦前列腺素在临床上应用的副作用。
[0006] 因此，本发明的一个目的是提供PPARY :RXRa异源二聚体激动剂在制备用于预 防或治疗拉坦前列腺素的施用所引起的副作用的药物中的用途。
[0007] 本发明中，优选地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括：施用拉坦前列 腺素时造成的眼睑部脂肪细胞萎缩。更优选地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用 包括：施用拉坦前列腺素治疗开角型青光眼或高眼压症时造成的眼睑部脂肪细胞萎缩。
[0008] 本发明中，优选地，所述PPARY :RXRa异源二聚体激动剂可以是目前文献中已报 道的激动剂，例如：罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0009] 本发明中，更优选地，所述PPARy :RXRa异源二聚体激动剂为选自罗格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一种或多种。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含：治疗有效量的拉坦前列腺 素；和治疗有效量的PPARY :RXRa异源二聚体激动剂。
[0011] 本发明中，PPARy :RXR a异源二聚体激动剂能够预防或治疗拉坦前列腺素的施用 所引起副作用，也就是，PPARY :RXRa异源二聚体激动剂能够缓解拉坦前列腺素对脂肪细 胞分化的抑制作用。
[0012] 本发明中，优选地，所述PPARy :RXR a异源二聚体激动剂可以是目前文献中已报 道的激动剂，例如：罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0013] 本发明中，更优选地，所述PPARY :RXRa异源二聚体激动剂为选自罗格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一种或多种。
[0014] 本发明中，优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
[0015] 本发明的再一个目的是提供一种预防或治疗拉坦前列腺素的施用所引起的副作 用的方法，其包括向需要的对象施用治疗有效量的PPARY :RXRa异源二聚体激动剂。
[0016] 本发明中，更优选地，所述PPARy :RXR a异源二聚体激动剂可以是目前文献中已 报道的激动剂，例如：罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0017] 本发明中，优选地，所述PPARY :RXRa异源二聚体激动剂为选自罗格列酮、吡格 列酮和曲格列酮等中的一种或多种。
[0018] 本发明中，术语"有效量"可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。 此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用 的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不 需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。
[0019] 本发明人发现了 PPARY :RXRa异源二聚体激动剂可以缓解拉坦前列腺素对脂肪 细胞分化的抑制作用。该发现对开发缓解开角型青光眼和高眼压症治疗的一线临床药物拉 坦前列腺素的副作用药物有指导意义。本发明人还进一步发现了 PPARY:RXRa异源二聚 体激动剂的新应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1示出了拉坦前列腺素对RXRa :NR的转录激活作用的影响。###. P〈0. 001， ##.P〈0.01，与第一道阴性对照（DMS0组）比较。单因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0021] 图2示出了拉坦前列腺素可以显著地抑制脂肪细胞的分化。
[0022] 图3示出了罗格列酮可以逆转拉坦前列腺素的抑制细胞分化作用。
[0023] 图4示出了拉坦前列腺素可以显著性抑制脂肪酸合成酶（FAS)的mRNA水平。***. P〈0. 001，与第一道阴性对照（DMS0组）比较。单因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0024] 图5示出了罗格列酮可以逆转拉坦前列腺素的抑制脂肪酸合成酶（FAS)mRNA的作 用。P〈0. 001，与第一道溶剂组比较。###. P〈0. 001，与第二道拉坦前列腺素组比较。单 因素方差分析（One-way ANOVA)。
【具体实施方式】
[0025] 在下文中，将通过示例性提出的实施例来更加详细地描述本发明，然而，本发明的 范围并不限于实施例。
[0026] 实施例1 :拉坦前列腺素是PPARy :RXRa异源二聚体的特异性拮抗剂
[0027] 在先前的研究中，本发明人已经发现拉坦前列腺素是维甲酸X受体a (retinoid X rec印tora，RXRa )的拮抗剂，可以拮抗PPARy :RXRa异源二聚体的转录活性[申请号 是201210075028. 2的中国发明专利申请]。
[0028] 进一步地，本发明在细胞水平上通过核受体RXRa :NR (其中，NR表示：FXR、 PPAR a、PPAR δ、LXR a、LXR β 或 RXR a )顺式反应元件（NRE (NRE 表示：FXRE、PPRE、LXRE 或RXRE))调控的荧光素酶报告基因测定的方法测试了拉坦前列腺素对除RXRa :PPARy异 源二聚体以外的RXRa其他同源或异源二聚体的反式激活活性的影响。研究结果表明，拉 坦前列腺素对除RXRa :PPARY异源二聚体以外的RXRa其他的同源或异源二聚体均没有 激动或拮抗作用，因此，拉坦前列腺素是PPARY :RXRa异源二聚体的特异性拮抗剂。
[0029] 1、实验原理：
[0030] 在细胞质中，RXRa与其他核受体或自身形成异源或同源二聚体并招募共激 活因子，然后入核，在其他相关转录因子的协助下作用于靶基因的顺式反应元件上从而 启动该基因的转录。将顺式反应元件（NRE)克隆到pGL3-启动子载体中构建重组载体 pGL3-NRE-Luc，在该重组载体中，萤火虫荧光素酶基因的转录只受到反应元件NRE的控 制。因此，萤火虫荧光素酶的活性就相当于RXRa :NR的反式激活活性。将p⑶NA3. 1-NR， p⑶NA3. 1-RXRa，PGL3-NRE-Luc及内参质粒pRL-SV40共转染到细胞中，通过分别测定萤火 虫荧光素酶及内参荧光素酶活性，二者的比值即表征RXRa :NR的反式激活活性。
[0031] 2、实验材料与方法
[0032] 1)细胞培养：HEK-293细胞(来源：ATCC)在DMEM (Gibco公司）培养基（10%FBS (Gibco公司））中培养(培养条件为37° C，5%C02)。
[0033] 2)瞬时转染及NR顺式反应元件调控的荧光素酶报告基因测定：脂质体转染法 参照Invitrogen公司Lipo2000试剂说明书进行。HEK-293细胞接种在24孔板上，当细 胞生长至50?70%密度时，利用脂质体（Invitrogen公司）瞬时共转染pGL3-NRE-Luc、 pCDNA3. 1-NR、pCDNA3. Ι-RXRa及内参质粒pRL-SV40,转染12小时后将培养基换成DMEM (10%FBS)，同时加化合物（阳性激动剂(剂量见下面说明)，或拉坦前列腺素（20 μ M)，或阳性 激动剂和拉坦前列腺素(剂量同前))或DMS0 (作为阴性对照)孵育18小时，吸去培养基，PBS 洗一次，用Luciferase试剂盒（Promega公司)裂解细胞并测定萤火虫荧光素酶和内参荧光 素酶的活性（Luciferase测定方法参照Promega公司Luciferase试剂盒说明书进行)。本 实验以维 A 酸（retinoic acid(RA，200nM)) (RXR 配体)、T0901317 (LXRa/β 配体，5μΜ)、 6评501516(--八1^配体，1(^]\〇、非诺贝特^611〇打13四七6(--41^配体，1(^]\〇)和0?^ (FXR配体，10 μ Μ)为阳性激动剂（阳性对照)。
[0034] 3)上述所列阳性激动剂和拉坦前列腺素全部购自Sigma公司。
[0035] 4) Luciferase信号检测所用仪器是：TECAN公司的GENios酶标仪。
[0036] 3、实验结果
[0037] 结果如图1所示，与阴性对照DMS0 (溶齐[J)组相比，阳性激动剂可以激动RXR a : NR 的转录活性，而拉坦前列腺素既不能激动RXRa :NR的转录活性，也不能拮抗阳性激动剂对 RXRa :NR的激动作用。
[0038] 实施例2 :罗格列酮可以缓解拉坦前列腺素对3T3-L1脂肪细胞分化的抑制作用
[0039] 本发明在细胞水平测试了拉坦前列腺素对前脂肪细胞分化的影响以及 PPARY:RXRa异源二聚体激动剂罗格列酮对拉坦前列腺素这种作用的影响。实验表明，拉 坦前列腺素能浓度依赖性地抑制脂肪细胞分化，而罗格列酮可以缓解拉坦前列腺素的这种 抑制作用。
[0040] 1、实验材料和方法
[0041] 1) 3T3-L1前脂肪细胞：购自ATCC。
[0042] 2)罗格列酮及分化诱导试剂（IBMX (3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、Dex (地塞米松（Dexamethasone))、膜岛素（insulin)): 购自Sigma公司。
[0043] 3)拉坦前列腺素：购自Sigma公司。
[0044] 4)脂肪细胞分化测定实验方法：将3T3-L1前脂肪细胞铺于细胞培养板，置于 37°C、5%C0 2培养箱中培养，待细胞融合2天后，加含0. 5mM IBMX (3-异丁基-1-甲基黄嘌 呤（3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、1 μ M Dex(地塞米松（Dexamethasone) )、1 μ g/mL 膜 岛素（insulin)的10%FBS的DMEM培养48小时，换以含1 μ g/mL胰岛素的培养液再培养48 小时，随后以加10%FBS的DMEM继续培养，2天换培养液一次。在3T3-L1前脂肪细胞诱导分 化的第1天即加入不同浓度的拉坦前列腺素（1、10、20 μ M)及罗格列酮（10 μ M)，直至实验 结束。然后用油红〇染色法检测细胞分化效率：移去诱导分化7天细胞的培养液，用PBS洗 3次，用10%甲醛固定液固定细胞10分钟，PBS洗3次，然后以油红0染色细胞，倒置显微镜 下观察结果，拍摄照片。
[0045] 2、实验结果：
[0046] 结果如图2和3所示，拉坦前列腺素可以显著地抑制脂肪细胞的分化，而罗格列酮 可以缓解拉坦前列腺素的抑制细胞分化作用。
[0047] 实施例3 :罗格列酮可以缓解拉坦前列腺素对成熟脂肪细胞中脂肪酸合成酶mRNA 水平的抑制作用
[0048] 本发明在细胞水平测试了拉坦前列腺素对分化后脂肪细胞中脂肪酸合成酶（FAS) 的影响以及PPARy :RXRa异源二聚体激动剂罗格列酮对拉坦前列腺素这种作用的影响。 实验表明，拉坦前列腺素能浓度依赖性地抑制分化后脂肪细胞中脂肪酸合成酶（FAS)的 mRNA水平，而罗格列酮可以缓解拉坦前列腺素的这种抑制作用。
[0049] 1、实验材料和方法
[0050] 1) 3T3-L1前脂肪细胞分化：同实施例2。
[0051] 2)罗格列酮：购自Sigma公司。
[0052] 3)拉坦前列腺素：购自Sigma公司。
[0053] 4)脂肪酸合成酶mRNA水平测定实验方法：分化后的3T3-L1脂肪细胞，孵育化合 物(拉坦前列腺素（1、10、20 μ Μ)及罗格列酮（10 μ Μ)) 24小时后，抽提细胞的RNA。方法如 下：处理过的细胞用预冷的PBS洗三遍，加入lmL TRIZOL (Promega公司）裂解细胞5分 钟。加入200yL三氯甲烷并剧烈摇晃15秒后静置3分钟，于4° C以13000rpm转速离 心18分钟，取500 μ L上清。随后加入500 μ L异丙醇上下颠倒混匀，室温静置10分钟。其 后4° C以13000rpm转速离心18分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇清洗一次，再4° C低温以 13000rpm转速离心5分钟，最后弃上清并待沉淀完全干燥。干燥后的沉淀用DEPC水溶解并 测定抽提的总mRNA量。使用反转录试剂盒将1 μ g总mRNA反转录为cDNA (反转录程序为 37° C15分钟；85° C5秒终止反应)。样品cDNA采用SYRB荧光探针试剂盒（TaKaRa公司） 在0pticon2system (MJ公司）上进行实时定量PCR扩增。引物序列如下：
[0054] GAPDH: 5 ' -ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 ' (sense)，
[0055] 5, -TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3，(antisense);
[0056] FAS: 5 ' -GGCTCTATGGATTACCCAAGC-3 '（sense)，
[0057] 5' -CCAGTGTTCGTTCCTCGGA-3' （antisense)。
[0058] 2、实验结果：
[0059] 结果如图4和5所示，拉坦前列腺素能浓度依赖性地抑制分化后脂肪细胞中脂肪 酸合成酶（FAS)的mRNA水平，而罗格列酮可以缓解拉坦前列腺素的这种抑制作用。
[0001] <11〇>屮Η科学院丄海药物研究所 <120〉PPARr:RXRa异源二聚体激动剂在缓解拉圯前列腺?在临Λ上的副作ffl屮的应ffl <130> DI13-038oE-XC37 <160> 4 <170> PatentIn version 3. 3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> GAH)H 引物 <400> 1 acagcaacag ggtggtggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人丨:序列 <220> <223> GAPDH 引物 <400> 2 tttgagggtg cagcgauctt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <523> FAS 引物 <400> 3 ggctctatgg attacccaag c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213>人I :序列 <220> <223> FAS 引物 ；400> 4 (OHgtgttcg ttcctcgga 19
【权利要求】
1. PPARY :RXRa异源二聚体激动剂在制备用于预防或治疗拉坦前列腺素的施用所引 起的副作用的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素时造成的眼睑部脂肪细胞萎缩。
3. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素治疗开角型青光眼或高眼压症时造成的眼睑部脂肪细胞萎缩。
4. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述PPARY:RXRa异源二聚体激动剂为选自罗 格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一种或多种。
5. -种药物组合物，其包含：治疗有效量的拉坦前列腺素；和治疗有效量的 PPARY:RXRa异源二聚体激动剂。
6. 根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述PPAR γ : RXR a异源二聚体激动剂为 选自罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一种或多种。
7. 根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K45/00GK104096232SQ201310111552
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】沈旭, 陈静, 陈莉莉 申请人:中国科学院上海药物研究所