ZEB2基因表达变异在胰腺癌化疗预后诊断中的应用的制作方法

本发明涉及zeb2基因在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途以及zeb2阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途，属于医药生物技术领域。

背景技术：

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。胰腺癌因其恶性程度高，早期诊断困难，预后差成为肿瘤病学的一大挑战。尽管目前临床上将小于2cm的胰腺癌视为早期癌，但此时约有30％～40％的患者已有淋巴结转移。因此，仅根据肿瘤大小对胰腺癌分期有其局限性。关于胰腺癌的高危因素与胰腺癌发病间的关系尚有争议，但对这些人群宜定期b超检查。出现胰腺癌的警报症状，如消瘦、腹泻、消化不良等应高度疑诊胰腺癌。

目前常规的胰腺癌诊断方法包括影像学诊断，比如b超、ct等。肿瘤标志物反映了癌的发生、发展过程及基因激活程度，可在肿瘤宿主的组织、体液及排泄物中检出。有多种胰腺癌肿瘤标志物已用于临床，但其敏感性、特异性尚不理想。常见的标志物癌胚抗原(cea)：在胰腺癌患者血清中有较高的表达率，但其特异性低，其增高也见于肝、结直肠、胃、胆囊癌及非消化道癌。因而限制了其应用价值。另外一个标志物ca19-9：是目前公认的胰腺癌相关肿瘤标志物，常作为标准标志物来判断其他肿瘤标志物对胰腺癌诊断的实用价值，目前巳广泛用于临床。ca19-9诊断胰腺癌的敏感性为69％～93％，特异性为81％～85％。对高危患者可用ca19-9作为筛选检查，其结果优于cea。除胆管癌外，与其他消化道恶性肿瘤均有良好的鉴别诊断意义，而且对早期胰腺癌的诊断亦有一定价值，但是诊断效果还有改进的空间。

zeb2基因在现有技术中分别与其它的小分子一起在乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌和鼻咽癌中均有一定的指示作用，但是在胰腺癌中还没有相关报道。特别是在胰腺癌化疗预后诊断中的应用还没有涉及。

技术实现要素：

zeb2基因表达水平预测胰腺癌患者预后的标志物用途，基于zeb2基因表达水平可以预测胰腺癌患者的预后，zeb2表达水平低的患者预后好，表达水平高的患者预后差。

基于zeb2基因表达水平预测胰腺癌患者预后的检测及应用方法，a.提取肿瘤患者原发癌组织标本的细胞总rna；以rna为模板逆转录合成cdna；以cdna为模板，用zeb2基因和管家基因的特异性引物和荧光标记探针进行实时定量pcr扩增，计算zeb2基因mrna的相对表达量；b.根据胰腺癌患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的zeb2mrna表达量，确定预后判断的临界值。

zeb2mrna表达量低于临界值的患者预后好，而高于临界值的患者预后差。

所述的检测方法，以原发癌组织中zeb2mrna表达量对肿瘤患者预后判断，表达量低的患者则判断为预后好，表达量低高的则判断为预后差。

本发明通过研宄证实zeb2可应用于诊断胰腺癌治疗效果的指标预测预后；zeb2可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。阻断zeb2表达可抑制胰腺肿瘤生长，抑制胰腺肿瘤细胞，可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。

另外，本发明提供一种特异性抑制zeb2基因表达的sirna，其序列如seqidno：1和2所示。

另外，本发明提供一种基因干扰慢病毒载体，为将编码特异性抑制zeb2基因表达的干扰小分子rna的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人zeb2基因小分子干扰rna。

所述慢病毒载体可以选自：plko.1-puro、plko.1-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tgfp、plko.1-cmv-neo、plko.1-neo、plko.1-neo-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tagcfp、plko.1-puro-cmv-tagyfp、plko.1-puro-cmv-tagrfp、plko.1-puro-cmv-tagfp635、plko.1-puro-ubc-turbogfp、plko.1-puro-ubc-tagfp635、plko-puro-iptg-1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。

本发明通过检测zeb2基因的表达情况针对胰腺癌治疗患者进行预后，具有较好的预测效果，为后期进一步的治疗提供初步的指导。同时本发明提供了一种阻断zeb2基因表达的sirna，具有较好的抑制zeb2基因表达的效果。本发明具有较好的抑制效果以及应用前景。

附图说明

图1为qrt-pcr对比正常胰腺组织，胰腺炎，胰腺肿瘤组织和胰腺肿瘤干细胞中zeb2的表达水平变化对比图。

图2为胰腺癌病人的zeb2表达水平及预后关系图。

图3为sirna干扰zeb2基因表达效果图。

具体实施方式

实施例1检测zeb2在胰腺癌细胞，胰腺肺转移瘤细胞和正常胰腺细胞中表达水平

临床标本入选标准：接受外科手术切除病例，术后病理诊断为胰腺导管腺癌；穿刺活检术获得完整组织学标本，病理诊断为胰腺导管腺癌。参与本研宄的患者手术或活检前均未接受化、放疗以及免疫治疗，患者签署了知情同意书，并经过伦理委员会审核。

方法：获取术后和活检正常胰腺组织，胰腺肿瘤组织。抽提rna后进行qrt-pcr，qrt-pcr操作步骤为本领域常规的操作方法，所需的引物分别为：zeb2上游引物：5’-agccaaggaatgctaccaa-3’、下游引物：5’-ggccccagagcatcataatc-3’；β-actin上游引物：5’-cagctgagagggaaatcgtg-3’、下游引物：5’-cgttgccaatagtgatgacc-3’。

zeb2上游引物：5’-caagaggcgcaaacaagcc-3’

下游引物：5’-ggttggcaataccgtcatcc-3’

β-actin上游引物：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’、

下游引物：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’。

qrt-pcr对比正常胰腺组织、胰腺肿瘤组织和胰腺肺转移瘤细胞中zeb2的表达水平变化。

结果：如图1所示，定量pcr数据发现zeb2的表达水平在正常胰腺组织中较低，相对正常组织，胰腺癌组织中升高接近9倍，在胰腺癌肺转移组织中升高近9.5倍。定量pcr每组分析8例标本，β-actin作为内参指示检测准确，符合要求。

免疫组织化学染色采用美国dako公司envision^tm二步法检测系统检测zeb2蛋白表达。根据本领域常用的irs进行标本的阳性细胞百分率统计。应用irs可兼顾染色强度和阳性细胞百分率。

如表1所示，免疫组化检查发现正常胰腺组织只有2.9％为zeb2阳性，胰腺癌组织为86.9％，胰腺癌肺转移组织为90.5％(表1)。免疫组化检查每组为10例标本。

从以上结果可以看出，zeb2定量pcr和免疫组化检查可用来诊断胰腺癌。

实施例2检测zeb2在胰腺肿瘤细胞阳性水平和预后的关系

选择具有完整随访记录30例胰腺癌病人，获取病理切片进行zeb2免疫组化检查，免疫组化操作步骤如上。所选患者均术后只进行常规吉西他滨化疗，无其他治疗记录。30例胰腺癌病人的zeb2免疫组化检查分为三组(强阳性为3.5，阳性为2.5，弱阳性为1.5)，每组10例，进行预后跟踪，跟踪病人的生存时间。

结果：如图2所示，预后跟踪数据表明胰腺肿瘤细胞阳性水平和预后生存期呈反比关系，强阳性患者预后差，生存期短，而弱阳性患者预后较好，生存期较长。结论，zeb2免疫组化检查水平可用来预测预后，并可作为预测治疗效果的指标。

实施例3zeb2干扰对于肿瘤的影响

1、人zeb2基因rnai慢病毒的制备

(1).筛选针对人zeb2基因的有效的sirna靶点

从genbank调取人zeb2(bc127102)基因信息；利用dnaman设计针对zeb2基因的有效的sirna靶点。在zeb2基因的编码序列(cds)区域内，设计了2条针对zeb2基因的有效sirna靶点序列。分别为：zeb2-1：cccagaagcccctgaggagctg；zeb2-2：tactgcaagcgggaggcggagg。

针对sirna靶点合成两端含agei和ecori酶切位点粘端的双链dnaoligo序列；以agei和ecori限制性内切酶作用于pgcsil-gfp载体，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。并构建含有zeb2-1或zeb2-2的rnai载体，命名为pgcsil-gfp-zeb2-1-shrna以及pgcsil-gfp-zeb2-2-shrna，同时还按照本领域常规的试验方法构建pgcsil-gfp-control阴性对照质粒。同时将所述载体导入到慢病毒中备用。

2、实时荧光定量rt-pcr法检测zeb2基因的沉默效率

处于对数生长期的人胰腺癌panc-1细胞和正常人口腔上皮细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为6.0×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40％。根据侵染复数(panc-1的moi为20)值，加入适宜量的的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据invitrogen公司的trizol操作说明书，抽提总rna。根据promega公司的m-mlv操作说明书，将rna逆转录获得cdna(逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。

采用abi7500型realtimepcr仪(life)进行实时定量检测。基因的引物如上述实施例所述。实验结果(图3)表明，实验组中人胰腺癌panc-1细胞的zeb2mrna表达水平分别下降了99.3％和99.5％，具有较好的抑制表达效果。

3、检测侵染zeb2-shrna慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

将上述实验2制备的细胞，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％co2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用cellomics仪器(thermofisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整cellomicsarrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线。结果表明，二个zeb2shrna慢病毒侵染的人胰腺癌panc-1细胞在体外培养5天后，活力细胞数目分别下降了88.9％和86.4％，表明zeb2基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

上面通过具体实施例详细说明本发明。本领域技术人员应清楚，本发明并不限于此处所列出的实施例，其保护范围由所附权利要求书限定，下面的实施例仅仅是以示例的方式说明本发明，以使本发明更易于理解。

序列表

〈110〉申请人

〈120〉zeb2基因表达变异在胰腺癌化疗预后诊断中的应用

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2-1sirna

cccagaagcccctgaggagctg

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2-2sirna

tactgcaagcgggaggcggagg

〈210〉3

〈211〉19

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2上游引物

5’-agccaaggaatgctaccaa-3’

〈210〉4

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2下游引物

5’-ggccccagagcatcataatc-3’

〈210〉5

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin上游引物

5’-cagctgagagggaaatcgtg-3’

〈210〉6

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin下游引物

5’-cgttgccaatagtgatgacc-3’。