用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合及试剂盒的制作方法

本发明属于疾病诊断领域，具体涉及一种用于检测和鉴定多种人组织包虫病病原的引物对组合及其试剂盒。

背景技术：

包虫病(hydatidosis)是棘球蚴病(echinococcosis)的俗称，是由棘球绦虫的幼虫寄生于人体内而引起的人兽共患寄生虫病。以往全球发现的棘球绦虫属共分为6个种，即细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)、多房棘球绦虫(echinococcusmultilocularis)、福氏棘球绦虫(echinococcusvogeli)、少节棘球绦虫(echinococcusoligarthus)、echinococcusfelids和石渠棘球绦虫(echinococcusshiquicus)，其中细粒棘球绦虫(e.granulosus)按基因型分为10个基因型，即细粒棘球绦虫g1-g10型。随着分子生物学技术在棘球绦虫研究中的应用和发展，人们根据系统进化树分析获得的结果，又将原来的细粒棘球绦虫(e.granulosus)的10个基因型划分为4个新的虫种，它们分别为e.granulosussensustricto(g1-g3型),e.equinus(g4)，e.ortleppi(g5)和e.canadensis(g6–g10)。包虫病广泛流行于世界各地，近20年来发病有增高趋势。我国是全球包虫病流行最为严重的国家，高发区占全国总面积的44％，受威胁人口逾500万。

据现有文献报道，我国目前发现的可引起人体感染的包虫病病原有三种，其中，细粒棘球绦虫g1-g3型和多房棘球绦虫的流行占主要地位，细粒棘球绦虫g6-g10型在各地呈现散发状态，但其感染风险也不容忽视。不同种的棘球绦虫的成虫及其幼虫在形态、生物学特征、致病性方面均存在差异。其中，细粒棘球绦虫g1-g3型和细粒棘球绦虫g6-g10型的幼虫可引起人的囊型包虫病，多房棘球绦虫的幼虫可引起人的泡型包虫病。囊型包虫病可发生在全身多个脏器，以肝、肺最为多见，泡型包虫病原发病灶几乎都位于肝脏。检测和鉴定包虫病病原的种类对流行病学研究、疾病的预防控制和治疗都具有重要的意义。

目前，已有pcr检测方法通过特异性扩增微创/手术病人病灶组织中的靶dna序列，以确认是否感染包虫病，以及确认感染的包虫病病原种类。现有pcr检测方法主要有单重pcr方法和多重pcr方法。dinkela等(apcrsystemforidentificationofechinococcusspeciesandgenotypes,withreferencetotheepidemiologicalsituationineasternafrica[j].2004:48-48.)建立了检测细粒棘球绦虫的pcr检测方法；boufanab等(developmentofthreepcrassaysforthedifferentiationbetweenechinococcusshiquicus,e.granulosus(g1genotype),ande.multilocularisdnaintheco-endemicregionofqinghai-tibetplateau,china[j].americanjournaloftropicalmedicine&hygiene,2013,88(4):795-802)建立了检测细粒棘球绦虫g1型、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫的3种单重pcr方法；canh等(detectionofechinococcusgranulosusandechinococcusmultilocularisincystsamplesusinganovelsingletubemultiplexreal-timepolymerasechainreaction.[j].mikrobiyolojibulteni,2016,50(2):266.)建立了同时检测多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫的实时荧光多重pcr方法；congnuanliu等人(discriminationbetweene.granulosussensustricto,e.multilocularisande.shiquicususingamultiplexpcrassay.[j].plosneglectedtropicaldiseases,2015,9(9):e0004084.)和娄忠子等人(专利cn201310102181.4)建立了同时检测细粒棘球绦虫g1-g3型、石渠棘球绦虫和多房棘球绦虫的多重pcr方法，其中石渠棘球绦虫目前还未发现人体感染，其感染宿主主要为小型哺乳类动物和犬科动物。

上述方法中，单重pcr方法一个反应体系只能检测一种病原，检测程序繁琐，费时费力，不利于大规模样本的快速检测。多重pcr方法在同一体系、同一反应条件下可对两个或两个以上的不同靶基因进行同步检测，即一个反应体系可同时检测多种病原，大大提高了方法的效率。但是，现有的多重pcr方法一方面并非完全针对我国发现的三种人包虫病病原(细粒棘球绦虫g1-g3型e.granulosussensustricto、多房棘球绦虫e.multilocularis和细粒棘球绦虫g6–g10型e.canadensis)而设计，不能满足检测和鉴定人体包虫病病原的需求；另一方面，多重pcr的引物设计难度远远大于单重pcr，因其一个体系中加入了多对引物，易与亲缘关系较近的病原发生交叉反应，出现假阳性结果，并且引物对间也易发生互补结合、易产生干扰反应，因此，现有的包虫病多重pcr方法存在特异性较差、方法不可靠等问题。

因此，本发明针对我国人体感染的细粒棘球绦虫g1-g3型(e.granulosussensustricto)、多房棘球绦虫(e.multilocularis)和细粒棘球绦虫g6-g10型(e.canadensis)三种病原的线粒体基因保守区域设计特异性引物，构建了一种能同步检测多种包虫病病原的多重pcr方法。该方法特异性强、灵敏度高，并且具有高通量、简便、快速的优势，能显著提高工作效率，减少时间、经济成本，在微创或手术的包虫病病人的进一步鉴定分型和包虫病病人分子流行病学调查领域具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种能同时用于检测和鉴定多种人组织包虫病病原的引物对组合，该引物对组合在同一体系内、同一条件下进行多重pcr扩增时不相互干扰，特异性强、灵敏度高，针对我国人体感染的三种病原(细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型，以下也简称为三种目的棘球绦虫)而设计。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒含有能同时用于检测和鉴定多种人组织包虫病病原的引物对组合。

本发明的第三个目的在于提供上述试剂盒的使用方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合，所述引物对组合包括：

细粒棘球绦虫g1-g3型特异性引物对：gtp1f如序列表seqidno.1所示，gtp1r如序列表seqidno.2所示；

多房棘球绦虫特异性引物对：mtb42f如序列表seqidno.3所示，mtb42r如序列表seqidno.4所示；

细粒棘球绦虫g6–g10型特异性引物对：cox1f如序列表seqidno.5所示；cox1r如序列表seqidno.6所示。

进一步地，上述用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合扩增出的目的片段长度依次为240bp，152bp和441bp。

一种试剂盒，含有上述用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合。

进一步地，上述试剂盒还含有dna扩增的pcr试剂。

更进一步地，上述试剂盒中所述pcr试剂包括dna聚合酶混合物和无菌双蒸水。

以上所述试剂盒的使用方法，包括：提取待检人活检组织dna，并以此为模板加入所述试剂盒中的试剂进行pcr扩增，扩增的pcr产物点样至2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察电泳结果。

进一步地，上述试剂盒的使用方法，所述pcr扩增的条件为94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s；共35个循环；72℃延伸5min。

引物的设计和筛选是多重pcr方法的关键，引物的特异性和灵敏度直接决定了整个方法的特异性和灵敏度。多重pcr的引物设计难度远远大于单重pcr，因其一个体系中加入了多对引物，易与亲缘关系较近的病原发生交叉反应，出现假阳性结果，并且引物对间也易发生互补结合、易产生干扰反应。另外，多重pcr方法要求扩增产物长度必须存在一定差异，能够通过电泳将条带进行区分，这一限制条件也增大了引物设计的难度。本发明的三对引物间互不干扰，特异性强，与8种亲缘关系较近的绦虫均不发生交叉反应，或交叉反应产生条带大小不同于目的条带，不干扰结果判读。灵敏度高，对三种病原dna的检出限均高于0.005ng/μl。利用该特异性引物按照本发明的方法对样品进行多重pcr检测，可实现在我国人体感染的细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型3种病原的同步检测，与以往检测方法相比大大节省检测成本和时间，提高检测效率和准确性，在包虫病病人特别是疑似病例的分型鉴定和包虫病分子流行病学研究领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1特异性实验1的pcr扩增产物电泳图；

图2为实施例1特异性实验2的pcr扩增产物电泳图；

图3为实施例1特异性实验3的pcr扩增产物电泳图；

图4为实施例2的灵敏度实验结果；

图5为实施例3中10例待检病人手术切除组织dna分别同3对混合引物反应的多重pcr检测结果；

图6为对比实施例实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明内容对实施例加以替换/组合，而这些都应属于本发明所要保护的范围。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如sambrook等著的分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)，实验动物常规手册(国家实验动物规范中心,2004年11月)：基本技术指南第五版(johnwiley&sons，inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。实施例中材料和试剂，未特殊说明的，均可通过常规方法经商业途径获得。

实验方法

本发明引物对：

细粒棘球绦虫g1-g3型特异性引物，

上游引物gtp1f：tggtttggtttatatgttggtgttt；

下游引物gtp1r：atccataaaggagttcctagcg

多房棘球绦虫特异性引物，

上游引物mtb42f：accaactgagggtggcacta；

下游引物mtb42r：ccattactaccctaaacaactgaca

细粒棘球绦虫g6–g10型特异性引物，

上游引物cox1f：ttttatttacgtttgggggcg；

下游引物cox1r：ccaccaaaccaaaagacctg

标准dna模板：

分别提取三种目的棘球绦虫和亲缘关系较近的其他绦虫的dna

细粒棘球绦虫g1-g3型(e.granulosussensustricto)、多房棘球绦虫(e.multilocularis)、细粒棘球绦虫g6–g10型(e.canadensis)、石渠棘球绦虫(e.shiquicus)、泡状带绦虫(t.hydatigena)、巨颈绦虫(t.taeniaformis)、亚洲带绦虫(t.asiatica)、牛带绦虫(t.saginata)、猪带绦虫(t.solium)、长膜壳绦虫(h.diminuta)和锯齿状绦虫(t.serialis)，根据dna提取试剂盒操作说明进行全基因组dna提取，对提取的dna进行pcr检测并测序，将序列同ncbi基因库中的相应序列进行比对，确定种别后的dna样本即为dna模板标准物，待用。

待测病人dna：

选取待测病人囊肿生发层组织或囊液15～25mg，剪碎后采用组织dna提取试剂盒按照说明书提取全基因组dna。

pcr扩增体系和条件及结果观察：

在pcr反应管内配制pcr反应液，采用50ul反应体系。包括：25uldna聚合酶混合物，浓度大于50ng/ul的dna模板5ul(特异性实验用该浓度，待测样本检测并不限于此)，特异性引物各1.5ul(10um)，双蒸水补足50ul。

将pcr反应管放入pcr仪中进行反应，热循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s；共35个循环；72℃延伸5min，反应完成后4℃保存。pcr反应产物在2％的琼脂糖凝胶中(含0.5μg/mlgoldenview)进行电泳，电压80-110v，经紫外凝胶成像仪观察结果。

根据有无电泳条带以及电泳条带大小确定是否感染包虫病，以及感染的虫种类型。

实施例1特异性实验

共设计3组实验考察本发明的技术检测和鉴定包虫病病原的特异性，3组实验分别为：

1、本发明的3对混合引物分别对三种目的棘球绦虫的dna模板进行扩增的特异性实验；

2、本发明的3对混合引物对三种目的棘球绦虫的dna混合模板进行扩增的特异性实验；

3、本发明的3对混合引物分别对三种目的棘球绦虫和其他8种亲缘关系较近的绦虫dna模板进行扩增的特异性实验。

具体操作如前述实验方法所述，电泳结果参见图1～3。

图1中：1，2，3泳道为三种混合引物分别扩增细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型dna模板的pcr结果；4泳道为阴性对照；m为dna分子量标准markerii。

图2中：1泳道为三种混合引物扩增细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型混合dna模板的pcr结果；2泳道为阴性对照；m为dna分子量标准markerii。

图3中：1-3泳道为混合引物分别扩增目的虫种细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型的pcr结果；4-11泳道为扩增石渠棘球绦虫、泡状带绦虫、巨颈绦虫、亚洲带绦虫、牛带绦虫、猪带绦虫、长膜壳绦虫和锯齿状绦虫的pcr结果；m为dna分子量标准markerii。

根据实验结果，本发明的3对引物分别扩增出240bp、152bp和441bp的特异性单一目的条带，依次对应细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫g6–g10型，扩增片段大小与预期一致，说明本方法能够特异性地检测出三种目的棘球绦虫；三对引物混合后不会相互干扰，能且只能扩增出对应虫种的目的条带；而且本发明只能检测出对应的三种目的虫种，与其他亲缘关系较近的8种虫种无交叉反应，或者交叉反应形成的条带大小为非目的条带不影响检测结果的判定，因此具有很强的特异性。

实施例2灵敏度实验

分别以三种目的棘球绦虫dna为模板，模板终浓度分别为：0.7ng/μl，0.35ng/μl，0.18ng/μl，0.09ng/μl，0.04ng/μl，0.02ng/μl，0.01ng/μl，0.005ng/μl，按照前述实验方法进行扩增。

电泳结果如图4所示，1-8泳道的模板为细粒棘球绦虫g1-g3型，9-16泳道的模板为多房棘球绦虫，17-24泳道的模板为细粒棘球绦虫g6–g10型。反应体系中模板终浓度分别为0.7ng/μl，0.35ng/μl，0.18ng/μl，0.09ng/μl，0.04ng/μl，0.02ng/μl，0.01ng/μl，0.005ng/μl。本发明对三种目的虫种dna的检出限均高于0.005ng/μl，说明本发明具有很高的灵敏度。

实施例3对人体病灶组织样本检测的应用

选取10例手术病人送检肝脏病灶组织进行棘球绦虫感染检测。待测病人dna提取和多重pcr扩增按照前述实验方法进行。

细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫g6-g10型的扩增条带大小分别为240bp、152bp和441bp，电泳结果如图5所示，其中：1-10泳道为样品pcr结果；11泳道为阳性对照，即3种目的虫种混合dna模板和3对混合引物的pcr扩增结果；12泳道为阴性对照；m为dna分子量标准markerii。

1、3、7、10泳道条带为240bp，故对应病人为细粒棘球绦虫g1-g3型感染阳性；2、4、5、9泳道条带为152bp，故对应病人为多房棘球绦虫感染阳性；8泳道条带为441bp，故该病人为细粒棘球绦虫g6-g10型感染阳性；6泳道没有条带为阴性，故该病人非包虫病感染。

对比实施例

将本发明的多重pcr检测方法分别与对比1：cong-nuanliu等人(liucn,louzz,lil,etal.discriminationbetweene.granulosussensustricto,e.multilocularisande.shiquicususingamultiplexpcrassay[j].plosneglectedtropicaldiseases,2015,9(9):e0004084.)和对比2：专利cn201310102181.4发表的针对细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫多重pcr检测方法进行比较。

本发明的dna模板分别采用细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫g6-g10型和三种目的虫种dna混合物；操作按照前述实验方法。

对比1和对比2均分别采用细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫和该三种虫种dna混合物；操作按照各自文献方法。

电泳结果如图6所示，其中，1-4泳道为本发明的方法分别扩增目的虫种细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫g6–g10型和三种目的虫种混合dna的pcr结果，5-8泳道为对比1方法分别扩增细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫和三种虫种混合dna的pcr结果，9-12泳道为对比2方法分别扩增细粒棘球绦虫g1-g3型、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫和三种虫种混合dna的pcr结果。

可见，本发明可分别检测每一个目的虫种，也可同时检测三个虫种混合感染。对比1的方法不能检测出多房棘球绦虫，8泳道并未出现预期的三条目的条带，仅出现两条条带，条带大小分别为219bp和471bp，为细粒棘球绦虫g1-g3型和石渠棘球绦虫，说明该方法不能同时检测三种虫种混合感染。对比2的方法中，特异性扩增条带大小分别为196bp，584bp和471bp，10泳道出现3条条带，其中一条大于500bp，另外两条与细粒棘球绦虫g1-g3型和石渠棘球绦虫的目的条带接近，但并未如预期一样出现584bp的单一目的条带，说明该方法检测多房棘球绦虫的特异性差，并且会干扰细粒棘球绦虫g1-g3型和石渠棘球绦虫的检测。12泳道只出现两条目的条带，说明该方法不能实现三种虫种的混合感染检测。

综上所述，本发明仅通过一次反应，即可以检测三种目的虫种的单独感染，也可以检测三种虫种的混合感染，目的虫种间无交叉反应，条带分离效果好，检测效果优于现有的包虫病多重pcr方法，克服了现有技术无法同时对我国人体感染的三种包虫病虫种进行检测和鉴定的缺陷。

sequencelisting

<110>四川省疾病预防控制中心

<120>用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合及试剂盒

<130>201705

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列（gtp1f）

<220>

<221>细粒棘球绦虫g1-g3型上游引物

<222>(1)..(25)

<400>1

tggtttggtttatatgttggtgttt25

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列（gtp1r）

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<222>(1)..(22)

<400>2

atccataaaggagttcctagcg22

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列（mtb42f）

<220>

<221>多房棘球绦虫上游引物

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accaactgagggtggcacta20

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<212>dna

<213>人工序列（mtb42r）

<220>

<221>多房棘球绦虫下游引物

<222>(1)..(25)

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ccattactaccctaaacaactgaca25

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ttttatttacgtttgggggcg21

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<212>dna

<213>人工序列（cox1r）

<220>

<221>细粒棘球绦虫g6-g10型下游引物

<222>(1)..(20)

<400>6

ccaccaaaccaaaagacctg20